Method Article

Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

DOI:

10.3791/57016

⸱

January 29th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 2Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 3Cancer Research Summer Internship Program (CARSIP), Cancer Biology Program, University of Michigan Medical School, 4Department of Biology, University of Puerto Rico-Río Piedras Campus

In This Article

Summary

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Meccanismi epigenetici sono frequentemente alterati nei gliomi. Immunoprecipitazione della cromatina poteva essere utilizzati per studiare le conseguenze delle alterazioni genetiche in glioma risultanti dalle modifiche in modificazioni istoniche che regolano la trascrizione di gene e la struttura della cromatina. Questo protocollo descrive immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.

Abstract

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Modificazioni epigenetiche possono essere coinvolti nello sviluppo e nella progressione del glioma. Cambiamenti nella metilazione e acetilazione dei promotori e regioni regolatorie di oncogeni e soppressori tumorali possono condurre ai cambiamenti nell'espressione genica e svolgono un ruolo importante nella patogenesi dei tumori cerebrali. Immunoprecipitazione della cromatina nativo (ChIP) è una tecnica popolare che permette la rilevazione di modifiche o altre proteine strettamente legate al DNA. Contrariamente a reticolato ChIP, chip nativo, le cellule non sono trattate con formaldeide per collegare covalentemente proteina al DNA. Questo è vantaggioso perché a volte reticolazione può fissare le proteine che solo transitoriamente interagiscono con il DNA e non hanno significato funzionale nella regolazione genica. Inoltre, gli anticorpi vengono generalmente sollevati contro peptidi non fissati. Di conseguenza, specificità dell'anticorpo è aumentata di ChIP nativo. Tuttavia, è importante tenere a mente che è applicabile per studiare gli istoni o altre proteine che legano strettamente al DNA solo ChIP nativo. Questo protocollo descrive l'immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.

Introduction

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Eventi epigenetici sono frequenti nei gliomi e probabilmente svolgono un ruolo importante nella patogenesi del tumore. Infatti, in pediatric glioma di alto grado, mutazioni in geni codificanti varianti istone H3.3 e H3.1 si verificano frequentemente1. Le mutazioni riguardano modifiche istoniche e presentano importanti conseguenze epigenetici2,3. Nell'adolescente adulto dello spettro, ricorrenti mutazioni nel gene della Isocitrato deidrogenasi 1/2 (IDH1/2), una mutazione che inibisce la α-KG dipendente degli istoni e DNA de-methylasaes e le alterazioni genetiche in altri regolatori della....

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.

1. generazione di tumore cerebrale NS e condizioni di coltura.

  1. Preparare mezzo di cellule staminali neurali (NSC) con supplemento per volta Eagle Medium/F12B27 (1x) di Dulbecco, supplemento N2 (1x) e un reagente di antimicrobici. Supplemento media NSC il giorno di utilizzo con fattore di crescita endoteliale ricombinante umano (EGF) e basic-fibroblast growth factor (FGF) ad una concentrazione finale di 20 ng/mL.
  2. Indurre il tumore di cervello in mouse utilizzando il sistema di trasposone Sl....

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Results

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Una rappresentazione schematica del tumore NS generata da un tumore al cervello dove le cellule del tumore di cervello sono Katushka positivo è presentata nella Figura 1. Figura 2 è una rappresentazione schematica della tecnica ChIP intera. Figura 3 Mostra i risultati rappresentativi della cromatina da tumore cerebrale NS digerito con MNase per 12 min, ottenendo una maggioranza di mono, di- e tri-nuc.......

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Discussion

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Il protocollo presentato qui consentirà all'utente di eseguire ChIP nativo su NS derivate da tumori cerebrali geneticamente. A differenza di cross-linking ChIP, questo protocollo è limitato per lo studio delle proteine che associano strettamente con DNA6. Il numero di celle utilizzate possa essere modificato come necessario e il protocollo può essere scalato. Abbiamo usato 1 X 106 cellule per IP, tuttavia, ChIP nativo può essere effettuata anche con appena 4 x 104 cellule

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato da istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) sovvenzioni R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 a m.g.c.; NIH/NINDS concede R01-NS076991, R01-NS082311 e R01-NS096756 al Domaine; NIH/NINDS R01-EB022563; il reparto di neurochirurgia; Di Leah Happy Hearts e Chad Fondazione ma a m.g.c. e Domaine RNA biomedicina Grant F046166 a m.g.c. f.m.m. è supportato da un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. è supportata dal NIH / NIGMS grant 5T34GM007821-37.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bioanalizzatore Agilent 2100 BioanalizzatoreAgilentG2946-90004
AccuSpin Micro 17R, refrigeratoFisher Scientific13-100-676
C57BL/6TaconicB6-fC57BL/6 topo
Cloruro di calcioAldrich22350-6reagente tampone
D-Luciferina, Sale di potassioGoldbioLuckK-1g
Cremagliera magnetica DiaMag1.5DiagenodeB04000003per lavaggi di biglie magnetiche
DiaMag Rotator EUDiagenodeB05000001
rotator DMEM/F-12Gibco11330-057NSC component
Dynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001Dprotein A biglie magnetiche
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10003Dproteina G perline magnetiche
EGFPeproTechAF-100-15preparare 20 μ g/mL di stock in 0,1% BSA e aliquota.
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Reagente tampone SigmaE-4884
Glicole etilenico-bis(β-etere amminoetilico)-Acido N,N,N',N'-tetraacetico) (EGTA)Reagente tampone SigmaE-4378
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612 ReagenteqPCR
Siero fetale bovinoGibco10437028per il congelamento delle cellule
FGFPeproTech100-18bPreparare 20 μ g/mL di stock in 0,1% BSA e aliquota.
ForcipeFine Science Tools11008-13per la dissezione del tumore
Glicerolo, grado MBEMD- Millipore356352
H3K4me3AbcamAb8580
H3K27me3Millipore07-449
HBSSGibco14175-103soluzione salina bilanciata
FlurisoVETone501017anestetico per inalazione
Ivis SpectrumPerkin-Elmer124262sistema di imaging ottico in vivo
HyqtaseHyClonSV3003001terreno di distacco cellulare
Cloruro di litioSigmaL8895reagente tampone
a basso legame MicroprovetteCorning CostarCLS3207a basso legame proteico Provetta per microcentrifuga
Fisher21-402-903provetta per microcentrifuga normale
Nucleasi micrococcicaThermo Fisher Scientific, Affymetrix70196Yogni lotto può differire; acquistare una quantità sufficiente per esperimenti e aliquota.
N2Gibco17502-048Componente NSC
Normale Coniglio IgGMillipore12-372
NormocinInvivogenNOL-36-063agente antimicrobico, utilizzare a 0,1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLreagente tampone
Kimble Kontes Pellet PestleFisher ScientificK749515-0000
Proteasi Inhibitor CocktailSigma-AldrichP8340aliquotare e conservare a -20 °C.
La protinasi KSigma-AldrichP2308produce 10 mg/mL di stock in acqua; aliquotare e conservare a -20 °C.
Kit di purificazione QIAquick PCR Kit di purificazioneDNAQiagen28104
ScalpelFine Science Tools10007-16per la dissezione del tumore
Cloruro di sodioVWR0241-5KGreagente tampone
Sodio desossicolatoSigma-AldrichD670-25GReagente tampone
Sodio Dodecil solfato (SDS)SigmaL-4390reagente tampone
Tris BaseThermo Fisher ScientificBp152-1reagente tampone
Triton X-100Thermo Fisher ScientificBP 151-500polietilenglicole ottilfeniletere
centrifuga standardFisherbrand12-006-901mini centrifuga standard
Microscopio dadissezione fluorescenteOlympusSZX16
Sistema di PCR in tempo reale ViiA 7 con blocco rapido a 96 pozzettiApplied Biosystems4453535
Nanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W
del Mini

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
  2. Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma th....

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