Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Sommario

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Abstract

Durante l'infezione patogena di Drosophila melanogaster, emociti gioca un ruolo importante nella risposta immunitaria durante l'infezione. Così, l'obiettivo del presente protocollo è di sviluppare un metodo per visualizzare l'invasione di agente patogeno in un apposito comparto immune di mosche, vale a dire emociti. Utilizzando il metodo presentato qui, fino a 3 × 10⁶ live emociti sono ottenibili da 200 drosofila 3^rd instar larve in 30 min per infezione ex vivo . In alternativa, emociti possono essere infetti in vivo attraverso l'iniezione di 3^rd instar larve seguita da estrazione di emociti post-all'infezione 24 h. Queste cellule primarie infette sono stati corretti, macchiato e imaging utilizzando la microscopia confocale. Quindi, rappresentazioni in 3D sono stati generati da immagini per mostrare definitivamente l'invasione dell'agente patogeno. Inoltre, può essere ottenuto RNA di alta qualità per qRT-PCR per la rilevazione delle seguenti mRNA patogeno infezione e sufficienti proteine possono essere estratte da queste cellule per l'analisi Western blot. Presi insieme, presentiamo un metodo per la riconciliazione definitiva dell'invasione di agente patogeno e conferma dell'infezione utilizzando tipi di agente patogeno batterico e virale e un metodo efficiente per l'estrazione di emociti per ottenere abbastanza emociti dal vivo dalla drosofila larve per esperimenti di infezione ex vivo ed in vivo .

Introduzione

Drosophila melanogaster è un organismo modello consolidata per lo studio della immunità innata¹. Durante la risposta immunitaria innata, emociti gioca un ruolo importante nella risposta alla sfida di agente patogeno. Emociti sono critici per incapsulare i parassiti, oltre ad avere una funzione importante nella lotta contro l'agente patogeno attraverso azione fagocitica durante infezione fungine, virali e batteriche^2,3.

Al fine di meglio comprendere la risposta immunitaria innata dell'ospite all'infezione microbica patogena, è importante visualizzare ....

Protocollo

1. infezione ex vivo

1. Medium e attrezzature
   1. In condizioni di sterilità, preparare fresco Drosophila emociti isolamento medio (DHIM) contenente di 75% Schneider Drosophila medie con 25% siero bovino fetale (FBS) e filtro sterilizzarlo.
   2. Strato 2-3 pezzi di pellicola di paraffina di 10 x 10 cm sotto un microscopio stereoscopico.
   3. Preparare il capillare di vetro. Impostare la stufa capillare estrattore al 55% del massimo. Tirare il tubo capillare di una punta acuminata di circa 10 µm.
   4. Recupero di informazioni del capillare con olio minerale.
   5. Assemblare il tubo capillare riempito sul nan....

Risultati

Per raccogliere vivere emociti per infezione ex vivo , fino a 3 × 10⁶ emociti sono stati estratti da 200 drosofila 3^rd instar larve. Per sviluppare il nostro metodo, una serie di diverse tecniche sono stata tentata. Dissezione larvale individuale sarebbe prendere fino a 1,5 h, e una media di ~ 8000 cellule sono state ottenute utilizzando questo metodo¹⁸, la maggior parte dei quali non erano viva alla fine della raccolta. Succ.......

Discussione

Per comprendere meglio come cellule dell'ospite infettate, è importante chiarire la localizzazione dell'agente patogeno nelle cellule, soprattutto quando si sperimenta il patogeno non precedentemente testato e cella tipo combinazioni⁴. Mentre studiando la cascata di risposta cellulare dopo l'infezione può indicare invasione produttivo dell'agente patogeno, la combinazione dei dati di risposta cellulare e imaging è essenziale per dimostrare l'infezione e l'invasione dell'agente patogeno. Mentre i r.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Schneider's Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	21720024	1.1.1), 2.1.2)
Siero fetale bovino	GE Healthcare Life Sciences  (HyClone)	SH30070.03HI	1.1.1), 2.1.2)
Filtro (0.22 µ L)	RESTEK	26158	1.1.1)
Filtro (100 &; micro; m)	Greiner bio-one	542000	1.2.1), 2)
Stereomicroscopio	Amscope	SM-1BSZ-L6W	1.2), 2)
Capillare in vetro	Fisher Scientific	21-171-4	1.1), 1.2), 2)
Estrattore capillare	Narishige International USA, Inc.	PC-10	1.1.3)
Olio minerale	Snow River Products		1.1.4)
Nanoinjector	Drummond Scientific Company	3-000-204	1.1), 1.2), 2.2)
Pinze	VWR	82027-402	1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus	Genesee Scientific	59-122BC	1.2), 2)
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15250061	1.3)
Emocitometro	Hausser Scientific	3100	1.3)
Piastra a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662160	1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.		1.4), 2.2)
Drosophila piatti di succo di frutta	Cold Spring Harbor Protocolli		2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
	Agar Fisher Bioreagents	BP1423-500	2.1.1.1)
Metil parabene	Amresco	0572-500G	2.1.1.2)
Etanolo assoluto	Fisher Bioreagents	BP2818-500	2.1.1.2)
Welch's 100% succo d'uva concentrato congelato, 340 ml Amazon		B0025UJVGM	2.1.1.3)
Piastre di Petri, 10 x 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A	2.1.1.4)
Vetro di copertura per microscopio	Fisher Scientific	12-545-80	1.4.4), 2.2.2)
Lievito, Panettieri essiccati Active	MP Biomedicals	0210140001	2.1) Aggiungere 2 parti di acqua a 1 parte di lievito (v/v)
Ago di tungsteno	Fine Science Tools	10130-20	2.1)
Pinza di tenuta	VWR	HS8313	2.1)
Paraformaldeide	Fisher Scientific	FLO4042-500	3.1.3)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	3.1.3)
Albumina sierica bovina	Fisher Scientific	BP9706-100	3.1.3)
4',6-diamidino-2-fenilindolo	Thermo Fisher Scientific	62247	3.1.4)
Mezzo di montaggio antisbiadimento	Thermo Fisher Scientific	P36930	3.1.6)
Microsope confocale	Leica	TCS SP8-X Microscopio a scansione laser confocale a luce bianca	3.2)
Software per la ricostruzione dell'imaging	3D Leica	LASX con modulo	di visualizzazione 3D3.3)
Vetrini per microscopio	Fisher Scientific	12-552-3	3.1.6)
Virus iridescente invertebrato 6 (IIV6)	Dr. Teixeria, L.		4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes	ATCC	ceppo: 10403S	4) Listeria monocytogenes ceppo 10403S (Bishop e Hinrichs, 1987) è stato coltivato in brodo Difco Brain-heart infusion (BHI) (BD Biosciences) contenente 50 &; micro; g/ml di streptomicina a 30 °C.
la degradazione del gDNA	18068015 DNase I Thermo	Fisher Scientific(Invitrogen)	1708891
	cDNA		Bio-Rad
IIV6_193R_F	IDT		qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R
	IDT		qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd
	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Reagente qRT-PCR verde	Thermo Fisher Scientific	K0251, K0252, K0253	qRT-PCR
Sistema di PCR in tempo reale	Thermo Fisher Scientific	4351107, 7500 Software v2.0	qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes anticorpo	abcam	ab35132	Western blot
Anticorpo anti-actina prodotto nel coniglio	SIGMA-ALDRICH	A2066	Western blot
Anti-coniglio IgG (H+L), HRP coniugato	Promega	W4011	Western blot

Kit di sintesi del cDNA per per lasintesi del RpII_qRTPCR_rev