Articolo metodologico

Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione

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DOI:

10.3791/57042

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9 maggio 2018

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1Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine (ITEM), German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), Member of REBIRTH Cluster of Excellence, 2Institute for Pathology, Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 3Division of Thoracic and Vascular Surgery, Klinikum Region Hannover (KRH), 4Department of Cardiothoracic, Transplantation and Vascular Surgery (HTTG), Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 5Institute of Pharmacology and Toxicology, RWTH Aachen University, 6Institute for Immunology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In considerazione del principio di 3Rs, modelli respiratori in alternativa agli studi sugli animali si stanno evolvendo. Soprattutto per la valutazione del rischio delle sostanze respiratorie, c'è una mancanza di analisi appropriate. Qui, descriviamo l'uso delle fette di polmone umano di taglio di precisione per la valutazione delle sostanze trasportate dall'aria.

Abstract

Malattie respiratorie nella loro ampia diversità hanno bisogno di sistemi di modello appropriato per capire i meccanismi di fondo e consentire lo sviluppo di nuove terapie. Inoltre, la registrazione di nuove sostanze richiede appropriata valutazione del rischio con adeguati sistemi di prova per evitare il rischio di essere leso a causa, ad esempio, nell'ambiente di lavoro di individui. Tali valutazioni di rischio sono di solito condotte negli studi sugli animali. In considerazione il principio 3R e pubblico scetticismo contro gli esperimenti sugli animali, umani metodi alternativi, come le fette di taglio di precisione del polmone (tributo), sono stato in continua evoluzione. Il presente documento descrive la tecnica ex vivo di tributo umano per studiare il potenziale di immunomodulatori di sostanze a basso peso molecolare, come esacloroplatinato di ammonio (HClPt). Gli endpoint misurati includono attuabilità e infiammazione respiratoria locale, caratterizzata da alterata secrezione di citochine e chemochine. Citochine pro-infiammatorie, fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e interleuchina 1 alfa (IL-1 α) sono stati aumentati significativamente in tributo umano dopo l'esposizione ad una concentrazione sub-tossica di HClPt. Anche se la tecnica di tributo è stata ottimizzata notevolmente negli ultimi decenni, la sua applicabilità per il collaudo di immunomodulazione è ancora in sviluppo. Di conseguenza, i risultati presentati qui sono preliminari, anche se mostrano il potenziale del tributo umano come un valido strumento nella ricerca delle vie respiratorie.

Introduzione

Malattie respiratorie come l'asma allergica, asma professionale, malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), enfisema e infezioni delle vie respiratorie superiori e inferiori sono in aumento e rappresentano un onere di salute in tutto il mondo1,2. Sistemi di test adatti sono necessari, al fine di identificare alcuni dei meccanismi fondamentali alla base di queste malattie, oltre che lo sviluppo e la sperimentazione di sostanze appropriati. Ricerca di base, nonché lo sviluppo di farmaci preclinici è focalizzato su risultati ottenuti in esperimenti in vitro o in vivo . Queste analisi, tuttavia, hanno loro limitazioni3. In primo luogo, saggi in vitro utilizzano cellule umane che sono sono isolate e rimosso da organi o tessuti adiacenti e così non sono più in grado di interagire con o essere protetti da altre celle3. In secondo luogo, modelli animali spesso non sono traducibili agli esseri umani a causa di differenze nella fisiologia e biochimica divergenze4. Al fine di ridurre al minimo queste limitazioni e nel contesto delle 3R (sostituzione, raffinatezza, riduzione) principio5, nuovi modelli alternativi sono in continua evoluzione.

Modelli alternativi tessuto umano 3D, come tributo, sono un collegamento tra basati su umani in vitro e modelli complessi animale in vivo . TRIBUTO riflettono l'eterogeneità funzionale con tutti i tipi di cellulari rilevanti presenti in vie respiratorie6. Inoltre, la tecnica di tributo ha il vantaggio di preparazione riproducibile di parecchie fette sottili di spessore preciso da un donatore singolo tessuto umano o animale. Questo permette un controllo interno, nonché a diverse concentrazioni o farmaci per essere testato.

Fin dalla prima introduzione di fette di polmone umano agar-riempito nel 1994 da Fisher et al. 7 la tecnica per affettare e la coltura del tessuto polmonare è stata migliorata sostanzialmente. Christian Martin et al. hanno migliorato questa tecnica per ulteriori applicazioni chimico e farmacologico8. Il nostro gruppo è stato introdotto a questa tecnica di Christian Martin nel 2007. Da allora, l'applicazione del tributo nella ricerca ha ampliato da test di risposte funzionali, quali vie respiratorie9,10 e vasocostrizione11, a immunologica, farmacologici12,13, e tossicologici7 test in varie specie in diversi laboratori. Per esempio, Schlepütz et al. 14 studiato le risposte delle vie respiratorie per differenze di specie e rispetto l'attivazione del neurone periferico mediante stimolazione elettrica a campo (EFS) o capsaicina in topi, ratti, cavie, pecore, uistitì e gli esseri umani. Hanno trovato le varie specie distinte ma diversi modelli di broncocostrizione nervo-mediata e ha concluso che gli animali di laboratorio comunemente usati (topi e ratti) non riflettono sempre la risposta umana. Per test di tossicità polmonare e di ridurre il numero di animali in questo contesto, Hess et al. 15 pre-convalidato ratto tributo come alternativa " ex vivo " per gli studi di tossicità per inalazione. Questo studio di pre-validazione multicentrico ha provocato lo sviluppo di due modelli di previsione tramite tributo con risultati promettenti.

Inoltre, nella ricerca di base, tributo è stati usati per delucidare segnalazione16,17risposte allergiche iniziali e infezione virale risposte18,19calcio. Il progresso tecnico è in corso e ulteriori progressi sono stati esplorati. Ad esempio, il campo è in aumento il beneficio del tessuto umano per lo stoccaggio e il riutilizzo del tessuto congelato. Rosner et al ha descritto una tecnica di congelamento e scongelamento murino tributo che conserva la capacità delle vie aeree di contratto sopra stimolazione: pertanto, la tecnica prolunga l'intervallo di tempo limitato entro il quale i tessuti rimangono valide e così più ulteriormente le analisi possono essere applicate nel corso del tempo per lo stesso donatore20. Oltre a questi progressi della ricerca, Lauenstein et al. 21 recentemente investigato la valutazione del rischio di vari prodotti chimici che potrebbero fungere da potenziali sensibilizzatori per asma professionale in tributo umano.

Asma professionale, i cui sintomi sono l'ostruzione del flusso d'aria e hyperresponsiveness della via aerea, simili all'asma allergico, è indotto tramite l'esposizione ad alto peso molecolare (HMW)22 o basso peso molecolare (LMW) sostanze23 (per esempio. , composti del platino) nell'ambiente di lavoro. LMW agenti hanno un'alta potenziale di sensibilizzazione quando formando apteni e associare al vettore proteine21. Registrazione di nuove sostanze chimiche HMW o LMW richiede in vitro e in vivo valutazione del rischio per quanto riguarda il loro potenziale di sensibilizzazione putativo (ad es., OECD Guideline 429)24. Il test utilizzato per determinare la sensibilizzazione presunta potenziale, tuttavia, non sono stati originariamente progettati per la valutazione del rischio dei sensibilizzatori respiratori, ma per contatti sensibilizzatori, anche se ci sembrava di essere alcuni congruenza per un piccolo sottoinsieme delle sostanze25 . Il lavoro di Lauenstein et al è stato progettato come parte del Unione europea progetto Sens-it-iv, per sviluppare strategie di sperimentazione alternative per la valutazione del rischio presunto contatto o polmone sensibilizzatori21. Per questo progetto, ci siamo concentrati sulla prova l'usabilità del tributo umano come uno strumento di test alternativo. Pertanto, un insieme di endpoint immunomodulatori (ad es., redditività e citochina secrezione) è stato selezionato per determinare il potenziale irritante o infiammatorio dei prodotti chimici, quali i composti del platino LMW. Lauenstein et al ha trovato nessun schema generale che potrebbe essere applicato a tutti i sensibilizzatori respiratori; Tuttavia, il loro lavoro fornito le basi per protocolli recentemente pubblicati26.

In sintesi, il protocollo presentato qui per la preparazione e successiva esposizione di tributo umano fornisce un metodo utile per la valutazione di potenzialmente polmonare tossico e/o sostanze immunomodulatorie che potrebbero essere coinvolti nello sviluppo delle vie respiratorie malattie come asma professionale.

Protocollo

Esperimenti con tributo umano devono essere eseguiti secondo Il codice etico dell'associazione medica mondiale e approvati dal comitato etico locale (gli esperimenti di tributo esemplari mostrati qui sono stati approvati dal comitato etico locale dall'Hannover Facoltà di medicina; numero 2701-2015). Consenso informato per l'uso di materiale di polmone umano è richiesto da tutti i pazienti di donatore o i suoi congiunti. I risultati descritti in questo manoscritto sono stati ottenuti con fettine di tessuto da donatori di età diverse, generi, storia medica e causa di resezione, anche se la maggior parte del tessuto ricevuto era da pazienti affetti da cancro del polmone. Tumore-libero soltanto il tessuto era usato per esperimenti.

1. generale preparazione del tributo umano e successiva esposizione ai prodotti chimici

Nota: Due persone sono tenuti a compilare un polmone. Un record di vaccinazione per l'epatite A e B è raccomandato. I pazienti sono selezionati ordinariamente per HCV e HIV prima del trapianto del polmone. Se un'infezione attiva con il Mycobacterium tuberculosis è diagnosticata o sospetta, polmone dovrebbe essere respinta. Tuttavia, tutti i tessuto polmonare umano fresco e campioni derivati da esso devono essere trattati come potenzialmente infettivi e corrispondenti misure di protezione devono essere adottate (maschere di filtro antiparticolato (FFP2), occhiali protettivi, guanti) per garantire la sicurezza sul lavoro della personale. La procedura dura 60-90 min.

  1. Verificare l'integrità del lobo del polmone umano.
    Nota: Una lacrima nella pleura impedisce il riempimento omogeneo del tessuto. Polmone umano materiale deve essere dal giorno della resezione. Periodi di stoccaggio di circa 2 h a temperatura ambiente (TA) prima del riempimento con agarosio su ghiaccio sono tollerati. Il tessuto che usiamo in questo protocollo è ottenuto da pazienti sottoposti a resezione. Non si tratta di pazienti deceduti. Se il tessuto è stato archiviato in ghiaccio, pre-riscaldare per RT prima di riempirlo, altrimenti l'agarosio polimerizzerà immediatamente e nessun riempimento omogeneo sarà possibile.
    Attenzione: Assicurarsi che tutte le persone a contatto con materiale umano nativo messo su indumenti di protezione costituito da un camice da laboratorio, due paia di guanti, berretto, maschera e un paio di occhiali di sicurezza. Materiale umano è potenzialmente infettivi.
  2. Pesare 7,5 g di agarosio basso-gelificazione e aggiungerlo a 250 mL di acqua bi-distillata. Bollire l'agarosio in un forno a microonde fino a quando si scioglie l'agarosio. Raffreddarlo a circa 40 ° C, a seconda del punto di fusione e gelificante di agarosio.
    Nota: Diverse boccette sono necessarie, a seconda delle dimensioni del lobo.
  3. Pre-riscaldare e mantenere il terreno di coltura (Tabella materiali) a 37 ° C.
    Nota: Se l'agarosio è troppo caldo, vitamine nel terreno di coltura perderà efficacia e danneggia le cellule. Se la temperatura della soluzione medio/agarosio è inferiore a 37 ° C, il processo di gelificazione inizierà e compromettere il riempimento omogeneo del polmone. Solo una gamma di temperatura di 37 ° C a 39 ° C è raccomandata.
  4. Posizionare tutti i materiali necessari a portata di mano prima di iniziare: 5-10 morsetti, catetere flessibile di circa 1 m di lunghezza, con una siringa adatta (per esempio, 50 mL) il raccordo del catetere, e una scatola di ghiaccio pieno di ghiaccio.
  5. Incannulare il bronco di trachea/principale inserendo il tubo di silicone e fissazione e con un morsetto orientato parallelo al tubo, affinché la pinza stringe il tessuto insieme lungo il tubo di silicone senza pizzicare esso fuori. Verificare che il tubo di silicone è fissato all'interno e non può scivolare fuori durante la procedura di riempimento. Chiudere tutti gli altri dei bronchi, vasi sanguigni e lesioni con morsetti, in modo che nessun agarosio può fuoriuscire durante la procedura di riempimento.
  6. Mescolare un volume equivalente di agarosio al 3% basso-gelificazione con terreno di coltura in un becher. Infondere la miscela del polmone usando una siringa da 50 mL. Prima di riempire la siringa con il mezzo, morsetto chiusa il catetere con le dita o una pinza per evitare bolle d'aria e reflusso dell'agarosi. Riempire il lobo del polmone fino a quando è completamente gonfio. Toccare con cura la pleura polmone sul lato; la pleura dovrebbe essere uniforme e rigido.
    Nota: A seconda delle dimensioni del lobo del polmone, fino a 2 o 3 L di soluzione di agarosio/medio può essere richiesto.
  7. Ripetere i passaggi da 1.5-1.6 per ogni Bronco nel caso dei bronchi diversi all'interno di un singolo esemplare.
  8. Mettere il polmone sul ghiaccio per la polimerizzazione di agarosio al gel per 20-40 min, a seconda della quantità di agarosio infuso. Accuratamente di toccare la pleura su più lati per controllare se è duro e fresco, che indica che quella polimerizzazione è completa, altrimenti continuare ad attendere. Lasciate che i patologi saranno tagliate a fette il polmone, prendere loro campioni e memorizzare il materiale del polmone sul ghiaccio per il trasporto.
  9. Tagliare il tessuto polmonare umano in lastre di 3-5 cm con un coltello affilato.
    Nota: Utilizzare una lama nuova per ogni polmone per garantire nitidezza.
  10. Riempire l'affettatrice di tessuto con soluzione salina bilanciata di 400ml ghiacciata Earle (EBSS). Immediatamente tagliare tubi cilindrici tessuto fuori le lastre ai polmoni con un cacciavite semi-automatico con uno strumento di carotaggio del diametro preferito (ad esempio, 8 mm; 10 mm).
    Nota: Questo diametro deve essere equivalente al diametro di fissaggio del tessuto all'interno della macchina.
  11. Regolare lo spessore delle fette del polmone per il valore di spessore desiderato.
    Nota: Uno spessore di circa 250 µm è comunemente usato negli esperimenti di tributo. Il produttore dell'affettatrice tessuto raccomanda loro misuratore di spessore di fetta di tessuto per la verifica dello spessore fetta. In alternativa, può essere utilizzato intero-monta la macchiatura combinato con microscopia confocale per determinare lo spessore di taglio come descritto da Brismar et al. 27
  12. Trasferire i nuclei di tessuto nel supporto del tessuto dell'affettatrice del tessuto. Mettere sopra il nucleo del tessuto il peso (da parte del proprietario del tessuto). È possibile impostare la velocità del braccio e la velocità della lama a 6 sull'affettatrice di tessuto. Avviare affettare il nucleo del tessuto in tributo.
  13. Supplemento 500 mL di Dulbecco commercialmente disponibile per volta Eagle Medium (DMEM): miscela di nutrienti F-12 DMEM/F12 (1:1) con 5 mL di penicillina (10.000 unità/mL) e streptomicina (10.000 µ g/mL). Conservare il terreno di coltura per diversi giorni in condizioni di sterilità in un frigorifero. Pre-riscaldare solo il volume richiesto di mezzo.
    Nota: Verrà disattivata penicillina se mantenuta a 37 ° C per periodi più lunghi. Utilizzare il mezzo di coltura privo di siero e privo di tintura, come siero composizione varia da lotto a lotto e coloranti, come il rosso fenolo, possono interferire con le analisi.
  14. Riempire una scatola di Petri (100 x 15 mm) con 25 mL di coltura ghiacciata. Media dovrebbe essere esaurito fuori l'affettatrice di tessuto in un becher aprendo il morsetto del cilindro di vetro. Trasferire le fette da un becher nella piastra di Petri con terreno di coltura utilizzando un applicatore (ad es., ciclo di inoculazione). Mettere la piastra di Petri in un incubatore (37 ° C, 5% CO2, 100% di umidità). Lasci che il media per riscaldarsi prima di fasi di lavaggio.
    Nota: Tutti gli ulteriori passi vengono eseguite in condizioni sterili.
  15. Inserire un filtro cella di Petri per il tributo di lavaggio. Rimuovere il terreno di coltura con una pipetta sierologica 10 mL attraverso il filtro delle cellule completamente e aggiungere 25 mL di terreno nuovo pre-riscaldato di 37 ° C. Ripetere questo passaggio 3 - 4 volte ogni 30 min.
    Nota: Il filtro cella impedisce le fette risucchiata nella pipetta, per evitare di danneggiare le fette.
  16. Trasferire le fettine di polmone con attenzione in una piastra di coltura 24 pozzetti con un minimo di 500 µ l di coltura per due fette per pozzetto. Esporre il tessuto polmonare a sostanze (Vedi punti 3.1-3.4), ad esempio, per 24 h a 37 ° C, 5% CO2.
    Nota: Per il trasferimento, preferibilmente usare un ciclo di inoculazione e lasciare che il galleggiante di fette sul ciclo al fine di prevenire danni ai tessuti. Nessuna ulteriore separazione delle sezioni è necessario in quanto solo carenza di sufficiente terreno nuovo può indurre la morte delle cellule in fettine di tessuto. Fette possono sovrapporsi o toccano nel pozzo: questo non ha alcuna influenza sulla vitalità del tessuto.
  17. Mettere tutto il materiale umano residuo in una boccetta di plastica con un fissativo (ad es., formaldeide al 10% tamponata) per almeno 24 h e masterizzare questo nel processo di smaltimento.
    Attenzione: La formaldeide è tossica, eseguire questo passaggio sotto una cappa.

2. istologici del tributo

  1. Preparare le cassette per biopsie con due cuscinetti in schiuma imbevute di fissativo (ad es., 4% tamponata formaldeide). Posizionare il tributo tra i cuscinetti nella cassetta biopsia e trasferire immediatamente il tessuto nella soluzione fissante. Correzione del tessuto durante la notte in 4% tamponata formaldeide.
  2. Elaborare il tessuto per paraffina incorporamento da disidratazione campioni in etanolo (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%) per 1 h ciascuno, seguita da lavaggio in xilene (3 x 1 h) e paraffina liquida (3 x 1 h) secondo i protocolli standard di istopatologia.
  3. Trasferire il tributo in un stampo di incorporamento. Utilizzare un ciclo di inoculazione. Incorporare il tessuto di tributo in paraffina liquida. Assicurarsi di posizionare il tessuto in modo uniforme nello stampo durante il lancio il blocco di paraffina.
  4. Tagliare il blocco di tessuto contenente il tributo con un microtomo rotativo finché dispone di una superficie piana e uniforme. Prendere le sezioni di serie dello spessore desiderato (ad es., 4 µm), disponente li singolarmente in numerate consecutivamente diapositive di vetro rivestito (solitamente 25-30 sezioni possono essere assunto) fino a quando l'intero tributo è stato elaborato.
  5. Macchia di diapositive di vetro singolo (ogni 8-10 sezioni) con macchia ematossilina ed eosina (H & E) per l'orientamento. Selezionare le sezioni per l'esperimento basato sulle diapositive di orientamento (il prime e l'ultima 8 sezioni sono solitamente incomplete).
    Nota: (Facoltativo) per una conservazione prolungata, diapositive possono essere immersi in paraffina liquida per la conservazione.

3. preparazione delle soluzioni per le sostanze

Nota: Preparare soluzioni di lavoro e controlli immediatamente prima dell'uso.

Attenzione: Maneggiare sostanze secondo le istruzioni di sicurezza o, se sconosciuto, come potenzialmente dannoso e seguire le precauzioni di sicurezza ordinaria.

  1. Sciogliere le sostanze solubili in acqua direttamente nel terreno di coltura. Per le sostanze chimiche scarsamente solubili o insolubili, prima di sciogliere la sostanza nei solventi appropriati a seconda della solubilità della sostanza. Sostanze con solubilità in acqua limitata (< 0,1 mg/mL) può essere sciolto, ad esempio, in DMSO o etanolo. Concentrazioni di solvente non tossico dovrebbero essere determinate per titolazione in anticipo. Assicurarsi che le sostanze non precipitare dalla soluzione quando diluito in mezzo.
    Nota: HClPt e sodio laureth solfato (SLS) soluzioni vengono preparate.
  2. Preparare la sostanza soluzioni di riserva alle 100 volte della più alta concentrazione desiderata nel terreno di coltura o solvente. Pesare 12,5 mg HClPt e 34,4 mg SLS e preparare soluzioni stock sciogliendo le sostanze chimiche in 1 mL di terreno di coltura.
    Nota: Nessun solvente è necessario per queste sostanze chimiche.
  3. Preparare una diluizione finale di 1: 100 in mezzo pre-riscaldato. In caso di preuso del solvente, questo approccio comporta la stessa concentrazione di solvente finale per tutte le concentrazioni della sostanza.
  4. Utilizzare la concentrazione finale di solventi (ad es., 1% come descritto al punto 3.3) per il trattamento di riferimento del tributo. Nessun controllo solvente è stato richiesto per i prodotti chimici citati nella sezione risultati.

4. positivi e negativi riferimenti per saggi di citotossicità

  1. Per tutti i saggi di vitalità, preparare i controlli positivi e negativi seguenti:
    1. Controllo di tessuto: incubare il tributo in terreno di coltura solo come riferimento per tributo non trattati per 24 h a condizioni di coltura delle cellule (37 ° C, 5% CO2, 100% di umidità).
    2. Controllo del veicolo (se necessario): incubare tributo con la concentrazione di solventi finale come un riferimento per tributo trattati con il veicolo solo (Vedi punto 3.4) per 24 h a condizioni di coltura delle cellule (37 ° C, 5% CO2, 100% di umidità).
    3. Controllo positivo: incubare tributo con detergente 1% in soluzione tampone per 1 h a 4 ° C.
      Nota: Se il tributo diventata incolore, il tessuto è morto. Totale L-lattato deidrogenasi (LDH) sono determinato nel surnatante, con un assorbimento di circa 1,9-2,3 (vedere procedura 6.1-6.4). Il tessuto viene utilizzato per il dosaggio di WST-1 (Vedi punti 5.1-5.5), con un assorbimento di circa 0.

5. misurazione della citotossicità indotta chimicamente in tributo umano di analisi WST-1

Nota: Il dosaggio di WST-1 è eseguito in una piastra a 24 pozzetti con due tributo per pozzetto. Preferibilmente, utilizzare duplicati per ogni parametro e i risultati di questi duplicati della piscina dopo la misurazione.

  1. Preparare la soluzione di lavoro diluendo il reagente WST-1 in mezzo immediatamente prima di iniziare. La quantità necessaria di soluzione di lavoro è 250 µ l/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Pertanto, miscelare 25 µ l del reagente con 225 µ l di terreno di coltura per un pozzetto.
  2. Dopo l'incubazione di tributo dal passaggio 1.16, scartare o utilizzare il surnatante per misurazioni di citochina o altri test, come il dosaggio LDH. Il tessuto restante viene utilizzato per il passaggio successivo.
  3. Dispensare 250 µ l della concentrazione di reagente WST-1 per lavoro ed incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO2 per 1 h. Assicurarsi che il tributo è completamente coperti dal reagente WST-1 durante l'incubazione.
  4. Collocare la piastra su agitatore orbitale (200 rpm) e agitare con cura per 30 s per garantire la completa miscelazione del reagente WST-1. Prendere una nuova piastra a 96 pozzetti a fondo piatto e pipettare 100 µ l in duplicati dal surnatante di ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti.
  5. Misurare l'assorbimento di ogni pozzetto a 450 nm (riferimento: 630 nm) utilizzando un lettore di micropiastre. Sottrarre l'assorbimento a 630 nm da 450 nm. Questi valori saranno utilizzati per il calcolo al punto 5.6).
    Nota: Dati affidabili per la valutazione di citotossicità possono essere ottenuti solo dal tessuto vitale. Di conseguenza, questi criteri di accettazione pubblicati da Hess et al. 15 , dovrebbero essere soddisfatti in ogni esperimento. Se questi criteri non sono soddisfatti, l'esperimento deve essere ripetuto.
  6. Assorbimento del controllo non trattato medio dovrebbe essere sopra 0.6, altrimenti che l'esperimento deve essere ripetuto. Se i dati soddisfano questo requisito, impostare il valore di assorbimento del controllo del tessuto al 100% e calcolare la riduzione di WST-1 dei campioni trattati in relazione al controllo del tessuto.

6. LDH Assay

Nota: Il dosaggio LDH è eseguito in una piastra a 96 pozzetti con supernatante in totale di coltura di 100 µ l dopo il periodo di post incubazione.

  1. Dopo l'incubazione del tributo con o senza gli agenti di test, prendere 50 µ l del surnatante dal passaggio 1.16 e trasferirlo in duplicati in una nuova piastra a 96 pozzetti. Questo genera duplicati da ciascuno trattati bene di una piastra a 24 pozzetti.
  2. Preparare la soluzione di lavoro del reagente LDH immediatamente prima del dosaggio. La soluzione di lavoro è costituito dalla soluzione del catalizzatore (liofilizzato disciolto in 1 mL di acqua bidistillata) e tingere la soluzione fornita dal produttore. Per una piastra a 96 pozzetti, mescolare bene 125 µ l di soluzione del catalizzatore 6,25 mL di soluzione colorante.
    Attenzione: Non esporre la soluzione alla luce diretta.
  3. Pipettare 50 µ l di soluzione di lavoro in ciascuna già contenente 50 µ l di supernatante ed incubare la piastra per 20 min a RT nel buio. Non è necessaria nessuna ulteriore miscelazione.
  4. Misurare l'assorbimento di ogni pozzetto a 492 nm (riferimento: 630 nm) utilizzando un lettore di micropiastre. Sottrarre l'assorbimento a 630 nm da 492 nm. Questi valori verranno utilizzati per il calcolo al punto 6.5.
    Nota: Dati affidabili per la valutazione di citotossicità possono essere ottenuti solo dal tessuto vitale. Assorbimento del controllo trattati con detergente dovrebbe essere superiore a 1.
  5. Per l'analisi, impostare il valore di assorbimento del controllo positivo dal punto 4.1 come 100% e calcolare il rilascio LDH in campioni trattati in relazione al controllo positivo (cioè, massimo rilascio di LDH).

7. al microscopio analisi di attuabilità con microscopio a scansione Laser confocale (cLSM)

Nota: Per l'analisi di attuabilità microscopica, due del tributo di 250-µm di spessore normale sono macchiati in 250 µ l/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Come ogni fetta è imaged separatamente, ulteriori duplicati non sono necessari.

  1. Dopo l'incubazione del tributo con o senza elementi di prova, scartare il surnatante o usarlo per misurazioni di citochina o altri test, come il dosaggio LDH. Utilizzare il tessuto restante per la procedura qui descritta.
  2. Preparare la diluizione di lavoro dell'omodimero di etidio e calceina-AM 1 (EthD-1) con una concentrazione di lavoro di entrambi i reagenti di 4 µM in terreno di coltura. A tale scopo, aggiungere 1 µ l di calceina-AM (4 mM) e 2 µ l di EthD-1 (2 mM) al terreno di coltura 997 µ l. Questo volume è necessaria a macchiare 4 pozzi con due tributo ogni.
    Nota: Evitare l'esposizione dei reagenti per dirigere la luce.
  3. Dispensare 250 µ l della diluizione di lavoro in ogni pozzetto ed incubare la piastra a 24 pozzetti per 45 min a RT nel buio. Collocare la piastra su un agitatore orbitale a 150 rpm durante l'incubazione per garantire la migliore esposizione del tessuto per la soluzione colorante.
  4. Dopo 45 min, scartare la soluzione colorante e lavare il tributo con 1 mL di soluzione tampone attraverso agitazione a 150 giri/min per 3-5 min a temperatura ambiente al buio. Ripetere questo passaggio due volte.
  5. Applicare 500 µ l di soluzione tampone in ciascun pozzetto contenente il tributo macchiato per evitare autofluorescence da terreno di coltura. Per la valutazione microscopica, eseguire almeno due z-stack distribuiti casualmente con un cLSM.
  6. Fare clic sulla scheda oculare per scegliere un 10 X / 0,3 obiettivo e fare clic su Online utilizzare il cLSM come un microscopio ottico standard per trovare la superficie del tributo. Fare clic su non in linea per uscire dall'impostazione oculare.
  7. Fare clic sulla scheda di acquisizione e accendere il laser appropriato per i fluorofori.
    Nota: Abbiamo usato un laser ad argon con una lunghezza d'onda di 488 nm per il polyanionic tintura calceina (lunghezza d'onda di eccitazione di 495 nm) e un laser HeNe con una lunghezza d'onda di 543 nm per il rilevamento del complesso DNA/EthD-1 (lunghezza d'onda di eccitazione di 533 nm). Il laser di argon generalmente dovrebbe funzionare a 30-50% della corrente massima per attivare una corrente del tubo di circa 5.7 A, come questo laser prolunga la vita media significativamente.
  8. Fare clic su Percorso di luce sotto la scheda di acquisizione e impostare i filtri necessari e specchi per l'esperimento.
    Nota: Nello studio presente, un sistema basato su filtro è stato utilizzato con un divisore di fascio dicroico principale (ad es., HFT 488/543) che separa la luce di eccitazione e di emissione. Attraverso uno specchio che riflette che questa luce viene indirizzata al divisore di fascio dicroico secondaria (ad es., NFT 545) per ulteriormente separato la luce emessa dal campione in due canali.
  9. Impostare band pass filtri (per esempio, BP 505-530 per il segnale di calceina e BP 560-615 per il segnale complesso DNA/EthD-1) che trasmettono solo una certa gamma di lunghezze d'onda e assegnare il segnale di calceina al canale 2 e il segnale complesso DNA/EthD-1 al canale 3.
  10. Selezionare la casella di Z-stack per impostare i limiti superiori e inferiori per il volume al microscopio. Premere il pulsante Live per vedere una vista diretta del livello corrispondente sullo schermo. Spostare lo stato attivo verso l'alto o verso il basso per trovare la superficie del tributo con un segnale forte.
  11. Fare clic sulla sottosezione di canali e la casella Visualizza tutti. Bloccare la tabella premendo il pulsante del canale corrispondente sotto l'immagine live e attivare il canale colore.
    Nota: Un colore blu nell'immagine live indicherà che non c'è nessun segnale, mentre un segnale alto apparirà in bianco e un segnale sovraesposto apparirà in rosso.
  12. Impostare il foro stenopeico per il canale rosso EthD-1 su 1 unità luminose per il migliore compromesso tra efficienza di collezione light e sezionamento ottico e regolare di conseguenza il canale calceina. Aumento del segnale rilevato del guadagno in modo tale che sembra bianca ma non rosso nell'immagine live con tabella di blocco colore canale attivato.
    Nota: Il guadagno master non deve superare 600 unità.
  13. Aumentare o diminuire l'offset digitale per regolare lo sfondo in modo che appare in blu nell'immagine live con tabella di blocco colore canale attivato.
  14. Fare clic sulla scheda Z-Stack sotto acquisizione multidimensionali e utilizzare la messa a fuoco per spostare da un z-strato di interesse. Premere il Primo Set per salvare questa posizione per acquisizione successiva. Lentamente spostare l'attenzione verso l'alto o verso il basso fino a quando una gamma di 30 µm è stato raggiunto e premere Set ultimo per salvare.
  15. Fare clic su Live ancora una volta per disattivare l'immagine dal vivo e premere sull'Esperimento Start per avviare l'imaging.
    Nota: Tessuto vitale viene rilevato tramite fluorescenza della calceina tintura polyanionic. Le cellule morte sono discriminate dalla formazione di complessi di EthD-1 e acidi nucleici.

8. immagine Rendering

Nota: La raccomandazione di computer del software image rendering deve tener conto, come questo programma richiede l'hardware appropriato.

  1. Caricare il file LSM acquisito da microscopici vitalità colorazione del tributo (Vedi sezione 7) nel software di rendering immagine. Salvarlo come file IMS prima di procedere. Impostare tutti i parametri del controllo del tessuto e applicarli a tutte le immagini. Non sono consentiti ulteriori modifiche.
  2. Utilizzare il tasto del Volume per la ricostruzione della superficie del tessuto vitale (calceina macchiatura) (complementare figura 1A) e il pulsante di macchie per nuclei di cellule morte (complementare figura 1 H). Durante il rendering di un canale, spegnere l'altro canale nella finestra di regolazione del display.
  3. Iniziare eseguendo il rendering del volume del tessuto vitale: imposta il canale della superficie, elaborare l'intera immagine, impostare il fattore di liscio a 0,5 µm e utilizzare intensità assoluta per soglia (complementare figura 1B, C). Premere la freccia blu in avanti.
  4. Regolare la soglia di intensità assoluta del volume ricostruito; intensità di rumore e lo sfondo dovrebbe essere sottratto. Sovrapposizione di superficie viene visualizzata in grigio e la precisione della copertura superficiale dovrebbe essere controllato (complementare figura 1). Dopo aver completato la regolazione, premere la freccia blu in avanti. La maggior parte del tempo questo passaggio è necessario per il calcolo delle impostazioni. Se il software non è in grado di calcolare il volume, aumentare il fattore di liscio.
  5. Nell'ultimo passaggio, è necessario scegliere un filtro. Utilizzare il filtro di sfericità (con circa 10 µm) per il rendering superficie per filtrare i macrofagi nello spazio alveolare (complementare Figura 1E). Premere il pulsante verde in avanti.
  6. Otticamente regolare l'immagine in uscita e statistiche di esportazione come file con estensione xls. Il volume totale (somma) verrà utilizzato per ulteriori analisi (complementare figura 1F, G). Salvare le impostazioni e li usa per tutte le ulteriori analisi dello z-stack prese lo stesso giorno con le stesse impostazioni di cLSM (complementare figura 1I).
  7. Ricostruire il canale rosso (macchie) per nuclei di cellule morte. In modo casuale misurare la dimensione di punto in µm ridimensionamento nella finestra surpass; formato del puntino è circa 5 µm. Mark Enable e impostata le dimensioni del punto. Controllare se tutti i punti sono segnati e ogni punto viene conteggiato una sola volta. Correggere manualmente se necessario (complementare figura 1B, H, J). Premere la freccia blu in avanti.
  8. Premere il tasto di avanzamento verde per consentire al programma di calcolare/contare il numero totale di punti in base ai parametri impostare ed esportare il risultato come file xls (Complementare figura 1 K, L, M). Per analisi statistica o grafico dell'immagine è possibile impostare il numero di nuclei di cellule morte calcolato in rapporto al volume di tessuto vitale.

9. misurazione di citochine e chemochine in tributo umano

Nota: La risposta immunitaria di citochine e chemochine può essere misurata extracellularly nel surnatante cultura e intracellulare nei lysates del tessuto dopo il tempo di incubazione. ELISA è misurata in duplicati in una piastra a 96 pozzetti con 100 µ l/pozzetto.

  1. Preparare una soluzione detergente 1% con 5 mL di detergente con 495 mL di soluzione tampone. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per diversi mesi.
  2. Mescolare la soluzione detergente 1% con l'inibitore della proteasi (PI) con un rapporto di 1: 500. La quantità richiesta dipende la piastra di coltura; ad esempio, è possibile utilizzare 500 µ l/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Per un bene, mescolare 1 µ l di PI con 499 µ l di soluzione detergente.
  3. Preparare le provette con 1 µ l di soluzione di PI e raccogliere 500 µ l di supernatante in questi tubi di coltura. Sostituire immediatamente il mezzo della piastra a 24 pozzetti di soluzione detergente 500 µ l, contenente PI come preparata al punto 9.2. Lyse tessuto per 1h inserendo la piastra a 24 pozzetti in a 4 ° C. Dispensare il tessuto lisato in un nuovo tubo e memorizzare questi tubi a-80 ° C fino a ulteriori analisi.
    Nota: Il protocollo di ELISA altamente dipende dal produttore e devono essere seguite le istruzioni del produttore. Un protocollo standard di ELISA è descritto di seguito.
  4. Eseguire il test ELISA per misurare i livelli di citochine nel surnatante o lisato secondo le istruzioni del produttore. Per misurare IL-1 α e TNF-α, rivestire a96-piastra di pipettaggio 100 µ l di anticorpo di cattura (per la diluizione seguire le istruzioni del produttore) e incubare per una notte a TA.
  5. Preparare il tampone di lavaggio tramite la dissoluzione di una compressa di tampone di lavaggio in 1 L acqua bidistillata. Rimuovere l'anticorpo di cattura e il tampone di lavaggio di dispensare 400 µ l in ogni pozzetto. Sostituire questo volume tre volte. Bloccare la piastra con l'aggiunta della soluzione bloccante (ad es., BSA 1% in soluzione tampone, secondo le istruzioni del produttore). Incubare per 1h a RT.
    Nota: Standard ELISAs commercialmente disponibili richiedono 2 x 100 µ l del tessuto surnatante o lisato. Campioni devono essere scongelati una volta e appena prima dell'uso. A seconda della sensibilità del dosaggio e la citochina rilasciata, i campioni devono essere diluiti prima della misurazione. Di conseguenza, diluire il campione nel reagente fornito dall'analisi.
  6. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere i campioni diluiti per la curva standard (per diluizione seguire le istruzioni del produttore) e 100 µ l di supernatante di tessuto o 100 µ l del tessuto lisato in duplicati raccolti nel passaggio 9.3. Incubare per 2 ore a RT.
  7. Rimuovere i campioni e il tampone di lavaggio di dispensare 400 µ l in ogni pozzetto. Sostituire questo volume tre volte. Anticorpo di rilevazione biotinilati di dispensare 100 µ l (per la diluizione seguire le istruzioni del produttore) e incubare per 2 h a TA.
  8. Rimuovere l'anticorpo ed il tampone di lavaggio di dispensare 400 µ l in ogni pozzetto. Sostituire questo volume tre volte. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di HRP-labeled streptavidin (per diluizione seguire le istruzioni del produttore) e incubare per 20 min a RT (controllare le istruzioni del produttore).
  9. Rimuovere la streptavidina e tampone di lavaggio di dispensare 400 µ l in ogni pozzetto. Sostituire questo volume tre volte.
  10. Aggiungere 100 µ l del substrato (consigliato dal produttore) e incubare per 20 minuti al buio (controllare le istruzioni del produttore).
    Nota: Questo passaggio è sensibile alla luce. Evitare l'esposizione alla luce del substrato e piastra.
  11. Fermare la reazione aggiungendo 50 µ l di soluzione di arresto (1 M H2SO4). Misurare l'assorbimento di ogni pozzetto a 450 nm (riferimento: 570 nm) utilizzando un lettore di micropiastre. Sottrarre l'assorbimento a 570 nm da 450 nm.
    Nota: Non trattata e/o veicolo tessuto controlli agiscono come controlli negativi. Per indurre una risposta immunitaria nel tessuto polmonare, è necessario utilizzare stimolazione appropriata (ad esempio, lipopolisaccaride di 100 ng/mL (LPS)) come controllo positivo. Incubare i due pozzi con due PLC per pozzetto con 100 ng/mL LPS in terreno di coltura, ad esempio, per 24 h e raccogliere il surnatante e tessuto lisato come descritto al punto 9.3.
    Nota: I risultati misurati sono accettati, se l'assorbimento di altissimo livello è pari o superiore a 1.0; in caso contrario la misurazione deve essere ripetuta. La curva standard dovrebbe seguire il raccordo curva sigmoidale dose-risposta.
  12. Concentrazioni di citochina (pg) determinate da ELISA nel passaggio 9.11 sono normalizzate per il contenuto proteico totale determinato nel lisato di ogni campione di tessuto (vedere sezione 10).

10. misurazione del tenore di proteine totali nel tributo umano

Nota: Il tributo necessario essere lisate per misurare la concentrazione di proteine totali. I lisati di tessuto dal punto 9.3 sono utilizzati per questo passaggio. Il test viene fatto in una piastra a 96 pozzetti piatta con 25 µ l/pozzetto di tessuto lisato, dispensato in duplicati.

  1. Preparare uno standard di BSA di 7 punti con concentrazioni di BSA di 2.000 µ g/mL, 1.500 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL e 125 µ g/mL. Applicare 25 µ l in duplicati per ogni standard e utilizzare 25 µ l di soluzione tampone come uno spazio vuoto su una piastra a 96 pozzetti (uso un piatto con una piastra di copertura).
  2. Dispensare 25 µ l dei lisati (vedere il punto 9.3) da ogni pozzetto in duplicati in una piastra a 96 pozzetti. In totale, 50 µ l di ciascun bene è necessaria. Preparare il reattivo di lavoro della soluzione BCA di BCA diluendo il reagente B 01:50 in reagente BCA A. Per una piastra a 96 pozzetti utilizzare 400 µ l di reagente B e 20.000 µ l di reagente A.
  3. Attentamente Dispensare 200 µ l di reagente lavoro in ciascun pozzetto, evitando bolle d'aria. Posizionare la piastra su agitatore orbitale (150 rpm) per 30 s per garantire la corretta miscelazione di lisati e reattivo di lavoro e mettere un coperchio sulla piastra. Incubare la piastra a 37 ° C per 30 min al buio. Misurare l'assorbimento di ogni pozzetto a 540-590 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
    Nota: I risultati della misurazione vengono accettati, se l'assorbimento del più alto standard di BSA è pari o superiore a 0,8; in caso contrario la misurazione deve essere ripetuta. La curva standard dovrebbe seguire il raccordo curva sigmoidale dose-risposta.
  4. Per l'analisi, è necessario calcolare la curva standard utilizzando un'equazione di Marquardt 4 parametri dopo la sottrazione del bianco. Calcolare le concentrazioni di proteine dei campioni sconosciuti utilizzando la curva standard.

Risultati

Con il presente metodo di ricerca, tributo umano sono stati preparati ed esposti a cinque concentrazioni di sostanze industriali per valutare gli effetti immunomodulatori chimicamente indotta nel materiale del polmone umano. Tessuto polmonare è stato esposto in condizioni sommerse come cultura permanente per 24 h. tossicità è stata valutata tramite la misura di LDH rilasciata, attività mitocondriale e la macchiatura microscopica vitalità. Inoltre, il contenuto proteico totale per normalizzazione e citochine pro-infiammatorie sono stati misurati. Quando possibile, concentrazione inibitoria (IC) 75 valori sono stati calcolati mediante montaggio non-lineare curva sigmoidale. Le sostanze di riferimento positivo, detergente per citotossicità e LPS per la risposta di citochina innata, sono state utilizzate per la convalida di ogni esecuzione. Il IC75 logaritmicamente trasformato [µM] valori (registro IC50) sono stati utilizzati come "irritante" concentrazioni per misure di rilascio di citochina successive.

Figura 1 e Figura 2 mostrano la procedura del materiale di riempimento del polmone umano ed esemplare H & E macchiatura del tributo umano. Le procedure igieniche sistematiche devono essere seguite per evitare effetti negativi sulla salute e garantire la sicurezza del personale movimentazione del materiale del polmone umano. La tecnica richiede pratica e formazione del personale. Esperti patologi che distinguono diverse regioni (superiore/inferiore lobi e subpleural contro più centrale) e malato contro zone sane sono necessari per valutare lo stato patologico del materiale del polmone umano. Il tributo umano generato deve essere utilizzato per la preparazione di H & sezioni sottili colorati, che possono essere ri-valutati da un patologo. Questa procedura consente agli utenti di acquisire pratica in discriminante diverse zone malate e le posizioni all'interno dei polmoni.

Figura 3 presenta i risultati di misurazione per l'attività LDH e WST-1 in tributo umano dopo 24 h di incubazione con SLS. Il controllo medio non trattato senza SLS, mostrato 0 µ g/ml SLS, è un importante controllo di qualità. Valori dovrebbero essere inferiore al 20% per LDH rispetto al tessuto detergente-lisati e > 0,7 unità di assorbanza per il dosaggio di WST-1. Questi controlli di qualità servono anche come indicatori di redditività di tessuto insufficiente. La reattività del tessuto umano verso la soluzione detergente, come un'efficace sostanza tossica, deve essere inclusa come controllo positivo. Esso dovrebbe risultare in un aumento di 300-500% (> 2,0 unità di assorbanza) di LDH rispetto con tessuto non trattato e nei valori < 0,1 unità di assorbanza per il dosaggio di WST-1. SLS è provocato da una riduzione dipendente dalla dose di attuabilità delle cellule come misurato da un aumento di LDH e una diminuzione di attività metabolica nel dosaggio WST-1 alle concentrazioni > 87 µ g/mL. Un modello di concentrazione-risposta sigmoideo era montato ai dati, in modo che è possibile calcolare valori IC75 o IC50. Questi valori possono essere utilizzati successivamente per selezionare le concentrazioni per i livelli di citochine e chemochine: alle concentrazioni altamente tossiche, solitamente no o soltanto diminuite citochine e chemochine possono essere rilevati. Si raccomanda, pertanto, non tossico o sola concentrazioni leggermente tossiche (IC75). È importante da notare qui che l'aumento previsto nell'attività LDH nel surnatante della cultura delle cellule è spesso influenzato da sostanza applicata21. Frequentemente, le interferenze si verificano tra la sostanza e l'attività enzimatica, che conduce all'interpretazione errata dei risultati se il dosaggio LDH era l'analisi di citotossicità solo usato. Così, è importante e necessario eseguire diversi saggi di citotossicità per ottenere risultati affidabili e validi. Inoltre, va ricordato che la sensibilità dei saggi LDH e WST-1 è altamente paragonabile.

Nella Figura 4, immagini microscopiche attuabilità di tributo dimostrano la reattività del tessuto umano al detersivo come un'efficace sostanza tossica. I risultati sono molto utili per confermare altri dati di redditività, ma questo richiede apparecchiature aggiuntive. Effetti tossici sono valutati visivamente dalla valutazione del tessuto di calceina-positivi rispetto ai nuclei delle cellule EthD-1-positive. Segmenti scelti a caso all'interno del parenchima generalmente causare dati comparabili, considerando che dovrebbe essere evitati airways o vasi sanguigni, come la più grande cavità possono spostare i risultati. Dalla nostra esperienza e con le impostazioni al microscopio sopra descritte, è misurato un volume medio compreso tra 1,5 x 106 e 5 x 106 µm3 del tessuto di controllo. I valori dipendono dalla qualità del materiale del polmone, qualità di tributo e anche la malattia del donatore del tessuto polmonare. Anche se la vitalità del tessuto polmonare umano varia tra i donatori, il numero di nuclei di cellule morte rispetto al tessuto vitale non deve superare il 15% del controllo del tessuto. Se i nuclei di cellule morte sono principalmente presenti nel controllo del tessuto, tuttavia, l'esperimento dovrebbe essere abbandonato.

Figura 5 consente di visualizzare dati rappresentativi per l'effetto immunomodulante di HClPt e SLS sul tessuto polmonare umano. Le citochine pro-infiammatorie IL-1 α e TNF-α sono biomarcatori di infiammazione, che indica l'inizio dei processi infiammatori dopo l'esposizione a sostanze stimolanti. Entrambe le citochine sono state misurate dall'ELISA. Extracellulare IL-1 α è solitamente basso in tributo umano, mentre intracellulare IL-1 α raggiunge livelli di 1.000 pg/mL e sopra. Una diminuzione intracellulare IL-1 α indica processi citotossici in corso - ed è stata osservata soprattutto dopo esposizione del tributo umano alle sostanze chimiche. Se il tessuto è stimolato con LPS, un attivatore del sistema immunitario innato e come tale controllo trattamento positivo, poi la maggior parte dell'indotto IL-1 α può essere rilevata soltanto intracellulare dopo 24 h. Al contrario, secrezione di TNF-α indotta da stimolazione dei LPS possa essere misurata principalmente extracellularly. L'uso di un idoneo controllo positivo, come LPS, dimostra la validità di un metodo. Con il presente metodo di ricerca, tributo umano sono stati esposti a tre concentrazioni di HClPt (32, 64 e 125 µ g/mL) o due concentrazioni di SLS (1 e 10 µ g/mL) per 24 h. citochina secrezione è stata determinata come somma delle citochine extracellulari ed intracellulari normalizzato a concentrazioni di proteine totali come raffigurato nella Figura 5. Vale la pena ricordare qui che il dosaggio BCA è generalmente utilizzato per la determinazione del contenuto proteico totale, tuttavia, essa riflette inoltre la citotossicità indotta da sostanza. Quindi, concentrazioni altamente tossiche il contenuto proteico totale non può essere utilizzato per la normalizzazione dei dati di citochina. Secrezione di IL-1 α aumentata significativamente da 263 ± 38 pg/mg a 887 ± 216 pg/mg e per TNF-α da 263 ± 38 pg/mg a 1.160 ± 286 pg/mg (Figura 5A, B). Inoltre, la secrezione di IL-1 α e TNF-α LPS indotta è presentata in confronto ad un controllo di tessuto non stimolate. Induzione di citochine pro-infiammatorie di pattern molecolari associati, ad esempio LPS, dimostra la validità di un metodo ed è altamente raccomandato per essere usato quando si lavora con tributo umano per studiare gli effetti immunomodulatori. Per maggiori dettagli sui dati HClPt e SLS, fare riferimento allo studio di Lauenstein et al. 21

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Figura 1 : Procedura per il riempimento di materiale del polmone umano. Polmone umano è preparato immediatamente dopo la resezione. Il polmone dovrebbe essere conservato a temperatura ambiente per riempimento coerenza con agarosio e per evitare la polimerizzazione dell'agarosi improvvisa durante il riempimento. Il polmone è posizionato orizzontalmente, con i lobi sparsi per una vista ottimale sul bronco principale o bronchi (A e B per primo piano sul Bronco). I bronchi sono cannulati con un tubo flessibile in silicone e fissati con morsetti (C). Dopo la polimerizzazione di procedura e dell'agarosi di riempimento nel tessuto, patologi addestrati tagliare il polmone in fette di circa 3-5 cm di spessore (D). Da queste fette nuclei di tessuto cilindrica (Ø ad es., 8mm) sono preparati con un carotaggio strumento (E). Questi nuclei di tessuto vengono tagliati con un'affettatrice di tessuto in tributo, che vengono immediatamente trasferiti in mezzo-riempita di Petri per incubazione in condizioni di coltura delle cellule normali (E). Dopo diversi passaggi di lavaggio il tributo sono state trasferite in piastre per colture cellulari (ad es., piastra a 24 pozzetti con due tributo al pozzo e 500 µ l medium) per rimuovere i detriti cellulari residua e mediatori rilasciati cella (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 : Determinazione dello stato di salute del tributo umano macchiando di H & E. Il tributo in questa immagine, preparata da un donatore con un tumore del polmone, Mostra il tessuto del polmone intatto con parenchima alveolare, periferico airways (*) e vasi sanguigni (frecce) nella panoramica (A). A maggiore ingrandimento, conducendo airways con epitelio respiratorio ciliato intatto (frecce) (B), una struttura alveolare intatta fiancheggiata da pneumocytes vitali, tra cui un capillare con numerosi eritrociti (frecce) (C), gli spazi alveolari che contiene i macrofagi alveolari (CD68 immunohistochemistry) (D), così come i vasi sanguigni con endotelio intatto (immunohistochemistry CD31) (E) può essere osservato. Tumore-libero soltanto il tessuto è stato utilizzato per il tributo, ragion per cui nessun zone malate in modo macroscopico sono visibile. A differenza di tributo preparati da donatori con altre malattie polmonari, come l'enfisema o la fibrosi, la struttura alveolare non viene interrotto e il tributo è solo leggermente sfilacciato al confine esterno, probabilmente a causa di operazioni di preparazione. Barre della scala indicano 1.000 µm (A) e 50 µm (B–E), rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3 : Determinazione della citotossicità indotta da SLS in tributo umano, misurata dalla perdita dell'enzima LDH in terreno di coltura (A) e perdita di attività enzimatica metabolica valutati con il colorante WST-1 (B). TRIBUTO umano sono state esposte alle concentrazioni aumentanti di SLS. Un modello di concentrazione-risposta sigmoideo era montato successivamente ai dati, in modo che valori IC75 o IC50 (concentrazione inibitoria alla riduzione del 25% e 50% di attuabilità delle cellule) possono essere calcolate (figure di destra). I dati sono presentati come media ± SEM, n = 3-5. Assorbanza di dosaggio LDH è stata misurata a 492 nm (riferimento a 630 nm) e di analisi di WST-1 a 450 nm (riferimento a 630 nm). Dati sono stati adattati e modificati da Lauenstein et al. 21 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 : Immagini rappresentative del rendering macchiatura e immagine microscopico tridimensionale di tributo umano. Controllo di tessuto vivo e tempi di risposta del tessuto al detersivo, come un'efficace sostanza tossica, vengono mostrati dopo la macchiatura del tributo umano con calceina (giallo) ed EthD-1 (rossi). Pile di 30 µm sono state scattate con un obiettivo da 10x (A) e il rendering (B). La barra della scala indica 100 µm. eccitazione lunghezze d'onda 488 nm e 543 nm, emissione filtri BP 505-550 nm e LP 560 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5 : Ammonio esacloroplatinato (HClPt)-indotto la secrezione di IL-1 α e TNF-α in tributo umano dopo l'esposizione di 24 h. TRIBUTO sono stati esposti a tre concentrazioni (32 µ g/mL, 64 µ g/mL e 125 µ g/mL di HClPt) e due diverse concentrazioni (1 µ g/mL e 10 µ g/mL) di SLS. Extracellulare e intracellulare IL-1 α (A) e TNF-α (B) sono stati determinati da ELISA e normalizzato per il contenuto proteico totale. Per mostrare la validità del metodo un positivo attivatore del sistema immunitario innato, LPS, viene visualizzato come un riferimento per intracellulare IL-1 α (A) e per il rilascio di TNF-α (B) extracellulare, normalizzato al contenuto proteico totale. I dati sono presentati come media ± SEM, *p < 0.05 e * * *p < 0,001; HClPt e SLS: n = 9, IL-1 αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 in tecnici duplicati (test di Mann-Whitney). Questa figura è stata modificata da Lauenstein et al. 21 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Complementare figura 1: elaborazione dettagliata computazionale per immagini di attuabilità microscopici che macchia usando software di rendering. Passo-passo procedura operativa per l'analisi di immagine delle immagini caricate LSM per rendering superficie di tessuto vitale calceina-macchiato (A–G, I) e spot rilevamento dei nuclei delle cellule tinto omodimero di etidio (H, J–M). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Complementare figura 2: Panoramica di analisi computazionale immagine microscopica vitalità colorazione del tessuto polmonare umano di. Tessuto vitale (giallo) è stata analizzata dal rendering superficie (B–io) e i nuclei di cellule morte (rossi) sono stati rilevati tramite rilevazione spot (J–P). La modalità snapshot è stata utilizzata per esportare l'immagine (Q). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La tecnica di tributo umana è ben consolidata nel nostro laboratorio. Il presente documento fornisce una descrizione di questa tecnica e il suo uso per test di tossicità delle sostanze nel tessuto del polmone ex vivo. In generale, qualsiasi laboratorio usando che questa tecnica dovrebbe cercare di impostare un'analisi correlate definizione delle gamme quantificabili, stima della variabilità e controlli di qualità garantendo la validità dell'esperimento. Possibili procedure standard potrebbero essere, ad esempio, per ripetere ogni endpoint, ad esempio, l'analisi di citotossicità, in un minimo di tre donatori biologici (singole esecuzioni) con un minimo di due o tre ripetizioni tecnici per esempio tra cui positivo e riferimenti negativi. Laboratorio personale deve essere istruito per aumentare la coerenza di dosaggio e ridurre al minimo la variabilità di analisi.

Gli endpoint frequentemente utilizzati per valutare gli effetti immunomodulatori di sostanze sul tessuto polmonare comprendono la citotossicità misurazioni utilizzando dosaggi diversi (ad es., analisi di LDH, analisi WST-1, macchiatura analisi microscopica), rilascio di citochine assays, anche come cambiamenti nel profilo di espressione e caratterizzazione dei cambiamenti in popolazioni cellulari di immunohistopathological metodi6. Inoltre, ci sono tecniche che descrivono la visualizzazione delle cellule, quali le cellule dendritiche polmonare, in murino tributo28 che può essere trasferito anche al tributo umano e potrebbe quindi fornire la più ampia e approfondita la composizione cellulare prima e dopo il trattamento con sostanze citotossiche putativi.

Questo protocollo di base e la tecnica per la preparazione di sezioni di tessuto polmonare umano è paragonabile a tecniche che sono state descritte bene in pubblicazioni29. In breve, il materiale dell'organo è ottenuto da pazienti affetti da vivere-minacciando di malattie croniche come il cancro del polmone, che hanno sottoposto ad intervento chirurgico di resezione o trapianto. Gli studi devono essere approvati dal comitato etico locale. Consenso informato dei pazienti è richiesto. Creazione di un flusso di lavoro tra clinica e laboratorio è una questione critica e richiede comunicazione e definizione delle interfacce e delle infrastrutture tra entrambi i siti. Polmone umano materiale deve essere elaborata direttamente dopo resezione per preservare la vitalità del tessuto. Vale la pena ricordare che la tecnica qui descritta per tributo umano può essere applicata ai polmoni grandi e piccini e ai polmoni sani e malati. Negli Stati Uniti, ad esempio, è possibile ottenere i polmoni da donatori di organo sano che morti in incidenti o cui organi sono stati respinti per il trapianto.

Il primo passo fondamentale nel protocollo è l'inflazione delle vie aeree e del parenchima circostante con soluzione di agarosio. Questo passaggio è necessario per solidificare il tessuto molto morbido per la successiva procedura per affettare. La qualità del materiale di polmone umano, basato sullo sfondo la malattia, è fondamentale qui. Possono essere riempiti solo lobi con pleura intatto. I tumori di stadio finale nei pressi del Bronco a volte impediscono il processo di riempimento. Prima di gonfiare il materiale umano, la temperatura della soluzione di agarosio deve essere accuratamente controllato. Troppo sangue (o altri fluidi, essudati) dentro l'essere umano del tessuto polmonare si tradurrà in diluizione indesiderato di agarosio e influenzerà il processo di polimerizzazione. Dopo l'inflazione del tessuto polmonare e gelificanti di agarosio su ghiaccio, i polmoni sono tagliati in sezioni di spessore di 200 a 300 µm. Consistenza del tessuto è un problema molto critico. Se il tessuto è troppo morbido, taglio di sezioni uguali è difficile. Anche se la stessa microtomo parametri vengono impostati per ciascun donatore, lo spessore delle fette tra i donatori può variare, dovuta a singole condizioni e modifiche durante il gonfiaggio elaborano per ciascun polmone. Disomogenea riempimento del tessuto si tradurrà in spessori di sezione diversa. Invece di misura e lo spessore delle fette di standardizzazione, misura del contenuto proteico totale può essere utilizzato per monitorare indirettamente spessori fetta del polmone. Parecchie malattie di stadio finale ostacolano il processo di sezionamento; ad esempio, sangue vasi sono estremamente ispessiti in ipertensione polmonare e tessuto fibrotico può essere così rigido che affettare di cilindri di tessuto è appena possibile e la lama del microtomo deve essere sostituito molto spesso.

Dopo la preparazione del tributo umano e fasi di lavaggio intensivo, che sono necessarie per rimuovere i detriti cellulari e rilasciato enzimi, tessuto sezioni possono essere utilizzati per esperimenti29. TRIBUTO umano è coltivate in condizioni di coltura delle cellule normali ed esposti, per esempio, sostanze chimiche, farmaci o lipopolisaccaridi. Occasionale contaminazione di tributo a causa di infezioni (sconosciute) è un numero speciale nella cultura del materiale del polmone umano. Colture di tessuti mostrando infezioni devono essere scartati e l'apparecchiatura deve essere disinfettata accuratamente. Separazione spaziale tra luoghi di laboratorio utilizzati per la preparazione di un lato e coltura, d'altra parte, può aiutare per evitare infezioni crociate. Per quanto riguarda l'attrezzatura, il microtomo può esaurire e viti a testa esagonale allentati può portare a danni al motore e arresto del movimento della lama. Non ogni parte dell'affettatrice è fatta di acciaio inossidabile, e così esso si ossida se non asciugati immediatamente modificare pulizia. Per ovviare a problemi di attrezzature, può essere necessario disporre di almeno un dispositivo di backup.

In precedenti pubblicazioni, dell'agarosi sono stato segnalato per essere lavato fuori e rimosso durante intensi fasi di lavaggio dopo la preparazione. In realtà, questo non è possibile, l'agarosio non può essere rimosso. Per la rimozione completa di agarosio, ha bisogno di essere ri-fuso a temperature elevate, che avrebbero distrutto il tessuto. L'agarosio in alveoli e airways non interferisce con gli endpoint descritti. Altri endpoint potrebbe essere influenzato dalla presenza di agarosio (veda inoltre limitazioni). La necessità di preparare le sezioni di tessuto molto fresco deve essere sottolineato, come la vitalità del tessuto è una questione critica nella cultura. Broncocostrizione non è un parametro valido per la vitalità. Si consiglia di utilizzare almeno due o tre saggi di citotossicità indipendente per verificare la fattibilità del parenchima circostante; Questo deve essere verificata in ogni esperimento30. Controlli di qualità nelle analisi di citotossicità servono come indicatori di redditività di tessuto insufficiente. Pertanto, si raccomanda di valutare la capacità di risposta del tessuto, ad esempio, per un'efficace sostanza tossica come un detergente in tutti i saggi di citotossicità. Basato su curve dose-risposta, valori minimi e massimi di assorbimento devono essere definiti per saggi di citotossicità e incontrato per esperimenti successivi. Ulteriori modifiche al protocollo dipendono principalmente i prodotti chimici applicati e gli endpoint di interesse. L'applicabilità di sostanze chimiche altamente reattive o insolubile è limitato. La più alta concentrazione di solvente per DMSO è limitata all'1%. Concentrazioni più elevate possono essere utilizzati, ma possono provocare marcato rilascio di citochine pro-infiammatorie, quali IL-8. D'altra parte, lo stimolo utilizzato potrebbe essere relativamente debole. In questo caso, la quantità di tessuto può essere aumentata da due a quattro fette per pozzetto. Questo approccio limita la redditività a 24 h.

Una limitazione importante di tributo umano è che in Germania possono solo essere preparate da materiale di polmone umano malato. I pazienti che subiscono la chirurgia sono normalmente più di 50 anni e 80% dei pazienti affetti da cancro del polmone sono o utilizzata per essere fumatori. Farmaco di pazienti, quali i glucocorticoidi, può anche influenzare il risultato degli esperimenti utilizzando tessuto umano. Pertanto, è essenziale: i) convalidare ogni esperimento di riferimenti positivi verifica redditività, funzionalità e la sensibilità del tessuto individuale e ii) Croce-convalidare i risultati utilizzando tessuto polmonare sano, non malate, mezza età da animali da laboratorio (primati non umani come cynomolgus e, se possibile, mouse, ratto, cavia). Meglio il Punteggio di patologia del tessuto malato, meglio i risultati sperimentali. Tessuto pesante malato difficilmente può essere utilizzato e molto spesso spettacoli limitata redditività, i livelli di citochina insufficientemente bassa o estremamente alta, infezioni batteriche o fungine e meno broncocostrizione. Variazione di donatore a donatore è superiore rispetto con i risultati ottenuti da animali da laboratorio, che riflette la variabilità individuale degli esseri umani. Questo, tuttavia, non è una limitazione in generale; Come accennato in precedenza, in altri paesi (ad es., gli Stati Uniti) è possibile avere i polmoni sani da donatori di organo defunto rifiutati per trapianto. La reattività del tessuto è stato ben descritto per la prima fino a 48 h in esperimenti di esposizione acuta. Vitalità e funzionalità del tessuto è ridotta dopo molti giorni di cultura o dopo conservazione a-80 ° C. È possibile al tessuto polmonare umano di cultura per fino a circa 14 giorni. Attuabilità continua durante questo periodo; Tuttavia, si è osservato un aumento nella variabilità, nonché una perdita di funzionalità delle diverse popolazioni di cellule, quali i macrofagi, nel tessuto, con conseguente rilascio di citochine limitato in risposta ai mitogeni. Un'altra limitazione per alcuni endpoint è la presenza di agarosio nel tessuto, ostacolare, per esempio, l'isolamento di alta qualità e sufficiente quantità di RNA31 o la preparazione di sospensioni unicellulari per citometria a flusso successivo e fenotipizzazione delle cellule. La possibilità di acquisire conoscenze meccanicistiche in cella singola risposte e funzionalità è limitata.

Modelli di tessuto organotipiche, come tributo umano, sono considerati hanno un elevato impatto sulla ricerca di base e non clinici. Polmone umano materiale ha una composizione biologica che riflette l'architettura normale dell'organo. Esso contiene, ad esempio, cellule epiteliali bronchiali ed alveolari residenziale, cellule muscolari lisce, fibroblasti, cellule endoteliali, fibre nervose e macrofagi. Il tessuto è praticabile e le cellule rispondono a stimoli diversi. Del nervo fibre, anche se tagliato, può essere attivato localmente, che conduce al terminal risposte riflesse14. Di conseguenza, questo modello ex vivo offre la possibilità di studiare la risposta immune innata cellular, risposte di difesa, cytokine signaling e induzione degli indicatori della superficie delle cellule. Diversi miglioramenti nella tecnica, la coltura e la convalida di endpoint consentono l'utilizzo di tributo umano nella scienza traslazionale. Esempi di futuri approcci sono: i) validazione di nuovi obiettivi nel tessuto polmonare umano, ii) la valutazione della risposta immunitaria dopo l'esposizione, ad esempio, a prodotti chimici, farmaci, nanoparticelle, ecc., iii) il completamento del tessuto polmonare con le cellule immunitarie, tali come T-linfociti, iv) identificazione e modifica di modelli molecolari, per esempio, dopo l'esposizione a sostanze sensibilizzanti delle vie respiratorie, sostanze che inducono malattia o composti attivi inibendo le vie; Inoltre, v) vie respiratorie che ritoccano e vi) neuronale regolamento32. Campo scientifico è interessato a questi approcci attuali e futuri con tributo. Inoltre, ci sono una varietà di diversi sviluppi che contribuirà a migliorare la tecnica di tributo, quali cryo-conservazione20ed il tessuto stretching33 per imitare il movimento naturale del tessuto durante la respirazione o meccanico ventilazione.

Il principale vantaggio di tributo umano rispetto ad altri modelli 3D è la presenza di cellule immunitarie e fibre nervose. Esperimenti possono essere eseguiti anche nel topo, ratto e primati non umani, che sono le specie animali che più spesso vengono ancora utilizzate in farmacologia e tossicologia. La complessità del tessuto polmonare umano supporta la traduzione dei risultati da animale a uomo e da in vitro in vivo. Nel contesto dei saggi alternativi esistenti per l'identificazione dei sensibilizzatori respiratori, tributo umano è molto complesse e non consentono approfondimenti le risposte delle singole cellule. Eppure, microscopia e flusso cytometry potrebbe dare informazioni su risposte cellulari, se il proprio cellulare marcatore è usato in combinazione, ad esempio, con l'apoptosi, necrosi o marcatori intracellulari. Ci sono saggi pubblicati che sono stati convalidati e segnalati siano stati utilizzati per l'identificazione dei sensibilizzatori respiratori. Tuttavia, i progressi nell'uso di tributo con tutti i loro vantaggi rispetto le analisi unicellulare stanno dando un contributo prezioso nel senso che la tecnica può essere utilizzata per high throughput screening, come descritto da Watson et al. 34 hanno sviluppato un test di screening ad alta resa per predire la tossicità delle vie aeree in murino tributo di crioconservazione. Con il loro formato di tributo 96 pozzetti miniaturizzato, essi rilevati simili letture nel fluido di lavaggio murino, che rende tributo un'analisi di alto-rendimento fattibile.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare. ELEMENTO di Fraunhofer è un'organizzazione indipendente di ricerca senza scopo di lucro pubblica per la ricerca applicata, esecuzione di contratti di ricerca per conto di industrie biotech, farmaceutico, chimico e cosmetico. Finanziamento dell'Istituto proviene da progetti pubblici nazionali e internazionali.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Lan Lauenstein per il suo pre-lavoro per quanto riguarda le strategie di sperimentazione alternative per la valutazione del rischio con tributo umano. Alcune delle ricerche è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Commissione europea nell'ambito del programma quadroth 6 SENS-IT-IV "Novel Testing Strategies for In Vitro Assessment of allergeni".

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo flessibile in silicone 3,0 x 5,0 mmA. Hartenstein (Lipsia, Germania)SS04
SiringaFaust Lab Science (Klettgau, Germania)9,410 050
Strumenti di carotaggiosu misura
(FEATHER)pfm medical ag  (Colonia, Germania)
Lame di rifilatura (FEATHER)pfm medical ag  (Colonia, Germania)205500000
Microtomo: Affettatrice per tessutiAlabama R& D (Bad Homburg, Germania)303400-ADPTAffettatrice per tessuti Krumdieck (MD6000)
Lama per microtomoWilkinson Sword (Solingen, Germania)ENR-4027800011506
Piastre per colture tissutaliSigma (Mü nchen, Germania)Z666246-420EA
Filtro per celle (100 &; micro; m Nylon)Becton Dickinson (Heidelberg, Germania)BD352360
Ciclo di inoculazioneCopan Diagnostics (Murrieta, USA) 
TPP Piastre per coltura tissutale 24wellsSigma (Mü nchen, Germania)Z707791-126EA
CassetteThermo Scientific (Schwerte, Germania)1000957
Nunc MaxiSorp a fondo piattoFisher Scientific GmbH (Hannover, Germania)44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well Thermo Scientific (Schwerte, Germania)260836
Microscopio confocaleZeiss (Jena, Germania)Confocal LSM Meta 510
Software di rendering delle immaginiBitplane AG (Zü rich, Svizzera)IMARIS 7.6
LSM Image BrowserZeiss (Jena, Germania)
Multiwell-ReaderTecan Group Ltd. (Mä nnedorf, Svizzera)Lettore di piastreTecan infinite F200Pro
Agitatore per piastreEdmund Buehler GmbH (Hechingen, Germania)KM-2 Akku
BenchMark ULTRAVentana Medical Systems (Tucson, USA)Sistema automatizzato di colorazione dei vetrini IHC/ISH
Assays
Reagente di proliferazione cellulare WST-1Roche (Basilea, Svizzera)11644807001
Kit per il rilevamento di citotossicità (LDH)Roche (Basilea, Svizzera)11644793001
Colorazione microscopica della vitalità Invitrogen (Carlsbad, USA)L-3224Kit di vitalità/citotossicità LIVE/DEAD
Saggio delle proteine BCAThermo Scientific (Schwerte, Germania)23225
Kit di analisi ELISAR & Sistemi Dvari, ad esempio DY210 (TNF-&alfa;) o DY200 (IL-1&alfa;)DuoSet
ReagentiAgarosio
, bassa temperatura di gelificazione Sigma (Mü nchen, Germania)A9414-100G
Miscele e soluzioni saline bilanciate, colture cellulari, terreni classici e sali, Earle' s Sali bilanciati (EBSS)Sigma (Mü nchen, Germania)E2888-500ML
Penicillina e streptomicinaLonza (Verviers, Belgio)17-602E
Dulbecco´ s Aquila modificata&acuto; s Miscela di nutrienti medi F-12 Prosciutto (DMEM F-12)Gibco (Darmstadt, Germania)11039-047Terreno di coltura
Dulbecco´ s Fosfato con Ca e Mg (DPBS)Lonza (Verviers, Belgio)BE17-513F   Soluzione tampone
Albumina da siero bovino (BSA)Sigma (Mü nchen, Germania)A9647-500G
DetersivoSigma (Saint Louis, USA)X100-100MLTriton X-100
Tampone di lavaggioMerck (Darmstadt Germania)524653  0.05% Tween 20 in PBS
Manico per lama di rifilatura su misura 205530001CD176S01

Riferimenti

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