Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per la produzione controllata di microcristalli di proteina. Il processo utilizza un dispositivo automatico che permette la manipolazione controllata di diversi parametri di cristallizzazione. La cristallizzazione della proteina avviene mediante aggiunta automatizzata e controllata di soluzioni di cristallizzazione durante il monitoraggio e indagare la distribuzione di raggio delle particelle nella gocciolina di cristallizzazione.

Abstract

Il dispositivo automatico di cristallizzazione è una tecnica brevettata¹ appositamente sviluppato per il monitoraggio di esperimenti di cristallizzazione della proteina con l'obiettivo di manovrare precisamente la nucleazione e crescita dei cristalli verso formati voluti dei cristalli della proteina. La cristallizzazione controllata è basata su esempio di analisi con in situ Dynamic Light Scattering (DLS), mentre tutti i cambiamenti visivi a goccia sono monitorati online con l'aiuto di un microscopio accoppiato ad una fotocamera CCD, consentendo in tal modo un pieno indagine della goccia proteina durante tutte le fasi della cristallizzazione. L'utilizzo di in situ misurazioni DLS in tutto l'intero esperimento permette una precisa identificazione della soluzione della proteina altamente supersatura transizione ad una nuova fase – la formazione di nuclei di cristallo. Identificando la fase di nucleazione della proteina, la cristallizzazione può essere ottimizzata da cristalli di grandi proteine per la produzione di proteina microcristalli. Il protocollo sperimentale Mostra una cristallizzazione interattiva approccio basato su precisi passaggi automatizzati come precipitante aggiunta, l'evaporazione dell'acqua per soprasaturazione alta d'induzione, e diluizione del campione per il rallentamento indotto nucleazione omogenea o transizioni di fase di retromarcia.

Introduzione

Negli ultimi anni, la crescita delle proteine micro e nanocristalli ha catturato l'attenzione della comunità di cristallografia di proteine, soprattutto con lo sviluppo continuo di Serial Femtosecond Crystallography (SFX). Dovuto la brillantezza della radiografia romanzo radiazione fonti e basato sui risultati di successo ottenuti finora, la produzione di proteine micro - e nanocristalli sono diventata di grande rilevanza, che propone una forte domanda sulla preparazione di tali sospensioni cristalline ^{2 , 3}. a causa della dimensione di piccolo cristallo-gamma necessaria per la raccolta di dati a laser ad elettroni liberi (XFELs) e la limitata disponibilità di valutazione sperimentale, caratterizzazione del campione prima della raccolta dei dati è essenziale. Le più comuni tecniche per caratterizzare sospensioni di micro - o nanocristallo di proteina sono fino ad ora la microscopia elettronica e diffrattometria di raggi x.

Finora, diversi approcci sono stati adattati da metodi di cristallizzazione comuni con l'obiettivo di produrre quantità di massa di cristalli di proteine con dimensioni nella gamma piccola micrometro. Il metodo batch viene utilizzato per la miscelazione veloce di alta proteina concentrata e soluzioni precipitante, costringendo così la soluzione di esempio ad una fase altamente supersatura dove nanocrystallization potrebbe essere favorito⁴. Altri metodi includono schiacciamento cristalli di grandi proteine per formare un impasto di cristallo, che può servire come nanocristallino sospensioni da utilizzare per la raccolta di dati⁵. Tuttavia, i risultati a volte potrebbero causare in qualità di diffrazione in diminuzione, come deteriorato i cristalli hanno ordine interno inferiore. Nanocrystallization basati sulla interfaccia libera diffusione è anche un'alternativa disponibile, dove soluzione proteica viene aggiunto in piccole quantità per una soluzione precipitante altamente concentrato³. Tuttavia, tra tutte le tecniche, le metodologie più efficaci sembrano essere la cristallizzazione di batch e più innovative tecniche manipolative, utilizzando metodi di diffusione del vapore in seduta gocce⁶.

In generale, per la cristallizzazione di una proteina una barriera di energia dovrà essere attraversata per supportare nucleazione - il primo passo termodinamico nella formazione di cristalli. In ordine di spostare la soluzione della proteina da uno stato termodinamicamente stabile a soprasaturazione e infine per indurre una transizione di fase, alcune variabili legate alla soluzione della proteina devono essere modificato. Tali variabili sono solitamente la concentrazione della soluzione della proteina, modifiche ambientali (ad es., temperatura, umidità), caratteristiche di solvente (ad es., pH, forza ionica), proprietà di concentrazione e buffer, ecc^{7 ,8} una panoramica dei parametri di esempio che può essere cambiata è rappresentata solitamente per mezzo di diagrammi di fase, che consentono diverse modalità di presentazione, come solubilità diagrammi, diagrammi di fase di nucleazione o anche più dettagliate descrizioni di cui diagrammi tridimensionali o più complessi possono venire in considerazione^8,9,10. I tipi più attraenti di diagrammi di fase sono solitamente bidimensionali, dove la principale variabile è la concentrazione di proteine in funzione di un altro parametro, mentre i restanti parametri sono mantenuti costanti^6,11. Una volta che uno o pochi nuclei si formano, più grandi cristalli possono crescere prendendo le altre proteine dalla soluzione alla rinfusa. Quando si mira per la produzione di micro - e nanocristalli, un tale approccio di cristallizzazione convenzionale non è fattibile piu ' dovuto il piccolo numero di cristalli che sono presenti in soluzione. Nanocristallino sospensioni solitamente devono essere ricca in entità cristallina, così che la via di cristallizzazione deve essere riadattato, tale che esiste una maxima di eventi di nucleazione presenti nel campione. Di conseguenza, questo richiede l'indagine di alcuni nuovi, fino alle vie di nucleazione ora inesplorate per le proteine, che sono anche ancora non pienamente compreso^12,13. Basato sui fondamenti del diagramma di fase accennati in precedenza, la teoria classica è stata estesa a una nuova ipotesi, dove nucleazione è descritta come un meccanismo in due fasi: in un primo momento, una transizione verso una maggiore concentrazione di proteine avviene (liquido denso fase) e la seconda, una transizione da una fase densa ricco a un più alto ordine interno (nuclei di cristallo con l'architettura della grata)^14,15,16. Cristallizzazione della proteina è sensibile a molti fattori, e quindi quando ricette di cristallizzazione sono riadattate per provocare i cristalli di dimensioni diverse, le ricette non possono sempre contare sulla conoscenza precedente. Nuove intuizioni devono essere stabiliti per ogni destinazione di singole proteine: regolazione della composizione di buffer, la purezza e la stabilità del campione, precisa conoscenza di solubilità di proteine, ecc.

Diffusione dinamica della luce è oggi un metodo ben consolidato per analisi e ottimizzazione dei processi di cristallizzazione di proteine, a causa di una vasta gamma di dimensioni di particelle che possono essere studiate: dalle proteine monomeriche di nanocristalli e piccolo microcristalli. Il metodo sfrutta che particelle in soluzione subiscono il moto browniano e che la velocità media di questo movimento è determinata dalla dimensione delle particelle, loro energia termica e dalla viscosità del mezzo e la geometria delle particelle. In un primo momento, il mezzo liquido è illuminato da una sorgente luminosa coerente con l'uso di un laser. La luce diffusa dalle particelle si sta formando un modello di interferenza. Perché le particelle sono in moto permanente la figura di interferenza cambia anche definitivamente. Quando si cerca in una certa direzione, fluttuazioni di intensità possono essere osservate. Queste fluttuazioni sono ora Mostra il movimento delle particelle causato dal moto browniano. Dalle fluttuazioni di intensità misurata viene calcolata una funzione di autocorrelazione (ACF). Un'analisi del file ACF darà una misura per la distribuzione di velocità (più precisamente il coefficente di diffusione) di particelle e utilizzando l'equazione di Stokes-Einstein, viene convertito in un raggio di particelle distribuzione¹⁷. Ulteriori informazioni relazionati alla funzionalità DLS e principio di funzionamento possono essere trovati in varie pubblicazioni e libri^18,19.

Qui applichiamo e descrivere un dispositivo unico cristallizzazione automatizzata, il XtalController900, una versione aggiornata del XtalController tecnologia⁶, sviluppato proprio per il monitoraggio di esperimenti di cristallizzazione della proteina interattiva. Questa tecnica Mostra un alto potenziale per identificazione e monitoraggio di eventi di nucleazione in tempo reale, permettendo una precisa manovra attraverso il diagramma di fase di cristallizzazione. Lo scopo di questa procedura di cristallizzazione particolare è quello di ottimizzare la cristallizzazione di proteine per ottenere proteine di alta qualità micro - e nanocristalli che sono adatti per applicazioni che utilizzano sorgenti di raggi x di sincrotrone micro-focalizzato, diffrazione dell'elettrone, o SFX.

Protocollo

Nota: Durante l'intero protocollo, il sistema di micro-dosaggio utilizzato per aggiunta di acqua sarà essere definito come Pump0 mentre il sistema di micro-dosaggio utilizzato per aggiunta di precipitante verrà chiamato Pump1. I risultati di questo esperimento saranno ulteriormente discusse e indicati come THM2_micro-cristalli.

1. parametri e installazione soluzione

1. Filtro 16 mL di soluzione di Na-tartrato (1,2 M) e 16 mL di acqua distillata usando un filtro di siringa sterile 0,2 µm.
   Nota: La soluzione di Na-tartrato rappresenta la soluzione precipitante per l'esperimento di cristallizzazione.
2. Riempire il precipitante e bottiglie d'acqua con 5 mL delle soluzioni filtrate.
   Nota: Le bottiglie hanno una capacità massima di 5 mL.
3. Montare le bottiglie nei supporti pompa della camera sperimentale.
4. Impostare i parametri sperimentali nella finestra del software per i seguenti valori: temperatura a 20 ° C, umidità relativa alle 20 e il solvente come l'acqua.
   Nota: La figura 2 Mostra la finestra di visualizzazione dove l'utente può inserire i valori corretti per ciascun parametro come temperatura, umidità relativa e solvente. La finestra di software Mostra anche alcuni parametri aggiuntivi come additivi. Questo è importante per gli esperimenti, solo, dove gli additivi sono presenti nella soluzione precipitante.
5. Aprire lo sportello anteriore della camera sperimentale e rimuovere il supporto di vetrino coprioggetti.
6. Sistemare un coprioggetto pulito e siliconato sul supporto e inserirlo nel dispositivo.
   Nota: Il vetrino coprioggetto ha una dimensione di 2,2 cm.
7. Chiudere la camera sperimentale per fissare le condizioni ambientali da passo 1.4.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. micro-dosaggio sistemi regolazione

1. Interruttore ON Pump0 utilizzando le principali caratteristiche della pompa in Figura 3 e creare un flusso di acqua.
   Nota: La traiettoria del flusso di acqua viene creata in base su alcune caratteristiche della pompa che possono essere regolate. La figura 3 Mostra le caratteristiche della pompa principale e i valori ottimali che devono essere utilizzati per questo esperimento.
2. Regolare il flusso di acqua che mira la posizione verso il centro del coprivetrino azionando manualmente la vite di regolazione designato. Interruttore OFF Pump0.
3. Interruttore ON Pump1 e creare un flusso di liquido come precedentemente fatto al punto 2.1. Regolare la posizione del flusso di Pump1 verso la posizione fissata per Pump0. Interruttore OFF Pump1.
4. Sostituire il coprioggetto usato con una nuova e pulire uno per l'esperimento di cristallizzazione.
   Nota: Salviette morbide vengono solitamente raccomandate per la pulizia il coprioggetto nuovo da residui di polvere, prima di essere utilizzati nell'esperimento cristallizzazione.

3. impostazione di una goccia di taumatina nella camera sperimentale

1. Creare un nuovo file sperimentale utilizzando il pacchetto software. Immettere le seguenti informazioni nel file sperimentale: proteina (taumatina da Thaumatococcus daniellii), la concentrazione di proteina (14 mg/mL), precipitante (Na-tartrato) e precipitante concentrazione (1,2 M).
   Nota: Queste informazioni serviranno per calcoli automatizzati della concentrazione della proteina e precipitante durante l'esperimento di cristallizzazione.
2. Caricare il nuovo file di esperimento per attivare tutte le informazioni dal punto 3.1.
3. Segnare la posizione della goccia proteina aggiungendo una goccia di acqua piccolo utilizzando Pump0.
   Nota: L'obiettivo è creare una goccia di acqua piccola che servirà come punto di riferimento sul quale si collocherà il campione della proteina.
4. Premere il tasto Tara per impostare il peso dato dalla microbilancia a zero.
   Nota: Verranno rimossi il peso del coprivetrino e il peso supplementare aggiunto dal punto di riferimento di acqua piccolo creato al punto 3.3.
5. Aprire il coperchio superiore della camera sperimentale e 8 µ l di soluzione di taumatina sul punto di riferimento di acqua.
6. Registrare la nuova diminuzione taumatina seguendo i comandi successivi.
   1. Premere il pulsante New scendono ad attribuire le condizioni iniziali del file sperimentale.
   2. Premere il tasto Const per compensare l'evaporazione naturale dell'acqua dal droplet.
7. Verifica con la telecamera CCD se Pump0 sta mirando alla goccia di proteina. Se il flusso di acqua è volto all'esterno la goccia, regolare nuovamente la posizione di Pump0.
   Nota: Da questo momento in poi, la goccia di proteina rimarrà un peso costante, tramite l'aggiunta dell'acqua automatico che compensa l'evaporazione naturale dell'acqua la goccia di proteina. Il peso di goccia della proteina, come pure gli altri parametri quali temperatura e umidità relativa possa essere monitorato in tempo reale utilizzando la finestra di visualizzazione. L'esperimento può essere messo in pausa qui.

4. in Situ misurazioni DLS

1. Interruttore su liste di distribuzione laser e posizionare il raggio laser nella proteina goccia manualmente usando le viti di regolazione.
2. Inserire i seguenti parametri DLS: durata di misurazione (60 s), tempo di attesa tra due misurazioni (10 s) e numero delle misurazioni (300).
   Nota: Le prime 30 misurazioni servirà come misure di riferimento per la stabilità della proteina-controllo. Il resto delle misurazioni servirà come un'indagine completa della goccia della proteina durante la lunghezza totale del processo di cristallizzazione.
3. Premere il pulsante Start per avviare le misure di liste di distribuzione. Controllare la qualità del campione selezionando una delle rappresentazioni grafiche DLS.
   Nota: L'esempio dovrebbe mostrare un alto grado di mono-dispersità, senza qualsiasi aggregazione nella soluzione. I risultati DLS possono essere mostrati e leggere come: distribuzione di raggio, istogramma di raggio, raggio trama, misure sommarie, o come una panoramica dell'intensità di frequenza di conteggio.

5. esempio evaporazione passaggio

1. Immettere le condizioni per il passaggio di evaporazione nella tabella di computo utilizzando i dati riportati nella tabella 1.
   Nota: Il segno "-" introdotto nella colonna "Molarità/percentuale" nella seconda riga rappresenta una perdita di acqua dal droplet della proteina, mentre il valore "25" significa che il volume delle gocce subiranno una riduzione del 25%. Questo significa che la concentrazione nella proteina della goccia aumenterà con il 25%.
2. Attivare la fase di evaporazione del campione premendo il pulsante Autom. Premere il pulsante Stop quando ha terminato la fase di evaporazione del campione.
3. Attivare il pulsante Const per mantenere costante la caduta dopo l'arresto l'evaporazione del campione.

6. precipitante aggiunta punto

1. Immettere le condizioni per il passaggio di precipitante aggiunta nella tabella di computo illustrato nella Figura 4 utilizzando i dati forniti nella tabella 2.
   Nota: La prima riga della tabella rappresenta una fase di calibrazione, durante il quale il software calcola il tasso di evaporazione naturale della goccia proteina basata sulla quantità di precipitante che dovrà essere aggiunto alla goccia di proteina. Il software Estrapola questo valore e regola automaticamente la frequenza di tiro per Pump0 al fine di compensare automaticamente l'evaporazione di acqua per il prossimo passo di aggiunta precipitante.
2. Attivare il precipitante aggiunta punto premendo il pulsante Autom.
   Nota: L'aggiunta di precipitante è un processo automatico, seguendo l'input da tabella di computo.

7. traccia l'evoluzione della goccia cristallizzazione nel tempo

1. Controllare l'aspetto dei cristalli taumatina usando la telecamera CCD.
2. Controllare la distribuzione di dimensione delle particelle utilizzando le rappresentazioni grafiche di liste di distribuzione.
3. Controllare l'evoluzione del peso e parametri sperimentali utilizzando la finestra di visualizzazione.
   Nota: Quando la soluzione di Na-tartrato raggiunge una concentrazione di 0,74 M nella goccia della proteina, la goccia si arricchisce di taumatina micro-cristalli come illustrato nella Figura 7.

8. recupero di cristallizzazione della gocciolina

1. Cappotto di una piastra Terasaki pulito standard con olio di paraffina.
   1. Aggiungere 3 mL di olio di paraffina alla piastra.
   2. Disperdere l'olio di paraffina su pozzetti piastra spostando delicatamente la piastra a diverse angolazioni in modo che l'olio copra tutti i 72 pozzetti della piastra.
   3. Rimuovere l'eccesso di olio di paraffina versando l'olio che galleggia sulla piastra.
2. Premere il pulsante Stop per finire l'esperimento di cristallizzazione. Togliere con attenzione il vettore di esempio contenente la goccia di cristallizzazione.
3. Con l'uso di una pipetta, prelevare una quantità di 2 aliquote µ l della cristallizzazione goccia nei pozzetti della piastra Terasaki.
   Nota: Recuperando la gocciolina di cristallizzazione in un piatto sotto olio, il campione può essere periodicamente controllato per stabilità e crescita dei cristalli con l'uso di un microscopio o altre tecniche di liste di distribuzione che funzionano con Piastre Terasaki standard.

Risultati

I risultati ottenuti da misurazioni DLS durante l'esperimento di cristallizzazione mostrano un'evoluzione dettagliata dei raggi idrodinamico particella risultante in due frazioni di distribuzione principale delle particelle, che si sviluppano nel tempo. Nella prima parte dell'esperimento, il campione è stato lentamente evaporato, al fine di ottenere una maggiore concentrazione di proteine. Come mostrato in figura 5B, la goccia di proteina è stata concentrata da 14 mg/mL a 19,5 mg/mL. Durante questo periodo, secondo il modello di distribuzione radiale in Figura 5A, la proteina Mostra un comportamento monomerico nella soluzione con una granulometria costante di circa 2,5 nm. Come l'esempio è ulteriormente essere evaporato, la proteina monomerica rimane stabile in soluzione, senza segni di denaturazione o di aggregazione di esempio.

L'aggiunta di soluzione precipitante per la caduta di proteina è immediatamente iniziata dopo l'evaporazione di campioni e lumeggiato con grey nelle curve raggio modello ed equilibrio di distribuzione per una migliore visualizzazione (Figura 5). Basata sui calcoli derivati dal peso del campione, la frazione di particelle evidenziata è attribuita all'iniziazione di nucleazione del cristallo, risultante in una dimensione di raggio di circa 200-400 nm. Questo fenomeno (noto come nucleazione) viene avviato ad una concentrazione precipitante di 0,6 M nella gocciolina di proteina, in un periodo di tempo di circa 66 min dall'inizio del esperimento e circa 23 min rispetto all'avviamento del precipitante aggiunta. Come la concentrazione del precipitante aumenta, la distribuzione di raggio Mostra un'ampia distribuzione delle particelle in soluzione. Come forma più nuclei, l'iniziale cristallina entità stanno crescendo in dimensione, raggiungendo una distribuzione di raggio tra 800-1.300 nm. Si può concludere che in questa fase, i nuclei di cristallo continuano a crescere, e la frazione proteica sta gradualmente diventando più povera come le molecole di proteina sono presi-up da microcristalli. Come la concentrazione precipitante nella goccia proteina aumenta lentamente, la formazione di microcristalli facilmente identificata dopo 75 min, quando la distribuzione di raggio continua a svilupparsi tra 500 e 1.500 nm. L'evoluzione della distribuzione raggio è confermato anche da immagini della telecamera CCD, dove la proteina microcristalli sono visibili ad una concentrazione precipitante di 0,7 M in soluzione (Figura 7). Come l'aggiunta precipitante è finito e la goccia di cristallizzazione è mantenuta costante, la distribuzione di raggio Mostra una fase predominante tra 1.000 e 3.000 nm, mentre la frazione di eventi di nucleazione diminuisce nel tempo. In questo momento, la goccia di cristallizzazione è completamente saturo con microcristalli e nessun ulteriore evento di nucleazione è presente in soluzione.

Utilizzando come input sperimentale i dati di feedback dati dalla microbilancia, un diagramma di fase di cristallizzazione è stato disegnato per una comprensione globale del processo di cristallizzazione taumatina. In Figura 6, il diagramma di fase sperimentale mostra tre esperimenti di cristallizzazione indipendente, dove la produzione di taumatina T. danielli microcristalli è etichettata come THM_2 Micro-cristalli (protocollo). Due esperimenti di cristallizzazione aggiuntive con etichetta THM_1 Macro-cristalli e THM_3 Macro-cristalli sono stati utilizzati come dati di input al fine di avere una corretta mappatura delle diverse aree del diagramma di fase (ad es., solubilità o regione metastabile). Poiché i protocolli per questi esperimenti seguono percorsi diversi di cristallizzazione, l'identificazione della regione nucleazione diventa più facile e quindi più accurata. Per ogni esperimento, il percorso di cristallizzazione è evidenziato dal numero di ordine per sottolineare i diversi approcci e numero di passaggi di cristallizzazione che sono stati utilizzati per un risultato specifico, mentre le frecce grigia rappresentano una stima della proteina finale concentrazione di molecole proteiche gli assorbimenti di cristallo crescita da soluzione nella formazione di ben definiti stabili cristalli della proteina.

I tre esperimenti di taumatina presentati nella Figura 6 mostrano diverse condizioni quando si entra la regione di nucleazione ed esiti di cristallizzazione finale quindi diversi come esso possono essere visto dalle foto sotto il diagramma di fase. Nel caso di THM1 e THM3, la soluzione della proteina passa la fase di nucleazione e ri-entra nella regione metastabile, dove riposa fino a forma di cristalli. Di conseguenza, gli esperimenti portano a grandi cristalli a forma ben definiti, circondati da acqua madre. Tuttavia, per l'esperimento presentato nella sezione protocollo, THM2_micro-cristalli, il percorso di cristallizzazione segue un approccio particolare. In una sezione precedente abbiamo accennato che per un campione di microcristalli di dare, la soluzione della proteina deve trovarsi nel profondo la fase di nucleazione, affinché gli eventi di nucleazione possono formare a una velocità massima. Nel caso di THM2_micro-cristalli, il rapporto della proteina a concentrazione precipitante è stato regolato in modo tale che il campione entra non solo nella regione di nucleazione, ma come un precipitante ulteriore viene aggiunto alla soluzione della proteina, e le condizioni non spostare un'altra regione del diagramma di fase, ma rimangono in uno stato altamente supersatura all'interno della regione di nucleazione. Di conseguenza, l'entropia della soluzione diminuisce drasticamente come la goccia di proteina immediatamente diventa saturo di piccole entità cristallina.

Figura 1. Rappresentazione schematica dell'esperimento cristallizzazione. Il disegno mostra una panoramica della sezione sperimentale di cristallizzazione con tutte le parti tecniche necessarie per lo svolgimento di un esperimento di cristallizzazione automatizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: finestra del Software per le liste di distribuzione e i parametri di esempio che sono rilevanti per un esperimento di cristallizzazione. I parametri includono temperatura, umidità, viscosità, ecc.

Figura 3: finestra di controllo del Software per i sistemi di micro-dosaggio coinvolti nell'esperimento cristallizzazione. Le caratteristiche permettono la regolazione di parametri specifici per la generazione del flusso di soluzione o di goccioline.

Figura 4: finestra del Software per la tabella di computo che descrivono le fasi di cristallizzazione coinvolte nell'esperimento. Le condizioni iniziali della goccia cristallizzazione sono integrate anche in questa finestra.

Nella figura 5. Panoramica di taumatina produzione di microcristalli di T. daniellii . (A) distribuzione di dimensione delle particelle nella goccia della proteina durante il processo di cristallizzazione intero. (B) monitorati Panoramica dei parametri sperimentali. I grafici rappresentano l'evoluzione nel tempo per il peso della goccia della proteina (curva nera) insieme con la concentrazione di proteine calcolato (curva rossa) e la concentrazione precipitante (curva blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: schema di fase di cristallizzazione sperimentale per taumatina T. danielli così come i risultati risultanti. Tutte le piazzole sono derivate da dati sperimentali, sulla base delle informazioni di feedback date dalla microbilancia. I numeri attribuiti a ogni esperimento che sono visibili tra parentesi rappresentano l'ordine e il numero di passi compiuti durante un protocollo di cristallizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: registrato fotografia per THM2_Micro-cristalli (protocollo) mostrando un numero abbondante di microcristalli saturata in soluzione. La foto è stata scattata a 4 h (240 min) dopo aver impostato la goccia di proteina nella camera sperimentale per cristallizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: registrato fotografia per THM_1 Macro-cristalli risultati stabili in soluzione alcuni cristalli di grandi dimensioni taumatina. La foto è stata scattata 20 h dopo aver impostato la goccia di proteina nella camera sperimentale per cristallizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: registrato fotografia per THM_3 Macro-cristalli mostrando varie dimensioni di taumatina cristalli nella soluzione. La foto è stata scattata 20 h dopo aver impostato la goccia di proteina nella camera sperimentale per cristallizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sostanza	Molarità/percentuale	Tempo (s)
acqua	0	100
acqua	-25	2100
acqua	0	2100

Tabella 1: Ingresso di pianificazione automatizzata per l'evaporazione del campione passo nella produzione di microcristalli taumatina.

Sostanza	Molarità/percentuale	Tempo (s)
acqua	0	100
prec	0,8	1800
acqua	0	18000

Tabella 2: ingresso di pianificazione automatizzata per l'aggiunta di precipitante passo nella produzione di taumatina microcristalli.

Discussione

Il dispositivo di cristallizzazione è progettato per monitorare e modificare i parametri cruciali durante un esperimento di cristallizzazione basato su un metodo modificato vapor-diffusione. Questa tecnica consente il monitoraggio e segnando un esperimento di cristallizzazione della proteina in tutte le fasi, permettendo all'utente di avere una conoscenza precisa e il controllo della soluzione della proteina durante il diagramma di fase di cristallizzazione, basato su in situ analisi DLS della sospensione del campione.

Il dispositivo di cristallizzazione comprende una camera sperimentale (Figura 1) collegata a una telecamera CCD che consente di monitorare in tempo reale la goccia di cristallizzazione. La fotocamera è adattata ad un microscopio dotato di lenti di ingrandimento diverse, fornendo una massima risoluzione spaziale di circa 2,5 µm. Il nucleo della camera sperimentale è una microbilancia ultrasensibile per seguire l'evoluzione del peso campione nel tempo. La procedura di cristallizzazione corrisponde a un esperimento di seduta-goccia vapor-diffusione, dove la goccia di proteina è posta su un vetrino coprioggetti siliconato, che si trova sulla microbilancia. Sulla base delle variazioni di peso della goccia, sono causate da precipitante aggiunta, aggiunta di additivo/acqua o evaporazione di campioni, la microbilancia dà un preciso input per un algoritmo per il calcolo immediato della concentrazione proteica e precipitante nel tempo . Inoltre, parametri di cristallizzazione importanti quali temperatura e umidità relativa precisamente sono monitorati e controllati.

Al fine di eseguire un esperimento di cristallizzazione, il dispositivo è dotato di due sistemi di micro-dosaggio (contattare gratis pompe piezoelettriche) che lavorano in una scala di picolitri per aggiunta di acqua e precipitante. Lavorando con tali piccole quantità di sostanza, i gradienti di concentrazione e il fenomeno di convezione all'interno della gocciolina di proteina sono ridotti al minimo. Il ruolo principale delle pompe piezoelettriche è l'aggiunta di acqua, quest'ultimo ad esempio utilizzato come compensazione per evaporazione naturale della goccia della proteina o precipitante. I sistemi di micro-dosaggio hanno un set di caratteristiche, che possono dettare l'aggiunta di una sostanza. Tali caratteristiche includono: il tasso di ripetizione per l'aggiunta di una sostanza, il numero di goccioline aggiunto al secondo, la larghezza e l'altezza della traiettoria del flusso di sostanza, ecc. Inoltre, la posizione delle pompe può essere regolata manualmente, consentendo all'utente di avere una posizione precisa per l'aggiunta di sostanze nella goccia di proteina.

La manipolazione del feedback unico controllato della goccia cristallizzazione si ottiene in situ dati DLS, che possono mostrare eventuali cambiamenti nello stato proteina oligomerica durante tutta la procedura sperimentale. La tecnica permette la costante valutazione della distribuzione di dimensione delle particelle nel tempo, rivelando così sconosciuti meccanismi correlati della proteina. L'attrezzatura ottica DLS è posizionato strategicamente sotto l'area del vetrino coprioggetto, permettendo il fascio laser e rilevatore di passare attraverso il vetrino coprioggetto e ulteriormente attraverso la goccia di proteina in una moda in situ ; Pertanto, solo le modifiche entro la goccia vengono registrate dal percorso DLS. Per consentire un'agevole manipolazione, il dispositivo è dotato di due aperture: una porta d'ingresso per un posizionamento ottimale del vetrino coprioggetto e un coperchio superiore che può essere rimosso, in modo che l'utente può regolare la posizione di tiro dei sistemi micro-dosaggio nonché impostando con precisione un nuova proteina dro plet sul vetrino coprioggetti.

Il metodo di cristallizzazione interattiva utilizzando il dispositivo di cui sopra è una tecnica affidabile per la produzione di dimensione-controllata di cristalli della proteina. Anche se molti metodi di cristallizzazione sono attualmente disponibili, informazioni interne sulla cristallizzazione meccanismo stesso non è facilmente realizzabile. In generale, l'applicazione di metodi convenzionali di cristallizzazione consente solo un controllo limitato su una soluzione nel diagramma di fase di cristallizzazione, con solo poche possibilità di cambiare il suo corso una volta che ha iniziato un esperimento. Durante l'esecuzione di una cristallizzazione sperimentare e applicando tale una tecnologia di cristallizzazione automatizzata accoppiata con in situ DLS, una grande quantità di conoscenze è maturata sulle transizioni del diagramma di fase. In generale, le regioni con conseguente precipitato amorfo e l'induzione di nucleazione omogenea sono vicino a vicenda del diagramma di fase. Pertanto, modificando il corso di una goccia di cristallizzazione basata su informazioni in tempo reale della distribuzione delle particelle, è possibile evitare la precipitazione di una proteina regolando gradualmente le condizioni di cristallizzazione verso nucleazione e Formazione di cristalli.

Al giorno d'oggi, molte condizioni di cristallizzazione includono precipitante soluzioni dove il polietilenglicole (PEG) derivati sono ampiamente presenti. Tali composti hanno solitamente una viscosità elevata che può possedere le difficoltà per pipettaggio o erogazione. Nel presente caso di studio, i sistemi di micro-dosaggio che vengono utilizzati per l'erogazione precipitante applicano capillari molto sottili che rendono possibile l'aggiunta di incrementi picolitri. Di conseguenza, ci sono alcune limitazioni nel funzionamento con sostanze altamente viscosi. All'interno di una serie di esperimenti precedenti, il sistema ha dato risultati positivi utilizzando il seguente derivati del PEG: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Anche se finora sono state testate solo le soluzioni di cui sopra, i sistemi di micro-dosaggio contengono un meccanismo di riscaldamento speciale che può essere utilizzato per fare diminuire la viscosità di una soluzione. Un altro fattore è soluzioni saline che devono essere considerati quando utilizzato come proteina precipitante. Quando si lavora con sali altamente concentrati, una piccola quantità può cristallizzare all'ugello del sistema micro-dosaggio, causando il blocco superficiale della pompa micro-dosaggio durante aggiunta precipitante; anche quando un'umidità molto alta è presente in aula sperimentale. Per ovviare a questo problema, l'esperimento deve essere messo in attesa in modo che il sale dall'ugello può essere rimosso. Questo potrebbe richiedere una gestione speciale e potrebbe produrre errori in fase di aggiunta precipitante.

Basato sulle informazioni preziose che possono essere raggiunti quando si eseguono tali esperimenti di cristallizzazione automatizzata, questa tecnica può essere estesa anche a studi che studiano gli aspetti di chimica fisica della cristallizzazione di proteine. I tassi di reazione di crescita nucleazione e cristallo sono fenomeni cinetici che possono essere derivati e calcolati sulla base delle informazioni di dipendenza di tempo rappresentate da un esperimento come la temperatura, la crescita di dimensione delle particelle e di proteina e precipitante concentrazione.

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Taumatina da Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	1002365940	Proteina per protocollo
Bis-Tris 14880	Sigma-Aldrich 2302377		Tampone per soluzione proteica
di-Tartrato di sodio diidrato	AppliChem	A0451,0500	Precipitante per soluzione proteica
Vetrini coprioggetti silliconizzati	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051203	Vetrini coprioggetti per cristallizzazione
Filtro per siringa	Starstedt	831826001	Poro del filtro 0,2 & micro; m
Siringa	Omnifix	4617207V	Luer Lock Solo 20 mL
Olio di paraffina	Sigma-Aldrich	2323842	Olio per il rivestimento della piastra
Piastra Terakasi standard Piastra	Sigma-Aldrich	M5812270EA	per il recupero della gocciolina di cristallizzazione
Salviette morbide	KIMTECH Science
XtalController900	Xtal-Concepts GmbH	Dispositivo di cristallizzazione	XTC900