Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Lingling Xian; Lionel Chia; Dan Georgess; Li Luo; Shuai Shuai; Andrew J. Ewald; Linda M.S. Resar

doi:10.3791/57040

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Articolo metodologico

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

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DOI:

10.3791/57040

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10 maggio 2019

Lingling Xian¹ , Lionel Chia¹^,⁵ , Dan Georgess² , Li Luo¹ , Shuai Shuai¹ , Andrew J. Ewald³^,⁴ , Linda M.S. Resar¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, ³Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁴Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁵Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁶Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Descriviamo istruzioni passo-passo a: 1) ingegnerizzare in modo efficiente gli organoidi intestinali utilizzando nanoparticelle magnetiche per la trasduzione lentile o retrovirale e, 2) generare sezioni congelate da organoidi ingegnerizzati. Questo approccio fornisce un potente strumento per modificare in modo efficiente l'espressione genica negli organoidi per lo studio degli effetti a valle.

Abstract

Le colture organoidi intestinali offrono un'opportunità unica per studiare la biologia delle cellule staminali intestinali e della crittografia in vitro, anche se approcci efficienti per manipolare l'espressione genica negli organoidi hanno fatto progressi limitati in questo campo. Mentre la tecnologia CRISPR/Cas9 consente una precisa modifica del genoma delle cellule per la generazione di organiidi, questa strategia richiede un'ampia selezione e screening per analisi di sequenza, che richiede tempo e denaro. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per una trasduzione virale efficiente degli organoidi intestinali. Questo approccio è rapido e altamente efficiente, riducendo così il tempo e le spese inerenti alla tecnologia CRISPR/Cas9. Presentiamo anche un protocollo per generare sezioni congelate da colture organoidi intatte per ulteriori analisi con colorazione immunohistochimica o immunofluorescente, che può essere utilizzata per confermare l'espressione genica o il silenziamento. Dopo aver raggiunto una trasduzione di vettori virali per l'espressione genica o il silenziamento, la funzione delle cellule staminali intestinali e della cripta può essere rapidamente valutata. Anche se la maggior parte degli studi organoidi impiega saggi in vitro, gli organoidi possono anche essere consegnati ai topi per analisi funzionali in vivo. Inoltre, i nostri approcci sono vantaggiosi per prevedere le risposte terapeutiche ai farmaci perché le terapie attualmente disponibili generalmente funzionano modulando l'espressione genica o la funzione proteica piuttosto che alterando il genoma.

Introduzione

La capacità di coltura delle cellule di certera umana o di topo come organoidi tridimensionali (3D) dall'intestino tenue o dal colon per periodi di tempo prolungati ha fornito un importante passo avanti perché queste culture mostrano caratteristiche distintive dell'epitelio intestinale in vivo ^{1 : il} nome del ^, ^{2 Il} nome del sistema ^, ³. Gli organidi derivati dalle cripte primarie sono in grado di auto-rinnovamento e di auto-organizzazione, che esibiscono funzioni cellulari simili ai loro tessuti di origine. Infatti, gli organoidi riassumono non solo l'organizzazione struttur....