Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

Summary

Abbiamo progettato la proteina del capside del virus di epatite E come una nanoparticella di teranostici (HEVNP). HEVNP auto-assembla in una gabbia icosahedral stabile nella consegna delle mucose. Qui, descriviamo la modifica di HEVNPs per tumore targeting modificando la superficie esposta residui di cisteine, che coniuga ligandi sintetici che legano specificamente le cellule del tumore.

Abstract

Particelle simili al virus (VLPs) sono state usate come nanovettori Visualizza epitopi stranieri e/o consegnare piccole molecole nella rilevazione e nel trattamento di varie malattie. Questa applicazione si basa sulla modificazione genetica, auto-assemblaggio e coniugazione di cisteina per soddisfare l'applicazione targeting tumorale del ricombinante VLP. paragonati genetica coniugazione di chimica, da sola modificazione di peptidi stranieri a VLPs offre un significativo vantaggio, perché permette una varietà di soggetti, quali peptidi sintetici o oligosaccaridi, per essere coniugato alla superficie di VIP in modo modulato e flessibile senza alterazione dell'Assemblea VLP.

Qui, noi dimostrare come utilizzare l'epatite E virus nanoparticelle (HEVNP), una capsula di teranostici modularizzato, come un vettore di consegna multifunzionale. Funzioni di HEVNPs includono tessuto-targeting, imaging e consegna terapeutico. Basato sulla consolidata ricerca strutturale di HEVNP, i residui strutturalmente indipendenti e superficie-esposta sono stati selezionati per la sostituzione di cisteina come siti di coniugazione per gruppi chimici maleimide-collegato tramite legami tiolo-selettivo. Un particolare cisteina-modificato HEVNP (una sostituzione di Cys dell'asparagina a 573 aa (HEVNP - 573C)) è stato coniugato ad un ligando di cellula-specifico di cancro di seno, LXY30 e marcati con vicino infrarosso (NIR) fluorescenza colorante (CY 5.5), rendendo il targeting per tumore HEVNPs come efficace diagnostiche capsule (LXY30-HEVNP-CY 5.5). Simili strategie di ingegneria possono essere impiegate con altri complessi macromolecolari con ben noti strutture atomiche per esplorare potenziali applicazioni in teranostici consegna.

Introduction

Lo sviluppo di vettori di dimensioni nanometriche in consegna terapeutica e diagnostica, conosciuto come nanotheranostics, ha spostato gran parte del campo biomedico lontano da trattamenti generalizzate verso mirati consegna¹. Nanotheranostic mirati consegna integra dimensioni nano vettori (nanoparticelle) con molecole teranostici stabilmente dirigere teranostici molecole di uno specifico tessuto malato o via biochimica^2,3,4 . La nanomedicina è venuto alla ribalta della somministrazione mirata perché in modo ottimale dimensioni nanoparticelle hanno la ....

Protocol

1. HEVNP produzione in cellule di insetto

Nota: Tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguite in una cappa di cultura cellulare. Fare riferimento alla nostra precedente pubblicazione per procedure più dettagliate produzione di HEVNP¹¹.

1. Cellule in insetto Sf9 cella media (Vedi Tabella materiali) alla confluenza di 50-75% in piastre da 6 pozzetti.
2. Utilizzando i reagenti di transfezione delle cellule di insetto secondo i protocolli del produttore, transfect Bacmids contenente HEVNP - 573 C ORF2 in Sf99 cellule per produrre baculovirus ricombinanti. Incubare le cellule transfec....

Results

Simile a HEV-VLP, Cys tutti modificato HEVNPs formata solubile icosahedral capsidi e non ha fatto aggregare in soluzione durante la produzione o purificazione. Prima e dopo coniugazione passo singolo maleimide-biotina, ciascuno della Cys modificato HEVNPs erano indistinguibili da HEV-VLP nella macchia negativa EM (Figura 2). Efficienza di coniugazione di maleimide-biotina di Cys HEVNPs modificate in primo luogo è stato testato con Western blotting attraverso .......

Discussion

A differenza della procedura di ingegneria genetica che richiede tempo, che prende di solito settimane, Qui dimostriamo in due semplici passaggi e le procedure di coniugazione chimica One-Step, che possono essere completate entro 3 giorni, aggiungendo il cancro ligando di targeting e/o fluorescenza della tintura di rilevamento per i siti di Cys/Lys di HEVNPs. La tecnica può essere utilizzata a schermo per la migliore destinazione di legante da un pool di candidati e quindi sfrutta i servizi di sintesi disponibili peptide.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unità di dialisi MINI, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini unità di dialisi
High Five Cells Thermo	Fisher Scientific	B85502	Celle Tn5
Celle SF9	Thermo Fisher Scientific	11496015	Cellule Sf9
Sistema di espressione del baculovirus Bac-to-Bac	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Sistema di espressione del baculovirus
Bac-to-Bac Sistema di espressione del baculovirus	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Sistemi di espressione dei mezzi cellulari di insetto	LLC	96-001-01	insetto terreno cellulare
Cy5.5 NHS estere, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS estere
Zeba Spin Colonne di desalinizzazione, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin colonna di desalinizzazione
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge	Tubes Beckman Coulter, Inc	Dipende dal rotore	provetta per ultracentrifuga
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS gel proteico
Reagente Cellfectin II	Reagente Thermo Fisher Scientific		10362100 trasfezione
EMS Glow Discharger	Microscopia elettronica Science		glow discharger