Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.
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Articolo metodologico
Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La genetica incorporazione di aminoacidi non canonico (ncAAs) via soppressione di codone di arresto ambra è una tecnica potente per installare sonde spaziali e reattiva moiety su proteine direttamente nella cella dal vivo. Ogni ncAA è incorporato da una dedicato coppia ortogonale soppressore-/ amino-acil-tRNA-sintetasi del tRNA (AARS) che viene importata nell'organismo ospite. L'efficienza di incorporazione di ncAAs differenti possa notevolmente differiscono ed essere insoddisfacente in alcuni casi. Coppie ortogonali possono essere migliorate modificando le RAA o il tRNA. Tuttavia, la diretta evoluzione del tRNA o AARS utilizzando librerie di grandi dimensioni e metodi di selezione morti/vivi non sono fattibili in cellule di mammifero. Qui, è presentata un'analisi di fluorescenza-basata facile e robusta per valutare l'efficienza di coppie ortogonali in cellule di mammifero. Il dosaggio permette lo screening di decine o centinaia di varianti AARS/tRNA con uno sforzo moderato ed entro un termine ragionevole. Uso di questo test per generare nuove tRNAs che migliorano significativamente l'efficienza del sistema ortogonale Pirrolisina è descritto, insieme all'applicazione di ncAAs allo studio di proteine G accoppiate recettori (GPCR), che rappresentano una sfida oggetti per ncAA mutagenesi. In primo luogo, incorporando sistematicamente un foto-reticolazione ncAA su tutta la superficie extracellulare di un recettore, siti di legame di diversi ligandi del recettore intatto vengono mappati direttamente nella cella dal vivo. Secondo, incorporando ncAAs di ultima generazione in un GPCR, recettore privo di catalizzatore ultraveloce etichettatura con un colorante fluorescente è dimostrato, che sfrutta bioorthogonal ceppo-promosso inversa Diels Alder cicloaddizione (SPIEDAC) su cellule vive. Come ncAAs può essere generalmente applicato a qualsiasi proteina indipendentemente dalla sua dimensione, il metodo è di interesse generale per un numero di applicazioni. Inoltre, incorporazione di ncAA non richiede particolari attrezzature e viene facilmente eseguita nei laboratori di biochimica standard.
Introduzione
L'incorporazione di genetica di sonde chimiche in proteine è un metodo potente per lo studio degli aspetti strutturali e dinamici di funzione della proteina direttamente nel contesto nativo della cella dal vivo. Al giorno d'oggi, centinaia di aminoacidi non canonico (ncAAs) equipaggiati con i più disparati gruppi chimici possa essere site-specifically incorporato nelle proteine di biosintesi1,2,3,4. Tra loro, si trova ncAAs fotosensibili come foto-reticolanti5, foto-messo in gabbia6,....
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Protocollo
1. selezione basata sulla fluorescenza delle efficienze di incorporazione (Figura 1)
- Mantenere le cellule HEK293 nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM; alto glucosio, glutamina 4mm, piruvato) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO2.
- Le cellule del seme il giorno prima di transfezione.
- Staccare le cellule per 5 min a 37 ° C in 0.05% tripsina/PBS completati con 0,5 mM EDTA. Usare 1 mL di tripsina/EDTA per un piatto di 10 cm. Dissetare con 10 volumi di terreno completo e risospendere le cellule p....
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Risultati
Il contorno del dosaggio di fluorescenza è raffigurato nella Figura 1. Il dosaggio è impiegato in tre applicazioni. In primo luogo, un numero di varianti di tRNA per l'incorporazione di Lys(Boc) dalla coppia ortogonale Pyl vengono proiettato. Lys(BOC) è un amminoacido stericamente simile a Pyl. Come Pyl non è commercialmente disponibile, Lys(Boc) è comunemente usato come substrato standard per la PylRS. I tRNAs schermato si basano sul tRNAPyl. Ogni.......
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Discussione
Il protocollo descrive un'analisi semplice e affidabile per valutare l'efficienza di coppie ortogonali per l'incorporazione di ncAAs in proteine espresse nelle cellule di mammifero. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto al diffusi saggi basati sulla FACS è che permette la preparazione simultanea e la misurazione di un più grande numero di campioni e fornisce i dati che sono facilmente analizzati utilizzando un software ordinario. La disponibilità di un metodo di media-velocità di trasmissione per analizzare c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun conflitto di dichiarare.
Ringraziamenti
Quest'opera è stata fondata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sotto sovvenzioni CO822/2-1 (programma di Emmy Noether) e CO822/3-1 a I.C.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche | |||
| Acriamide/Bisacrilammide 30% (37,5:1) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Persolfato di ammonio (APS) | Carl Roth | 9592.2 | |
| p-Azidofenilalanina (Azi) | Bachem | F-3075.0001 | |
| Acido borico | Sigma Aldrich | B6768 | |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Carl Roth | 8076.2 | |
| Carbobenzyloxy-L-lisina (Lys(Z)) | NovaBiochem | 8540430100 | |
| Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) | Sichem | SC-8000 | |
| DMEM | Life Technologies | 41966052 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| DTT | Carl Roth | 6908.1 | |
| reagente a chemiluminescenza potenziato (ECL) | 10 mg/l di luminol fatto in casa in 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l acido p-cumarico in DMSO ; 30 % H2O2 (1.000 : 100 : 0,3) | ||
| Gibco) | 10270106 | ||
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher (Gibco) | A1896701 | |
| Glicerolo | Carl Roth | 7533.1 | |
| Glicina | Carl Roth | 3908.3 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| KCl | Carl Roth | 6781.3 | |
| Lipofectamina 2000 | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Luminol | Applichem | A2185,0005 | |
| Metanolo | Carl Roth | 0082.3 | |
| MgCl2 | Carl Roth | 2189.2 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Na-Lattato | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| NaOH | Grü ssing | 121551000 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| acido p-cumarico | Sigma-Aldrich | C9008-1G | |
| bromidrato di poli-D-lisina | Corning | 354210 | |
| PEI | Polysciences | 23966 | |
| Penicillina/Streptomicina | Thermo Fisher (Gibco) | 11548876 (15140-122) | |
| PMSF | Carl Roth | 6367.1 | |
| PNGase F | NEB | P0704L | |
| Inibitore della proteasi | Roche | 11873580001 | |
| membrana PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Latte scremato in polvere | Sigma | 70166 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Carl Roth | CN30.2 | |
| Tetrazina-Cy3 | Jena Bioscience | CLK-014-05 | |
| Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | |
| trans-Ciclooctene-L-lisina (TCO*K) | Sichem | SC-8008 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tripsina 2,5% | Thermo Fisher (Gibco) | 15090046 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.2 | |
| Wasserstoffperoxid (30%) | Merck | 1.07210.0250 | |
| Linee cellulari | |||
| HEK293 cellule | Tedesco Collezione di Microrganismi e colture cellulari GmbH (DSMZ) | ACC-305 | |
| HEK293T cellule | Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari GmbH (DSMZ) | ACC-635 | |
| Equipment | |||
| Crosslinker Bio-Link 365 nm | Bio-Budget Technologies GmbH | 40-BLX-E365 | 5 provette da 8 Watt |
| Lettore di piastre BMG LABTECH FLUOstar Omega | BMG LABTECH | ||
| strong>Plasmidi | |||
| Plasmide E2AziRS | Il gene uminizzato per E2AziRS è stato sintetizzato da Geneart (Life Technologies) | Plasmide contenente 4 copie tandem del tRNA soppressore Bst-Yam guidato dal promotore umano U6 e una copia di un gene umanizzato per la variante potenziata dell'Azi-tRNA sintetasi (EAziRS) guidata da un promotore | |
| PGKPlasmidi mutanti | Plasmide codificante il POI guidato dal promotore CMV, fuso C-terminalmente al FLAG-tag, recante un codone TAG nella posizione desiderata. | ||
| CRF1R-95TAG-EGFP | Clonato nell'MCS di pcDNA3.1 | ||
| HA-PTH1R-79TAG-CFP | Clonato nell'MCS di pcDNA3.1 | ||
| Arrestin3-FLAG | Sintetizzato da Genart (Life Technologies) | Clonato nell'MCS di pcDNA3.1 | |
| Antibodies | |||
| Anti-FLAG-HRP M2 coniugato anticorpale | Sigma-Aldrich | A8592 | monoclonale, prodotto nel clone di topo M2 |
| Anticorpo HRP di capra-anti-coniglio | Santa Cruz | sc-2004 | |
| Anticorpo anti-CRF di coniglio | PBL | fatto in casa | policlonale Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., e Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999) |
| Anticorpo di coniglio-anti-Ucn1 | fatto in casa | PBL #5779 | policlonale Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., e Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999) |
Riferimenti
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-....
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Ristampe e permessi
