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Articolo metodologico

Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

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DOI:

10.3791/57082

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27 febbraio 2018

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1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

In questo articolo

Sommario

Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell'analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di perturbazioni

Abstract

L'accumulo di proteine misfolded è centrale per la patologia nella malattia di Huntington (HD) e molte altre patologie neurodegenerative. In particolare, una caratteristica patologica chiave di HD è l'aberrante accumulo della proteina mutante HTT (mHTT) in complessi ad alto peso molecolare e i corpi di inclusione intracellulari è composto da frammenti e altre proteine. I metodi convenzionali per misurare e comprendere che i contributi delle varie forme di mHTT contenenti aggregati includono microscopia a fluorescenza, l'analisi western blot e filtro trappola saggi.

Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono conformazione specifica e pertanto non può risolvere lo stato di cambiamento continuo della proteina mHTT a causa della natura complessa di aggregazione solubilità e la risoluzione completa.

Per l'identificazione di mHTT aggregati e varie forme modificate e complessi, separazione e solubilizzazione degli aggregati cellulari e frammenti è obbligatorio. Qui descriviamo un metodo per isolare e visualizzare mHTT solubile, monomeri, oligomeri, frammenti, e un insolubile ad alto peso molecolare (HMW) accumulato mHTT specie. HMW mHTT tracce con progressione di malattia, corrisponde con le letture di comportamento del mouse e ha stato favorevolmente modulata da determinati interventi terapeutici1. Questo approccio può essere utilizzato con cervello di topo, tessuti periferici e coltura delle cellule, ma può essere adattato ad altri sistemi di modello o contesti di malattia.

Introduzione

L'interruzione delle reti di controllo di qualità di proteina che assicurano il corretto ripiegamento e degradazione delle proteine cellulari è probabile centrale per la patologia nel morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e altri "misfolding proteico" disordini di2,3. Conoscere in dettaglio i componenti di rete proteostasis e i loro contributi alla patologia sono quindi cruciali per lo sviluppo di interventi terapeutici migliorati. MH è causata dall'espansione anormale di una ripetizione di CAG nel gene HD risultante in un tratto espanso di polyglutamines (poliQ) nella proteina huntingtina (HTT)4. Una caratteristica patologica coerenza della patogenesi dell'HD è il misfolding risultante, accumulo e l'aggregazione di HTT in regioni del cervello e nei tessuti periferici, che ha dimostrato di interferire in vari modi con funzione e omeostasi cellulare normale 5 , 6. HTT mentre è espressa ubiquitariamente, neuroni medi spinosi nello striato sono selettivamente vulnerabili e più apertamente interessata con atrofia corticale notevole anche associato con la patogenesi dell'HD.

La formazione di aggregati di HTT nel cervello di pazienti con MH e modelli animali in genere ha servito come un marcatore di proxy per la progressione della malattia e dominante-negativo guadagno di funzione per mHTT7. Anche se i meccanismi precisi di quale proteina misfolding e aggregazione può contribuire alla tossicità indotta da mHTT rimangono poco chiari, la formazione di queste inclusioni nel cervello dei pazienti di HD e vari modelli animali è una caratteristica invariante e inevitabile. Inclusioni appaiono per essere composto in gran parte accumulate HTT frammenti contenenti il N-terminale ampliato polyQ, indicando tale proteolisi ed elaborazione di Full-Length HTT, nonché8,di splicing alternativo9 possono svolgere un ruolo importante nella patogenesi della HTT HD. N-terminale frammenti può costituire una forma patologica di HTT che può aggregare rapidamente, nucleazione e accelerare o propagare il processo di aggregazione10.

Tuttavia, la presenza di queste inclusioni non è necessariamente correlata con la tossicità indotta da HTT o cellule morte11. HTT è stato proposto di sottoporsi a un processo di aggregazione da un monomero solubile attraverso specie oligomeriche solubile e β-foglio fibrille di aggregati insolubili e inclusioni12. Risoluzione di queste varie specie di proteina tramite saggi biochimici standard è stata una sfida nel campo grazie alla loro stabilità nel buffer di lisi di basso-detergente e difficoltà nel visualizzare utilizzando saggi biochimici standard. Così, considerazioni metodologiche sono fondamentali nel rilevare il grado e il modello di mHTT accumulati e aggregati.

Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per visualizzare diversi intermedi di HTT, in particolare la formazione di una specie di HMW HTT insolubile che sembra tenere sotto controllo con HD patogenesi e malattia progressione1,13 ,14. Essere in grado di risolvere e tenere traccia di più specie di mHTT fornisce ai ricercatori uno strumento biochimico per studiare la patogenesi della malattia e per valutare potenziali interventi terapeutici attraverso la modulazione e l'impatto sulla patogenesi della malattia.

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Protocollo

Dichiarazione etica animale - esperimenti sono stati effettuati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e un protocollo di ricerca animale approvato dalla (uso Comitato e istituzionali Animal Care IACUC) presso la University of California, Irvine, un AAALAC accreditata istituzione. Tutti gli sforzi sono stati fatti per minimizzare la sofferenza animale.

1. preparazione del buffer di lisi

  1. Preparare "Solubile" buffer di lisi (Tris 10 mM pH 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerolo) e filtro sterile attraverso il filtro di 0,22 µm.
    1. Per un buffer di lisi lavoro "Solubile", misura N-Ethylmaleimide (NEM) e accuratamente sciogliere in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) disciolti in 100% EtOH.
      Nota: Lysis Buffer inibitori: (i) 20mm N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1mm orthovanadate del sodio (Na3VO4); (iv) 1 µ g/mL leupeptina; (v) 1 µ g/mL aprotinina; (vi) 20mm fluoruro di sodio (NaF).
      Attenzione: Indossare una maschera quando si lavora con NEM in tutto il protocollo. Buffer di lisi di lavoro deve essere effettuato fresco per garantire inibitori attivi.
    2. Per il buffer di lisi solubile con inibitori della proteasi, aggiungere inibitori nel seguente ordine: fluoruro di sodio (NaF), fino a volume con tampone di lisi freddo, orthovanadate del sodio (Na3VO4), aprotinina e leupeptina.
  2. Per "Insolubile" buffer di Lisi, supplemento al 4% SDS aggiungendo 500 µ l di 20% SDS a 2 mL di tampone di Lisi "Solubile". Lasciare a temperatura ambiente.
    Nota: SDS precipita fuori, conservato a 4 ° C; tenerlo a temperatura ambiente. Composizione di tampone di lisi finale: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; glicerolo al 10%; 4% SDS (solo insolubile).

2. solubili/insolubili frazionamento protocollo

Nota: Vedere la Figura 1 per una schematica.

  1. Due set di tubi per ciascun campione di etichetta: "Solubile" e "Insolubile".
  2. Aggiungi X-µ l di buffer di lisi solubile di lavoro ghiacciata completati con inibitori della proteasi (Vedi 1.1.1) al tessuto.
    Nota: X = Volume varia a seconda della quantità di tessuto; Vedere tabella 1.
  3. Per tessuto di cervello di topo (cioè, corpo striato), lisata lentamente 30 volte in vetro da 1 mL douncer e dispensare "Insolubile" etichettati tubo (tenere il ghiaccio).
    Nota: Fare attenzione a non rompere la superficie del liquido dopo a partire douncing, come bolle si forma e possono produrre omogeneizzazione incompleta.
  4. Per le cellule (cioè, HeLa, HEK293T), sciacquare le cellule una volta con il freddo, 1x PBS. Rimuovere PBS e applicare il minimo volume di tampone di lisi delle cellule e sollevare con raschietto di cella.
    Nota: Per sopra linee cellulari, cellule erano placcate a 5 x 105 celle per ben 6 piastra e cresciute vicino a confluenza. Uno è ben paragonabile ai volumi utilizzati per striatum del mouse.
  5. Trasferimento omogeneato o lysate delle provette, "Insolubile" e lisare il ghiaccio 1 h (orologio di partenza dopo l'elaborazione del filmato finale).
    Nota: Per lisati cellulari, triturare diverse volte per spezzare ciuffi di cella prima di iniziare l'incubazione. Evitare la formazione di bolle. Brevemente di vortice impulso ogni campione per 1 s a metà lisi.
  6. Centrifugare i campioni a 4 ° C a 15.000 x g per 20 min.
  7. Recuperare il surnatante più la frazione "Solubile".
    1. Rimuovere con pipetta, fare attenzione a non disturbare il pellet/nuvoloso strato come questo, contamina la frazione. Frazione solubile di dispensare in "Solubile" etichettato tubo. Tenere il ghiaccio.
  8. Lavare la pallina con 500 µ l di tampone di lisi (x2) e centrifugare a 4 ° C a 15.000 x g per 5 min dopo ogni lavaggio; va bene se alcuni dello strato nuvoloso è dispensato fuori.
  9. Dopo il lavaggio finale, rimuovere tutti i restanti tampone di lavaggio, lasciando solo il precipitato di tessuto.
    Nota: Da questo punto, insolubili campioni ora devono essere tenuti a temperatura ambiente.
  10. Risospendere il pellet con X-µ l di tampone di lisi completati con 4% SDS (Volume può essere regolato a seconda del formato della pallina; cfr. tabella 1).
  11. Sottoporre ad ultrasuoni ogni campione per 30 s a temperatura ambiente con un sonicatore sonda (125 watt, 20kHz, impulso, ampiezza 40%, Vedi Tabella materiali).
  12. Far bollire i campioni (ebollizione di rotolamento) per 30 min; Centrifugare brevemente (15 s) a 6.000 x g per non perdere alcun campione.
  13. Eseguire analisi della proteina di DC (detergente compatibile) (Vedi Tabella materiali) o analisi della proteina di Lowry per misurare la concentrazione di proteina (consigliata iniziate diluizioni di 1/5 del campione in tampone di lisi rispettivi per colture cellulari e 1/10 per tessuto lisati).
    Nota: Le concentrazioni di proteina dovrà essere letto usando un'analisi DC o Lowry grazie alla elevata concentrazione di detersivo.
  14. Aliquotare campioni in batch in 50 µ l per evitare problemi di congelamento-scongelamento.
    Nota: Protocollo può essere sospesa qui prima dell'ulteriore analisi biochimica memorizzando sia frazioni a-20 ° C.

3. quantificazione e Western Blot

  1. Eseguire le macchie occidentali come segnalato altrove1,13 da diluire 30 µ g di campione 1:1 nel caricamento buffer (1,6 x tintura, 1 x riduzione di carico).
    Nota: 30 µ g di proteina per ogni frazione è sufficiente, ma può essere regolata per risoluzione ottimale. 3 - gel di poliacrilammide Tris-acetato di 8% da utilizzarsi per la frazione insolubile. 4 - 12% bis-Tris gel sono raccomandati per la frazione solubile.
  2. Bollire brevemente campioni (ebollizione) per 5 min, centrifuga (15 s) a 6.000 x g per raccogliere il campione.
  3. Analizzare le frazioni mediante SDS-PAGE e western blot, secondo il protocollo del produttore per campioni ridotti.
    Nota: Frazione insolubile risolve meglio quando trasferite su membrana di nitrocellulosa 0,45 µM. nitrocellulosa µM 0,45 o 0,2 può essere utilizzato per la frazione solubile, a seconda delle dimensioni della proteina di interesse. Alcune ottimizzazione può essere richiesto per il migliore trasferimento di materiali HMW.
  4. Macchia della membrana con la macchia di intera proteina (ad es., MEMcode, vedere la Tabella materiali) per visualizzare la proteina efficienza di carico.
    Nota: Western blot può essere analizzato dall'intensità media pixel. Frazioni solubili possono essere normalizzate in una casa-armonia proteina migliore adatta per il sistema sperimentale. Frazione insolubile come abbondanza relativa della proteina è stata verificata dalla macchiatura della proteina reversibile o normalizzazione dell'istone 3 sulla macchia separata.

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Risultati

Risoluzione di lisati solubili e insolubili, seguito di frazionamento può essere rilevato tramite occidentale saggi di ritardo analisi e filtro (Figura 2). Ad esempio, cellule HEK293T transfected utilizzando il reagente di transfezione (ad es., lipofectamine 2000), con l'esone HTT 1 codifica cDNA contenenti glutammina 97 ripete15 seguita dalla regione ricca di prolina di poli e queste cellule sono state permesse espresso per 4...

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Discussione

Alcune precauzioni sono necessarie per i protocolli di cui sopra garantire risultati coerenti e quantitativi. In primo luogo, mHTT in entrambe le frazioni formeranno spontaneamente aggregati nel tempo su cicli ripetuti di congelamento scongelamento, specialmente quando ci si trova in alta concentrazione. È dunque fondamentale per congelare le aliquote di preps la proteina e scongelare solo il volume necessario prima di eseguire il test come descritto nel protocollo di cui sopra. Ulteriormente, se la frazione insolubile p...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal NIH (RO1-NS090390). Vorremmo anche ringraziare il Dr. Joan Steffanfor assistenza tecnica e discussione durante lo sviluppo di questo test.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro sterileMilliporeSCGP505RETappo a vite, filtro sterile per vuoto
1 mL Macinatore di tessuti, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModello Q125
DC Protein AssayBiorad5000111Paragonabile al test Lowry
Soluzione tampone Tris 1MAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M soluzioneTeknovaS0251
GliceroloFisherBP229-1
20% SDS soluzioneTeknovaS0295
N-etilmaleimmideSigmaE1271
Fenilmetilsulfonio fluoruroSigmaP7626creare 100mM soluzione madre in 100% EtOH, negozio a 4 gradi C
Ortovanadato di sodioSigmaS6508Creare una soluzione madre da 0,5 M in acqua
LeupeptinSigmaL2884Creare una soluzione madre da 10 mg/ml in acqua
AprotininaSigmaA1153Creare una soluzione madre da 10 mg/ml in acqua
Fluoruro di sodioSigmaS4504Creare una soluzione madre da 500 mM in acqua
Anti-HTTMilliporeMAB5492Utilizzare 1:1000 per western blot, 1:500 per il test di ritardo del filtro
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Utilizzare 1:1000 per western blot solubile

Riferimenti

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