L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un multi-funzionale dell'epitelio dell'occhio. Qui presentiamo un protocollo standard per stabilire colture cellulari primarie derivate da RPE murino.
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Articolo metodologico
Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un epitelio altamente polarizzato multi-funzionale che si trova tra la retina neurale e la coroide dell'occhio. È un singolo foglio di cellule pigmentate che sono hexagonally pranzo e collegate da giunzioni strette. Le funzioni principali del RPE comprendono l'assorbimento della luce, fagocitosi dei segmenti esterni del fotoricettore di capannone, buffering spaziale degli ioni, trasporto di nutrienti, ioni e acqua, nonché al coinvolgimento attivo nel ciclo di visual. Con tali funzioni importanti e diversità, è criticamente importante studiare la biologia delle cellule RPE. Un numero di linee di cellule RPE è stato stabilito; Tuttavia, cellule immortalizzate e secondarie sono noti per perdere rapidamente alcune delle caratteristiche morfologiche e fisiologiche delle cellule RPE naturali. Così, le cellule primarie sono più adatte per lo studio di diversi aspetti della biologia delle cellule RPE e funzione. Coltura di cellule RPE primario del mouse è molto utile ai ricercatori poiché modelli murini sono ampiamente utilizzati in studi biologici, tuttavia raccogliendo RPE cellule di topo è anche molto impegnativo a causa del loro di piccola dimensione. Qui, presentiamo un protocollo per stabilire colture di cellule RPE mouse primario che comprende enucleazione e dissezione degli occhi e l'isolamento dei fogli RPE per produrre le cellule per la coltura. Questo metodo consente un recupero efficiente delle cellule. Le cellule RPE ottenute da due topi possono raggiungere confluency su un inserto di membrana in poliestere 12 mm pre-caricato nella piastra di coltura dopo una settimana di cultura e visualizzare alcune delle proprietà originali di buona fede RPE cellule quale forma esagonale e la pigmentazione dopo due settimane della cultura.
Introduzione
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un singolo strato di cellule epiteliali polarizzate che si trova tra la retina neurale e la coroide dell'occhio. La funzionalità delle cellule RPE e l'integrità dello strato monomolecolare del RPE sono fondamentali per la visione perché RPE svolge un ruolo importante in più processi come mantenere la barriera emato-retinica esterna, trasporto di acqua e ioni tra la retina e la assorbimento di coroidico, luce, protezione da stress ossidativo, controllo del metabolismo di retinoide e fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori1,2. La posizione del RPE nella parte posteriore dell'occhio, come pure la sua funzione di barriera evitando farmaci somministrati per via sistemica dal passare dal sangue all'umor vitreo, rendono difficile studiare la complessità del RPE funzione in vivo. Così, c'è un grande bisogno per la creazione di colture di cellule RPE per studiare le cellule RPE in un ambiente flessibile e controllato3,4.
Esiste un numero di linee di cellule RPE stabiliti, fornendo un modo facile e conveniente di ottenere e di conservazione delle cellule; Tuttavia, le cellule secondarie hanno alcuni svantaggi rispetto a cellule primarie2,3,4. In primo luogo, sono spesso caratterizzati da cambiamenti nella morfologia delle cellule. Ad esempio, nessuno delle linee cellulari esistenti sono stati trovati per essere adatto per uno studio affidabile delle proprietà barriera RPE a causa della perdita del fenotipo di polarità delle cellule e parziale scomparsa di giunzioni strette4. Oltre alla perdita della polarità e collegamenti adeguati cellula--cellula, le linee di cellule RPE perdono rapidamente la loro pigmentazione a causa dell'assenza degli enzimi chiave melanogenesis in adulto RPE5. La pigmentazione può essere ripristinata, ma l'analisi completa del meccanismo di ri-pigmentazione che dovrebbe includere una combinazione di microscopia elettronica di trasmissione, saggi di espressione genica in analisi e chimica per confermare la presenza di melanina non ha mai stata eseguita6. Una limitazione di più è che le linee di cellule RPE hanno vita estesa delle cellule (a volte - immortalità) e in determinate condizioni possono trasformare in autorinnovabile cellule staminali multipotenti che si staccano dal substrato e modulo mobile colonie7, 8. questa limitazione rende impossibile utilizzare linee cellulari per esperimenti di trapianto3.
Considerando gli svantaggi delle varietà di cellula stabilita RPE, colture primarie di cellule RPE ottenuti da tessuti freschi potrebbero servire come un modello più biologicamente rilevante per lo studio di RPE. Cellule primarie di RPE sono state utilizzate non solo per studiare funzioni RPE-specifiche come la vitamina A metabolismo9, fagocitosi del fotorecettore segmenti esterni10 e ione trasporto11, ma anche di studiare biologia cellulare base come epiteliale cella polarità2 , omeostasi lisosomiale e autofagia12,13.
Nell'ultimo paio di anni ci sono stati una serie di pubblicazioni sull'istituzione di colture primarie di RPE, che indica un crescente interesse in quest'area di ricerca3,14,15. Numerosi protocolli per cellule RPE umane e cellule RPE non umani quali le cellule RPE di bovini e suine sono stati pubblicati16,17,18,19. Tuttavia, è più difficile da gestire di cellule RPE topo a causa delle loro dimensioni molto più piccole. Anche se un certo numero di pubblicazioni hanno descritto protocolli per isolare le cellule RPE dal mouse14,20,21, ci sono ancora molti ricercatori lottando per isolare le cellule RPE senza contaminazione di cellule coroide o cellule da detriti di retina neurale. Qui presentiamo il protocollo per l'istituzione del mouse primario coltura delle cellule RPE, incluso l'ottenere gli occhi dal mouse, la dissezione degli occhi e l'isolamento dei fogli RPE per produrre le cellule per la coltura. Questo video protocollo sarebbe particolarmente utile per i ricercatori che stanno iniziando a lavorare con colture primarie di RPE mouse e bisogno di una guida sulle tecniche di dissezione.
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Protocollo
Procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) all'Università di Pittsburgh
1. preparare soluzioni
- Preparare il medium di crescita di complemento Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), alto glucosio con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina/streptomicina, 2,5 mM L-Glutammina e aminoacidi 1 x MEM non essenziali. Pre-riscaldare i media in incubatore a 37 ° C prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di lavoro di 2% (wt/vol) dispase II:
- Preparare una soluzione stock di dispase 100mg/mL II sciogliendo 30 mg di dispase II in soluzione di 300 µ l tampone HEPES (50 mM HEPES/KOH a pH 7.4, 150 mM NaCl). Questo volume è per 3-4 topi, può essere scalato o giù basato sul numero di topi per l'esperimento). Questo stock possa essere conservato per almeno 1 settimana a 4 ° C.
- Preparare la soluzione di lavoro di 2% dispase aggiungendo 300 µ l di 100 mg/mL brodo di II di dispase a 1,2 mL di DMEM sterile, alto glucosio e filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 µm. Questo passaggio deve essere eseguito nel flusso laminare mobile in condizioni sterili. Pre-riscaldare il preparato dispase II in incubatore a 37 ° C prima dell'uso.
2. come ottenere gli occhi di topo
- Eutanasia il mouse utilizzando qualsiasi metodo approvato e posizionarlo su un tampone assorbente.
- Indossando guanti, mettere il pollice e l'indice intorno all'occhio e spingere delicatamente la pelle per proptose il bulbo oculare.
- Inserire la punta delle forbici angolate tra la pelle e il bulbo oculare e tagliare con l'occhio. Per evitare contaminazioni, immergere brevemente l'occhio in etanolo al 70%.
- Posizionare immediatamente l'occhio nel tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri.
- Ripetere i passaggi da 2.2-2.4 per rimuovere il secondo occhio.
3. dissezione di occhio
- Rimuovere attentamente l'occhio al microscopio per dissezione del tessuto connettivo. Questo può essere fatto in PBS o sul piatto Petri asciutto.
- Utilizzare sutura forcipe per sollevare il tessuto connettivo dal bulbo oculare e tagliarli fuori usando le forbici Allerød. Non tagliare la sclera perché è praticamente impossibile ottenere dei paraocchi posteriori intatti se la sclera è tagliata.
- Dopo la pulizia del tessuto connettivo, mantenere i bulbi oculari risultanti in PBS per la successiva fase di lavaggio.
Nota: Tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguiti nel flusso laminare in condizioni sterili.
- Lavare gli occhi due volte in pre-riscaldato 37 ° C DMEM (alto glucosio). Trasferire con cautela i bulbi oculari nel pre-riscaldato a 37 ° C DMEM (alto glucosio) usando il forcipe. Aspirare i bulbi oculari medium e trasferimento a mezzo fresco in un piatto nuovo.
- Aspirare il medio DMEM (alto glucosio) e incubare gli occhi nella soluzione preriscaldata 2% (wt/vol) dispase II lavoro per 45 min nell'incubatore 37 ° C.
Nota: In tutti i passaggi seguenti, inserire e manipolare gli occhi o oculari nel mezzo di crescita, che proteggono il tessuto e fornirà un buon mezzo per la dissezione. - Rimuovere la soluzione II dispase e lavare gli occhi due volte in crescita medio aspirando il vecchio mezzo e aggiungendo il nuovo mezzo di crescita pre-riscaldato 37 ° C (Figura 1a).
Nota: Dopo la dissociazione di dispase II, i bulbi oculari diventano molli. - Tenere l'occhio con il forcipe e fare un'incisione intorno l'ora serrata di ogni occhio usando le forbici di Allerød sotto il microscopio per dissezione nel flusso laminare pensile.
- Mantenendo il bulbo oculare nella soluzione, rimuovere con cautela la cornea anteriore estendendo il taglio lungo la circonferenza di ora serrata e allontanando la cornea anteriore dopo il taglio è stato completo.
- Rimuovere la capsula di obiettivo e l'epitelio pigmentato associati di iride delicatamente tirando fuori l'oculare con una pinza dentata (Figura 1b, 1C).
- Incubare i paraocchi posteriori risultanti nel terreno di crescita per 20 min a 37 ° C per facilitare la separazione della retina neurale da RPE.
- Tagliare i paraocchi posteriori a 4 petali sotto il microscopio per dissezione nel flusso laminare pensile. I tagli dovrebbero essere abbastanza a lungo per appiattire il paraocchi, ma abbastanza breve per mantenere i petali collegati (Figura 1D).
- Appiattire il paraocchi e rimuovere la retina neurale tirandola molto delicatamente con il forcipe tenendo il restante complesso RPE-coroide-sclera con un'altra pinza (Figura 1e). Inizia a tirare dai bordi piuttosto che dal centro.
- Trasferire tutti i tessuti quarti in una nuova piastra di coltura sterile riempita con il mezzo di crescita pre-riscaldato 37 ° C.
4. isolamento di cellule RPE primarie
- La holding un petalo del complesso RPE-coroide-sclera squartato con super fine forcipe, staccare delicatamente i fogli intatti di RPE da sottostante membrana basale (membrana di Bruch) utilizzando un coltello mezzaluna microsurgical sotto il microscopio per dissezione inserito nel flusso laminare mobile (Figura 1f).
- Trasferire i fogli RPE nella nuova piastra di coltura sterile contenente terreno di coltura utilizzando una micropipetta P200. Quando si trasferiscono fogli RPE, bagnato le punte di pipetta con crescita medio pipettando diverse volte per impedire attaccare all'interno della punta di tessuto. RPE sarà chiaramente distinguibile dalla coroide: RPE sembra più brunastro, mentre coroide è più scuro e sembra appiccicoso e soffici.
- In alternativa, utilizzare digestione enzimatica e dissociazione dolce senza pinze per staccare il RPE dalla coroide14.
- Lavare le lenzuola RPE 2 - 3 volte usando pre-riscaldato 37 ° C medio di crescita nella piastra di coltura sterile. Dopo ogni lavaggio, raccogliere con cura i fogli RPE, evitando altri tessuti quali i detriti retina e coroide. Alla fine dell'ultimo lavaggio raccogliere i fogli RPE con una micropipetta P200 e inserirli in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
Nota: Non esiste nessuna necessità di centrifugare i fogli RPE: lo faranno sedimento per gravità all'interno di 1 min. - Rimuovere il mezzo di crescita supplementare utilizzando una micropipetta P200. Risospendere le cellule in coltura pre-riscaldato fresco e delicatamente triturare mediante una micropipetta P200. Evitare la formazione di bolle. Una sospensione unicellulare è ideale, ma anche evitare troppo triturazione, altrimenti le cellule RPE non sono in grado di sopravvivere. Molto delicatamente si consiglia di triturazione per 40 - 50 volte.
5. coltura delle cellule RPE
- Piastra le cellule su una piastra di coltura.
- Se le applicazioni a valle delle cellule RPE richiedono il fissaggio della loro polarità, piastra RPE celle 2 topi in un inserto di membrana in poliestere 12 mm pre-caricati in piastre di coltura 12-pozzetti. Le cellule ad alta densità di placcatura è voluta perché in tal caso le cellule RPE sono in grado di mantenere le proprietà originali, quale forma esagonale e la pigmentazione.
- Non spostare la piastra o cambiare il mezzo di crescita per le prime 72 ore di coltura. Dopo 3 giorni, è possibile sostituire il vecchio mezzo con il mezzo di crescita pre-riscaldato fresco. Dopo di che cambiare il terreno di coltura ogni altro giorno. Una volta che le cellule RPE confluenza, ridurre i FB nel mezzo di crescita al 2%.
Nota: Le celle possono essere suddiviso utilizzando 0,25% tripsina. Tuttavia, dopo aver diviso le cellule possono perdono la loro forma esagonale e la pigmentazione nei passaggi successivi. Si consiglia di non spaccare le cellule, ma se è richiesta dalle applicazioni a valle della cultura, tenere a mente che le cellule primarie non possono essere attraversate a tempo indeterminato: essi sono noti per-differenziare dopo 5-7 passaggi.
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Risultati
La coltura del mouse primaria RPE stabilita da 2 topi in 12 mm poliestere membrana inserto raggiunge confluency di 90-95% dopo 1 settimana nella cultura. Dopo 2 settimane di cultura, le cellule raggiunto confluency di 100% e ha iniziato a formare un mosaico di cellule esagonali, pigmentate e bi-nucleate. Da 3 settimane di coltura, le cellule hanno continuate a formare la forma e la pigmentazione, tuttavia, dopo 4 settimane una porzione delle cellule ha ottenuto hyperpigmented (
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Discussione
Il protocollo dettagliato presentato consente affidabile istituzione di colture primarie di RPE mouse che raggiungono la confluenza dopo 1 settimana e presentare le principali caratteristiche RPE quale forma esagonale e la pigmentazione dopo 2 settimane. Le cellule RPE ottenute possono essere utilizzate per un certo numero di applicazioni a valle come vitamina A metabolismo9, fagocitosi dei segmenti esterni del fotoricettore10 e ione trasporto11, del...
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Dichiarazioni
DS ha ricevuto finanziamenti da Bayer HealthCare, F. Hoffmann-La Roche, Germania e Svizzera per la ricerca. Gli autori restanti non dichiarano concorrenti interessi finanziari. Questo lavoro è supportato da ricerche per prevenire la cecità (sovvenzioni senza restrizioni per la Wilmer Eye Institute e l'Università di Pittsburgh). Questo lavoro è anche supportato da fondi di Start-up al DS da Oftalmologia, Università di Pittsburgh.
Ringraziamenti
Questo studio è stato parzialmente finanziato dalla Fondazione BrightFocus (ad DS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1X, pH 7,4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutammina (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Alcool etilico | Fisher Scientific | 111000200 | |
| Anticorpo RPE65 | Un regalo dal Dr. Michael Redmond | ||
| Fluoresceina Falloidina | Invitrogen | F432 | |
| Capra anti-Coniglio IgG (H+L), Alexa Farina 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Siero di capra | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Anticorpo policlonale | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Nome | Azienda | Catalogo Numero | Comments |
| strumenti e attrezzature | |||
| Armadio a flusso laminare | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Microscopio da dissezione (stereomicroscopio zoom) | Incubatore | Nikon SMZ1500 | |
| con sterilizzazione ad aria calda | Binder | C150 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5702 | |
| Piastre di Petri | Fisher Scientific | 0875712 | |
| Inserti a membrana in poliestere da 12 mm precaricati in piastre di coltura a 12 pozzetti, dimensione dei pori: 0,4 &; m, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott forbici per tenotomia, lame std, affilate | STEPHENS strumenti | S7-1320 | |
| Castroviejo pinza per sutura 0,12 mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Coltello dritto a mezzaluna | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Pinzette #5, 11 cm, dritto, 0,1x0,06 mm Punte, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Forbici Vannas, 8 cm, 45 gradi Unità filtro per | Standard World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS, 0,22 &; m | SLGL0250S | Millipore | |
| , 5 mL | BD | 309632 | |
| Microscopio da laboratorio invertito Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipetta | Gilson | ||
| Barrier e puntali per pipette non filtrati | Thermo Scientific |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
