L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'effetto delle modifiche del glucosio-mediata di respirazione mitocondriale in presenza di composti naturali sulle cellule beta intatto 832/13 utilizzando manometrica ad alta risoluzione.
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Articolo metodologico
Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Respirometry ad alta risoluzione consente la misurazione del consumo di ossigeno di mitocondri isolati, cellule e tessuti. Beta cellule svolgono un ruolo critico nell'organismo di controllo livelli di glucosio nel sangue attraverso la secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio elevato. La secrezione dell'insulina è controllata dal metabolismo del glucosio e la respirazione mitocondriale. Pertanto, respirazione cellulare beta intatto di misurazione è essenziale essere in grado di migliorare la funzione delle cellule beta come un trattamento per il diabete. Utilizzando intatto 832/13 INS-1 derivato beta cellule possiamo misurare l'effetto di aumentare la concentrazione di glucosio sulla respirazione cellulare. Questo protocollo permette di misurare la respirazione cellulare beta in presenza o assenza di vari composti, che permette di determinare l'effetto di composti del giorno respirazione cellulare intatta. Qui dimostriamo l'effetto di due composti naturali, epicatechina monomerica e curcumina, sulla respirazione delle cellule beta in presenza delle condizioni di alto glucosio (16,7 mM) o bassa (2,5 mM). Questa tecnica può essere utilizzata per determinare l'effetto di vari composti sulla respirazione intatto beta cellulare in presenza di diverse concentrazioni di glucosio.
Introduzione
Lo scopo primario della cellula beta pancreatica è di mantenere il sistema normoglycemia attraverso secrezione insulinica glucosio-mediata. Le cellule beta senso cambiamenti fisiologici circolanti di glucosio in gran parte dovuto la bassa affinità, trasportatore di capacità elevata del glucosio GLUT2 (glucosio Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Come aumento del livello di glucosio circolatorio, questo trasportatore di bassa affinità ad alta capacità facilita un aumento proporzionale intracellulare del glucosio all'interno della cellula beta. Glucosio è metabolizzato attraverso la glicolisi, il ciclo del TCA (ciclo dell'acido tricarbossilic....
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Protocollo
1. coltura cellulare
- Cultura INS-1 derivato 832/13 beta cellule in RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina-streptomicina, 10 mM HEPES, 2mm glutammina, 1 mM sodio piruvato e 0,05 mM 2-mercaptoetanolo9,10,11 ,12,13.
- Rimuovere le cellule 832/13 da una boccetta di T75 con 2 mL di soluzione 0,25% tripsina, incubazione a 37 ° C per 10 min. neutralizzare tripsina aggiungendo 8 mL di RPMI 1640 completa per i media.
- Contare le celle utilizzando un emoc....
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Risultati
INS-1 832/13 beta cellule che vengono preparate e raccolti, come descritto nel protocollo dimostrerà modulazione nel consumo di ossigeno basato su vari interventi chimici (Figura 1A). Si osserverà un aumento della respirazione quando la concentrazione di glucosio è aumentata a 16,7 mM glucosio (Figura 1B). Respirazione diminuisce quando le cellule intatte sono trattate con Oligomycin A. Questa respirazione è conosciuta come perdita, che è definito come lo stato .......
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Discussione
L'obiettivo del presente protocollo è utilizzare manometrica ad alta risoluzione per misurare le frequenze respiratorie in cellule beta pancreatiche intatte. Questo metodo consente la misurazione della risposta delle cellule beta ai livelli aumentati del glucosio. Il protocollo consente anche il pretrattamento con vari composti, come dimostrato in questo protocollo con la naturale monomerico epicatechina o curcumina4,5. Trattament.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare i membri dei laboratori Tessem e Hancock per assistente e discussione scientifica. Gli autori ringraziano Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) per fornire la frazione di monomero di cacao epicatechina derivate. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del diabete Action Research and Education Foundation a JST.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Strumento per la respirometria ad alta risoluzione |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Programma per computer per l'analisi della respirometria ad alta reoluizione |
| INS-1 832/13 linea cellulare Duke | University Medical Center | NONE | Linea cellulare Beta, dono del Dr. Christopher Newgard |
| Curcumina | Sigma | C7727 | Pre-trattamento delle cellule beta |
| Epicatechina del cacao monomero | Virginia Polytechnic Institute e State University | NONE | Pre-trattamento delle cellule beta, dono del Dr. Andrew Neilson |
| Tripsina | Sigma | T4049 | Per coltura cellulare |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 media di cellule beta |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30071.03 | Componente del terreno cellulare beta 832/13 |
| Penicillina-streptomicina | Sigma | P4458 | Componente del terreno cellulare beta 832/13 |
| HEPES | Sigma | H3662 | Componente del terreno cellulare beta 832/13/ 1x tampone SAB |
| Glutammina | Caisson | GLL01 | Componente del terreno cellulare beta 832/13 |
| Piruvato di sodio | Sigma | S8636 | Componente del terreno cellulare beta 832/13 |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media componente |
| NaCl | Fisher | S271 | Componente di 10x tampone SAB |
| KCl | Sigma | P9541 | Componente di 10x tampone SAB |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Componente di 10x tampone SAB |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Componente di 10x tampone SAB |
| Soluzione D-(+)-glucosio | Sigma | G8769 | Componente di 1x tampone SAB, prodotto chimico per il saggio respiratorio |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Componente di 1x tampone SAB |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Componente di 1x tampone SAB |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Componente di 1x tampone SAB |
| 200 proof etanolo | Sigma | 459844 | Lavaggio Ossigrafo O2k Camere |
| Oligomicina A | Sigma | O4876 | Sostanze chimiche per il test di respirazione |
| FCCP | Sigma | C2920 | Sostanze chimiche per il test di respirazione |
| Anitmicina A | Sigma | A8674 | Sostanze chimiche per il test di respirazione |
| Kit di proteine BCA | Thermo Fisher | 23225 | Per la determinazione della concentrazione di proteine |
Riferimenti
- Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
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Ristampe e permessi
