I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

Cécile Leduc; Audrey Salles; Spencer L. Shorte; Sandrine Etienne-Manneville

doi:10.3791/57087

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Articolo metodologico

I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

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DOI:

10.3791/57087

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6 marzo 2018

Cécile Leduc¹ , Audrey Salles² , Spencer L. Shorte² , Sandrine Etienne-Manneville¹

¹Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, ²UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di dare le condizioni sperimentali ottimali dalla preparazione del campione per acquisizione di immagini e la ricostruzione al fine di eseguire immagini dSTORM 2D doppio colore dei microtubuli e filamenti intermedi in celle fisse

Abstract

Il citoscheletro, composto di microfilamenti di actina, microtubuli e filamenti intermedi (IF), svolge un ruolo chiave nel controllo della forma delle cellule, la polarità e la motilità. L'organizzazione delle reti di actina e dei microtubuli è stato studiato estesamente, ma quella di IFs non è ancora pienamente caratterizzato. IFs hanno un diametro medio di 10 nm e forma una rete che si estende in tutto il citoplasma delle cellule. Sono fisicamente associate con l'actina e i microtubuli attraverso motori molecolari e linker del citoscheletro. Questa stretta associazione è al centro dei meccanismi normativi che garantiscono la regolazione coordinata delle tre reti del citoscheletro necessari per la maggior parte delle funzioni delle cellule. È pertanto fondamentale per visualizzare IFs da solo e anche insieme a ciascuna delle altre reti del citoscheletro. Tuttavia, se le reti sono estremamente dense nella maggior parte dei tipi di cellule, soprattutto nelle cellule gliali, che rende molto difficile da raggiungere con microscopia di fluorescenza standard la sua risoluzione (risoluzione di ~ 250 laterale nm). Microscopia ottica stocastica diretta di ricostruzione (dSTORM) è una tecnica che permette un guadagno nella risoluzione laterale di un ordine di grandezza. Qui, indichiamo che laterale dSTORM risoluzione è sufficiente per risolvere l'organizzazione densa delle reti se e, in particolare, dei pacchi di se che circondano i microtubuli. Tale stretta associazione è probabile che partecipano alla regolazione coordinata di queste due reti e maggio, spiegare come modello IFs vimentin e stabilizzare la organizzazione dei microtubuli, nonché potrebbe influenzare il traffico vescicolare dipendente dei microtubuli. Più in generale, vi mostriamo come l'osservazione di due componenti citoscheletriche con tecnica dual-color dSTORM porta nuova comprensione nella loro reciproca interazione.

Introduzione

I filamenti intermedi citoplasmatici (IFs) sono 10 nm di diametro omo - o eteropolimeri di un sottoinsieme specifico del tipo di cella di proteine se. IFs partecipare a una vasta gamma di funzioni cellulari quali risposte di motilità, proliferazione e lo stress delle cellule. Loro ruolo chiave è evidenziato dal fatto che più di 90 malattie umane sono direttamente causati da mutazioni in proteine se; per esempio, cambiamenti nella composizione se accompagna la crescita del tumore e la diffusione di¹^,²^,³. Vi è crescente evidenza che i tre sistemi di citoscheletro lavorano in co....