Articolo metodologico

L'effetto dell'applicazione dell'olio essenziale di timo sulla carica microbica durante l'essiccazione della carne

DOI:

10.3791/57054

⸱

14 marzo 2018

 ,  ,  , 
1Department of Sustainable Technologies, Faculty of Tropical AgriSciences, Czech University of Life Sciences Prague, 2Department of Quality of Agricultural Products, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Czech University of Life Sciences Prague

In questo articolo

Sommario

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Microrganismi come Escherichia coli che contaminano i prodotti di carne causano malattie di origine alimentare. L'uso di oli essenziali nel processo di essiccazione di carne non è stato profondamente studiato. Qui, presentiamo un metodo novello di applicare olio essenziale di timo di carne durante l'asciugatura per ridurre la carica microbica in carne secca.

Abstract

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La carne è un pasto ad alta percentuale proteica che viene utilizzato nella preparazione di scatti, uno spuntino popolare cibo, dove la conservazione e la sicurezza sono importanti. Per assicurare la sicurezza alimentare e per estendere la shelf life di carne e nei prodotti, l'uso di conservanti sintetici o naturali sono state applicate al controllo ed eliminare batteri di origine alimentare. Un crescente interesse per l'applicazione di additivi alimentari naturali per carne è aumentato. Microrganismi, quali Escherichia coli, contaminano carne e prodotti di carne, causando malattie di origine alimentare. Pertanto, è necessario migliorare il processo di conservazione della carne. Tuttavia, l'uso di oli essenziali quando la carne si è asciugata non è stato profondamente studiato. A questo proposito, c'è un'opportunità per aumentare il valore di carne secca e ridurre il rischio di malattie di origine alimentare mediante l'applicazione di oli essenziali durante il processo di essiccazione. In questo protocollo, presentiamo un metodo novello di applicare olio essenziale di timo (TEO) durante la carne secca, in particolare in forma di vapore direttamente in una camera di essiccazione. Per la valutazione, usiamo la concentrazione inibitoria minima (MIC) per rilevare il numero di batteri nocivi nei campioni trattati rispetto ai campioni di raw. I risultati preliminari dimostrano che questo metodo è un'opzione realizzabile e alternativa ai conservanti sintetici e che riduce significativamente la carica microbica in carne secca.

Introduzione

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Essiccamento come un metodo tradizionale per conservare gli alimenti è stato utilizzato fin dall'antichità. Al giorno d'oggi, c'è un crescente interesse nell'essiccazione come metodo efficace per cibo conservazione1,2,3. Serve per fare una varietà di carni trasformate appositamente. Uno del più ben noto è a scatti.

A scatti, uno dei più antichi metodi per la conservazione di carne, si basa su indurimento e l'essiccazione a bassa attività dell'acqua e quindi di estendere la shelf-life4. Al giorno d'oggi, a scatti come un salume conservato è ancora molto popolare, dove sicurezza alimentare, sapore e consistenza sono essenziali. Preparazione a scatti può essere utilizzato per quasi qualsiasi tipo di carne, tra cui manzo, maiale, pollame o gioco5, e richiede tagliare la carne a strisce magre e asciugarlo. Di solito, marinare la carne in una soluzione di polimerizzazione o fumatori vengono utilizzati insieme ad essiccazione per dare scatti suo sapore caratteristico6.

Nonostante il vasto interesse di essiccazione per conservare il cibo, il rischio di focolai di origine alimentare da Escherichia coli da carne mal secca è fondamentale e deve essere controllata. Ci sono alcuni studi che riferiscono le epidemie di gastroenterite specialmente con e. coli O157: H7, attribuito al calore insufficiente elaborazione durante l'asciugatura a casa. Casi simili si sono verificati anche in preparati commercialmente a scatti7,8,9. Levine et al. 10 proposte che microrganismi di origine alimentare possono sopravvivere condizioni di essiccazione moderate (circa 60 ° C) utilizzate da produttori commerciali a scatti. Escherichia coli O157: H7 focolai di malattie di origine alimentare nel mezzo di 1990 sono stati attribuiti a terra seccato carne prodotti6,11. È interessante notare che, in tutti i casi precedenti, il rischio principale è causato dai batteri patogeni riconosciuti come vitali ma non coltivabili (VBNC). Sotto varie sollecitazioni come variazioni di temperatura o di fame, le cellule di e. coli potrebbero entrare in uno stato particolare conosciuto come il12,di stato VBNC13. Le cellule VBNC possono quindi essere rianimate torna a cellule coltivabili dall'esposizione a condizioni adatte e poi presentano una minaccia per la salute umana a causa di contaminazione alimentare14,15. Questo significa che se la carne viene consumata subito dopo l'asciugatura il prodotto è sicuro. Tuttavia, in caso di insufficiente di stoccaggio, quali una maggiore umidità, c'è un alto rischio di riattivazione di agenti patogeni e la crescita microbica.

Oltre ai metodi di essiccazione e marinata, c'è una forte domanda da parte dei consumatori di utilizzare prodotti naturali come alternativa agli additivi per migliorare il cibo qualità16,17. C'è stato un interesse particolare nell'applicazione di additivi alimentari naturali per la carne invece di conservanti sintetici classica18,19,20,21. Anche se c'è una mancanza di sufficienti prove sperimentali nell'uso di oli essenziali quando si asciuga la carne, le prime ricerche in questo campo dimostra già risultati positivi22,23.

Fin dal Medioevo, persone hanno riconosciuto olio essenziale composti (EHB) per la loro attività antimicrobica, insetticidi e antiparassitari chracteristics24,25,26. Oggi, EHB sono parte di uno del più importante gruppo di sostanze naturali bioattive. Tra i diversi EHB, timolo è uno dei più ben noto. Si compone di più di 85% di TEO23. Questo fenolo impedisce il deterioramento microbico e chimico quando aggiunto al cibo. Inoltre, le sue proprietà antibatteriche potrebbe essere migliorata in combinazione con altri conservanti naturali2,27,28,29,30. Al giorno d'oggi, timo (Thymus vulgaris), un'erba che appartiene alla famiglia delle Labiatae , è stato riconosciuto come agente aromatizzante, nonché un conservante di carne molto efficace31. Uno studio condotto da García-Díez et al. 30 nei prodotti carnei trovato che TEO ha visualizzato un più ampio modello di inibizione contro patogeni di origine alimentare rispetto ad altri oli essenziali. Di conseguenza, c'è un'opportunità per aumentare il valore di carne secca e ridurre il rischio di malattie di origine alimentare mediante l'applicazione di oli essenziali durante il processo di essiccazione.

In questo protocollo, vi presentiamo un nuovo metodo di applicazione di TEO durante la carne secca, specificamente di utilizzarlo in forma di vapore direttamente in un essiccamento dell'alloggiamento. Per la valutazione, usiamo il MIC per determinare l'assenza di batteri patogeni in campioni trattati rispetto a quelli crudi. I risultati preliminari dimostrano che questo metodo è un'alternativa altamente efficace di conservanti sintetici e che riduce significativamente la carica microbica in carne secca.

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Protocollo

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1. preparazione della carne

  1. Ottenere un breve lombo di manzo (carne bovina fresca dal bicipite femorale) da una macelleria locale e trasferimento al laboratorio.
    Nota: Si consiglia di trasportare il lombo di manzo a temperatura ambiente (20-25 ° C), per un periodo non superiore a 20 min in un sacchetto sigillato ermetico.
  2. Per sterilizzare la superficie esterna del muscolo di manzo, in un armadietto, laminare di sicurezza lavare il muscolo spruzzando con etanolo al 70% (v/v) per 10 s utilizzando una bottiglia da 500 mL. Applicare 0,025 g di etanolo per 1 cm2 di superficie di muscolo.
  3. Rimuovere asetticamente la superficie esterna della carne con un coltello per evitare etanolo rimanendo all'interno del muscolo. Rimuovere circa 3 mm all'interno del muscolo per mantenere uniformità superficiale del muscolo.
  4. Pacchetto del muscolo in un sacchetto di plastica sigillato e trasferirlo in un congelatore.
  5. Conservare il muscolo a-18 ° C per 1 giorni. Quindi, scongelare il muscolo congelato a 4 ° C per 6 h.
    Nota: Per lo scongelamento, si consiglia di spostare il muscolo dal freezer al frigorifero.
  6. In un armadietto di sicurezza laminare, tagliare ogni muscolo in fette spesse 0,5 centimetri con un taglio di carne. Quindi, con un coltello tagliate in piccoli 5 × 2,5 cm2 campioni rettangolari.
  7. I campioni di carne rettangolare in sacchetti di plastica del pacchetto e memorizzarli nel congelatore a-18 ° C per un uso successivo.

2. preparazione dell'inoculo standardizzato e procedura di inoculo in un armadietto di sicurezza laminare

  1. Preparare l'inoculo standardizzato (1,5 × 108 CFU/mL) di e. coli ATCC 25922 per inoculare i campioni di carne.
    1. Per la preparazione dell'inoculo da stock, prima di erogare la coltura batterica liofilizzata (consegnata dal fornitore) in una provetta da 15 mL sterilizzata pre-riempita con 10 mL di sterile tamponata Mueller Hinton brodo (BMHB). Coltivare questa sospensione per 24 h a 37 ° C.
      1. Preparare la soluzione di riserva batterica come segue: prendere circa 0,1 - 0,2 mL di sospensione batterica e diluite in una fiala di 20 mL chiuso con un tappo di gomma con un tappo in alluminio pre-riempito con 15 mL di BMHB sterilizzato. Coltivare questa sospensione per 24 h a 37 ° C.
      2. Conservare all'interno del frigorifero a 4 ° C per la preparazione dell'inoculo standardizzato.
    2. Da soluzione di riserva (Vedi punto 2.1.1) di E. coli hanno circa 0,1 - 0,2 mL di sospensione batterica e diluire in una plastica 15 mL sterilizzato tubo pre-riempito con 10 mL di sterile tamponata Mueller Hinton brodo (BMHB). Incubare la provetta a 37 ° C per 24 h.
    3. Per la preparazione dell'inoculo standardizzato (1,5 × 108 CFU/mL), è possibile aggiungere piccole quantità di questa sospensione in una provetta sterilizzata 15 mL pre-riempita con 10 mL di BMHB sterilizzato.
    4. Accuratamente la miscela di vortice e misurare la densità ottica (OD) a 600 nm di un densitometro32.
    5. Ripetere i passaggi 2.1.3 - 2.1.4 fino OD espresso come il valore di McFarland è aumentato di 0,5 rispetto al valore di BMHB pulito.
  2. Per la procedura di inoculo, posizionare i campioni di carne rettangolare in due fogli di alluminio differenti (20 x 30 cm), uno per i campioni di controllo e il secondo per i campioni di carne inoculati.
    1. Sopra il secondo foglio di alluminio, inoculare i campioni di carne cruda rettangolare con 800 µ l della sospensione di batteri del ceppo selezionato (questo corrisponde a 1,2 × 108 CFU per esempio carne) distribuendo uniformemente l'inoculo sulla superficie.
      1. Dispensare 400 µ l su un lato del campione e diffondere delicatamente utilizzando una spatola sterile delle cellule sulla superficie. Lasciarli asciugare per 10 min. Ripetere la stessa procedura per il resto della sospensione su altro lato del campione.

3. asciugatura e applicazione di TEO

  1. Trasferire entrambi fogli di alluminio contenenti i campioni di carne rettangolare dall'armadietto di sicurezza laminare all'asciugatrice: coprire con foglio di alluminio e quindi posizionare i campioni all'interno dell'essiccatore.
  2. Effettuare l'essiccazione in un essiccatore standard di laboratorio.
    Nota: in primo luogo, preriscaldare il forno a 55 ° C. Questa procedura può durare per 20 min.
    1. Asciugare i campioni di controllo per 6 h a 55 ° C, con valori di umidità relativa di aria che vanno da 30-45% di secchezza.
      Nota: Valori di umidità relativa aria essiccazione variano nel tempo a seconda del tasso di evaporazione del liquido dalla carne.
  3. Calcolare il volume di TEO applicato ed esprimere la concentrazione di olio essenziale come un volume di TEO per essiccatore di volume (mL/L d'aria). Ad esempio, la dose di 1,5 mL di TEO in 53 L (volume dell'essiccatore) provoca una concentrazione di aria 0,028 mL/L. Per determinare il MIC di TEO per e. coli, utilizzare dosi di 1,5 mL (0,028 mL/L d'aria), 1 mL (0,019 mL/L d'aria) e 0,75 mL (0,014 mL/L d'aria).
  4. Prima dell'essiccazione, per l'applicazione del TEO vapori (con timolo come il principale composto 79%), immergere un filtro di carta (12 x 20 cm) con una dose di 1,5 mL di TEO e posto in asciugatrice davanti al ventilatore.
  5. Asciugare i campioni di carne TEO trattato utilizzando la stessa procedura per quanto riguarda i campioni di controllo (punti 3.1 e 3.2).
    Nota: Dopo la fine del processo asciugatura e gli esempi sono stati rimossi, accendere il forno per 3 ore a 80 ° C e impostare l'indicazione di valvola aria di sfiato aria 100% al fine di pulire i residui di olio essenziale dal forno.

4. analisi microbica

  1. Prima dell'inoculazione di carne con batteri, esaminare i campioni di carne per qualsiasi adulterazione. L'aspetto di melma e la rilevazione di eventuali odori forti e pungenti sono indicativi di deterioramento di carne. Se la texture si sente viscida, è possibile che i batteri hanno cominciato a moltiplicare sulla superficie della carne.
  2. Per valutare l'efficienza di inoculazione, testare i campioni inoculati crudi per la presenza di e. coli ATCC 25922 e confrontarli con i campioni di controllo non inoculato prima della procedura di essiccazione. Per questo scopo:
    1. Lavare ogni campione di carne (2 campioni di controllo e 2 campioni inoculati). Sospendere ogni campione di carne in un fiasco di sterilizzato con acqua peptonata tamponata (8,5 g di NaCl, 1 g di peptone, 5 compresse di tampone fosfato salino e 1 g di polisorbato 80 in 1 L d'acqua) in un rapporto di 01:10 (p/v) con un range di pH da 7-7.3. Agitare utilizzando un agitatore a 140 rpm per 10 min a temperatura ambiente.
      Nota: Lavare immediatamente dopo la procedura di inoculo.
    2. Valutare il numero di batteri da una regolata procedura di piastra goccia 6 × 6 riassunta da Chen, Nace e Irwin33 su Plate Count Agar (PCA) e MacConkey Agar (MCA).
      Nota: Il metodo di goccia 6 × 6 utilizza il metodo di diluizione micro brodo per preparare diluizioni seriali x10 del campione indagato con una pipetta multicanale, che è meno intensa e più economico rispetto al metodo convenzionale33, di lavoro 34.
    3. Coltivare le diluizioni seriali del campione 10 volte con la procedura di piastra goccia 6 × 6 per la valutazione di e. coli.
      Nota: In particolare per il metodo di goccia 6 × 6, per coltivazione uso sei 5 µ l-gocce, da sei selezionato diluizioni del campione indagato con una pipetta multicanale. Su capsule di Petri opportunamente essiccati, le gocce assorbono rapidamente dentro l'agar e la messa a dimora di questo metodo è molto comodo e maneggevole34.
    4. Incubare le capsule di Petri a 37 ° C per 24 h. Dopo il periodo di coltivazione, è necessario valutare il numero di colonie di e. coli sui piatti Petri (CFU g-1 di carne secca) come descritto nella sezione 5.
  3. Dopo l'asciugatura, prelevare due campioni secchi inoculati e confrontarli con due campioni di controllo non seminato secchi per vitali e. coli, rispettivamente. Per determinare la presenza o l'assenza di e. coli di questi quattro ampie s, eseguire il processo di pre-arricchimento di ogni campione di carne come segue:
    1. Sospendere ogni campione di carne in una boccetta sterilizzata con l'acqua peptonata tamponata (vedere punto 4.2.1) e agitare utilizzando un agitatore a 140 rpm per 10 min a temperatura ambiente. Quindi Incubare ogni beuta a 37 ° C durante 6 h per pre-arricchimento.
    2. Per la valutazione e la coltivazione dei batteri, è necessario seguire la stessa procedura come descritto ai punti 4.2.2 - 4.2.4.

5. esaminare i risultati

  1. Dopo l'incubazione è completa, rimuovere le piastre di Petri da incubatrice e rivedere i risultati come segue:
    1. Per valutare il numero totale delle colonie, esaminare le piastre per la presenza di batteri aerobi mesofili su PCA (macchie bianche) e tipico Escherichia coli colonie (Rossi a rosa scuro) il MCA. Se l'agente patogeno è assente, entrambi agar non presentare nessuna crescita.
    2. Contare le colonie e determinare la quantità di e. coli (CFU/g-1 di carne secca) presenti.
      Nota: Contare il numero di colonie (N) a due diluizioni consecutive contenenti 30 o meno colonie per goccia (Figura 1). Il numero N di CFU/g-1 di carne secca è determinato come segue35
      figure-protocol-1
      dove C è la somma delle colonie su tutte le gocce conteggiati, v è il volume di diluizione del campione utilizzato per goccia (qui, 0,05 mL), n1 è il numero delle gocce utilizzato presso la prima diluizione, n2 è il numero di gocce utilizzato con la diluizione seconda e d rappresenta la diluizione da cui sono stati catturati i primi conteggi.
  2. Per analizzare i dati microbiologici, convertire il numero di colonie di accedere CFU g-1 e sottoporli ad analisi della varianza (ANOVA) per gli effetti principali di trattamento36.
    1. Eseguire il test di Tukey onesta differenza significativa (Tukey HSD) per molteplici confronti media36 e determinare le differenze significative fra i trattamenti.

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Risultati

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Prima avevamo precedentemente sviluppato questo metodo utilizzando olio essenziale di origano (OEO) per migliorare la sicurezza alimentare e aumentare il valore di carne secca. In generale, gli esperimenti precedenti hanno mostrato che e. coli passa allo stato VBNC durante l'asciugatura come strategia di sopravvivenza. Questo è dimostrato dal fatto che non c'erano nessun batteri coltivabili dopo l'essiccazione finito22. Di conseguenza, il processo di pre-a...

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Discussione

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Precedenti ricerche hanno dimostrato che i microrganismi che causano malattie di origine alimentare sopravvivono asciugatura10. Pertanto è necessario applicare conservanti prima dell'asciugatura per assicurare la sicurezza alimentare. In questo studio, ci concentriamo sull'utilizzo di TEO. La ragione è duplice: in primo luogo, c'è una forte domanda da parte dei consumatori di utilizzare prodotti naturali come additivi alternativi per migliorare la qualità di cibo16; In seco...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dall'agenzia interna Grant della facoltà di AgriSciences tropicale, (numero di progetto: 20175013) e il 20182023 di CIGA entrambi concede, da Università Ceca di Scienze della vita.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
TagliacarneKalorikKP 3530di Miami Gardens, FL, USA
Armadio di sicurezza laminareFaster s.r.ldall'Italia
Spremere il flacone da 500 mLMerci632 524 325 025di CZ
Essiccatore da laboratorio standard UFE 400MemmertDE 66812464dalla Germania
IncubatoreBT 120N/Adi CZ
Frigorifero e congelatoreBoschKGN34VW20Gda DE
DensitometroBiosan220 000 050 122Lettonia; fornitore Merci, CZ
Escherichia coli ATCC 25922OxoidCL7050da CZ
VortexChromservis22008013da CZ
Provette in plastica sterilizzate 15 mLGama331 000 020 115da CZ, fornitore Merci
20 ml fiala per iniezioneFiala sanahvft169dalla Cina
20 mm sterile tappo in gomma butilicaMerci22008013da
CZ 20 mm tappo in alluminio FialasanaN / Adalla Cina
Olio essenziale di timoSigma AldrichW306509da St Louis, MO, USA
Mueller Hinton BrodoOxoidCM0337da CZ
NaClPenta16610-31000da CZ
PeptoneOxoidLP0034da CZ
Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma AldrichP4417da CZ
Polisorbato 80 (Tween 80)RothT 13502da DE, fornitore P-lab
Shaker SHO-1DVerkonDH. WSR04020da CZ,  10 - 300 giri/min 350 x 350 mm con piattaforma per palloni
Etanolo 70%BiofermN/Ada CZ
MacConkey AgarOxoidCM007da CZ
Plate Count AgarOxoidCM0325da CZ
Carta da filtroMerci480 622 080 040da CZ
Erlenmeyer palloni 250 mLSimax610 002 122 636da CZ; fornitore Merci CZ
Pipetta multicanaleSocorexS852820dalla Svizzera; fornitore P lab, CZ
Piastra per microtitolazioneGammaV400916CZ
Pipetta per microlitri 100-1000 μ LEppendorf333 120 000 062dalla Germania; fornitore Merci, CZ

Riferimenti

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