Questo articolo fornisce un approccio aggiornato al sistema classico pollo quaglia chimera di studiare la formazione di organo, combinando romanzo procedure sperimentali in vitro e in ovo .
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Articolo metodologico
Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'embrione aviaria, come modello sperimentale, è stato di fondamentale importanza per le scoperte seminale in biologia dello sviluppo. Tra i diversi approcci, la formazione di quaglia-pollo chimere e l'uso della membrana corio-allantoidea (CAM) per sostenere lo sviluppo di tessuti ectopici risalgono al secolo scorso. Al giorno d'oggi, la combinazione di queste tecniche classiche con recenti metodologie in vitro offre nuove prospettive per esplorare ulteriormente la formazione dell'organo.
Qui descriviamo un approccio in due fasi per studiare e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi. Brevemente, la regione embrionale che contiene il territorio presuntivo dell'organo è isolata da embrioni di quaglia e coltivati in vitro in un sistema organotipiche (fino a 48 ore). Tessuti coltivati vengono innestate sulla CAM di un embrione di pollo. Dopo 10 giorni di sviluppo in ovo , organi completamente formati sono ottenuti da tessuti innestati. Questo metodo consente anche la modulazione delle vie di segnalazione dell'amministrazione regolare di agenti farmacologici e manipolazione genetica dei tessuti durante fasi inerenti allo sviluppo in vitro e in ovo . Inoltre, lo sviluppo di tessuti possa essere raccolti presso qualsiasi intervallo di tempo per analizzare il loro profilo di espressione genica (mediante PCR quantitativa (qPCR), microarrays, ecc.) e la morfologia (valutato con immunochimica e istologia convenzionale).
La procedura sperimentale descritta utilizzabile come strumento per seguire la formazione dell'organo di fuori dell'embrione aviaria, dalle prime fasi dell'organogenesi a completamente formate di organi funzionali.
Introduzione
Embrioni aviari sono stati ampiamente utilizzati negli studi di biologia dello sviluppo seminale. I principali vantaggi del modello aviaria includono la possibilità di aprire l'uovo, l'accesso relativamente facile per l'embrione e la possibilità di eseguire micromanipolazione. Alcuni esempi comprendono il sistema classico pollo quaglia chimera per lo studio delle cellule destino1, applicazione di specifici fattori di crescita per l' embrione2e la crescita di strutture cellulari ectopici in CAM1,3, 4.
Per ottenere nuove intuizioni distinte fasi di formazione dell'organo, recentemente abbiamo sviluppato un metodo che combina le tecniche di innesto con la manipolazione in vitro di tessuti embrionali5. L'approccio in due fasi consente la discriminazione e l'esplorazione di entrambi - e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi, che spesso sono limitate a causa di interazioni altamente dinamico e complesso tessuto2. Inoltre, la mancanza di idonei indicatori di tessuto-specifici spesso limita l'uso di organismi geneticamente modificati6modelli animali. Questo nuovo metodo dell'approccio in due fasi supera di gran lunga tali limitazioni.
Per studiare le prime fasi di formazione di organo, nel primo passaggio, territorio embrionali quaglia comprendente il rudimento di organo prospettico è isolato e coltivato in un sistema in vitro organotipiche per 48 h. Durante questo periodo, la modulazione farmacologica di specifiche vie di segnalazione può essere eseguita con l'aggiunta di farmaci per il terreno di coltura5,7. Inoltre, i tessuti coltivati possono essere raccolti in qualsiasi fase della crescita in vitro e sondati per espressione genica (utilizzando metodi quali qPCR, microarrays, ecc.).
Nel secondo passaggio, 48 h-coltivati tessuti sono poi innestate sulla CAM di un embrione di pollo (c) al giorno embrionale (E) 8 (cE8) (Hamburger e Hamilton (HH)-fasi 33-35)8. La camma si comporta come un fornitore vascolare di sostanze nutritive e permette gas scambi1,3,4 ai tessuti innestati abilitazione relativo sviluppo in ovo per lunghi periodi di tempo. Questa fase sperimentale è particolarmente adatta per studiare fasi ritardate di organogenesi, come organi completamente formati possono essere ottenuti dopo 10 giorni di ovo sviluppo5,9,10,11 . Analisi morfologica viene facilmente eseguita dall'istologia convenzionale per confermare formazione adeguato organo e origine del donatore di cellule possa essere identificati mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi specie-specifici (cioè, MAb Quaglia perinucleare (QCPN)). Durante il periodo di incubazione di CAM, innesti possono anche essere sviluppati in presenza di agenti farmacologici e raccolti in qualsiasi fase di sviluppo per valutare la progressione dell'organogenesi.
L'approccio in due fasi, descritta qui in profondità, è già stata impiegata in Figueiredo et al. 5 per esplorare lo sviluppo di primordio aviaria paratiroidale/timo comune. Di conseguenza, di seguito saranno presentate le peculiarità intrinseche dei territori embrionali e fasi di sviluppo partecipano l'organogenesi del timo e le ghiandole paratiroidali.
Il timo e le ghiandole paratiroidali epiteli, anche se funzionalmente distinte, derivano dall'endoderma dei sacchetti pharyngeal (PP)12. In aviaria, gli epiteli di questi organi provengono dal terzo e quarto PP endoderma (3/4PP)12, mentre nei mammiferi l'epitelio timico deriva dal 3PP e l'epitelio delle ghiandole paratiroidali deriva dal 3PP e 3/4PP nel topo e umano, rispettivamente di13,14.
Una delle prime fasi nella formazione di questi organi è l'emergere di timo discreto e paratiroidale domini nel primordio comune. In pollo, questi domini possono essere identificati di ibridazione in situ , con marcatori molecolari specifici, E4.515. Come procede lo sviluppo, questi rudimenti di organo individuare e separano dalla faringe, mentre una sottile capsula mesenchymal, formata da cellule derivate dalla cresta neurale, li circonda (a E5; HH-stage 27). In seguito l'epitelio timico è colonizzato da cellule progenitrici ematopoietiche (presso E6.5; HH-stage 30)12.
Come in studi classici di quaglia-pollo1,12, l'approccio in due fasi è particolarmente utile per studiare la formazione degli organi ematopoietici/linfoidi, vale a dire il timo5. Come la quaglia explant, con il rudimento dell'organo, si innesta nell'embrione di pollo prima della colonizzazione delle cellule progenitrici ematopoietiche, timo chimerico è formata con pollo ematica del progenitor una controparte epiteliali timiche quaglia di infiltrazione. Questo metodo è, pertanto, uno strumento utile per esplorare il contributo delle cellule ematopoietiche nello sviluppo del sistema emato/linfoide aviaria.
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Protocollo
Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e orientamenti etici del Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. l'incubazione di quaglia fertilizzato e uova di gallina
- Incubare uova di pollo (Gallus gallus) fertilizzato e quaglia giapponese (Coturnix japonica del coturnix) per 3 e 8 giorni, rispettivamente.
- Sistemare le uova intere con camera d'aria (estremità smussata uovo) rivolto verso l'alto in un incubatore a 38 ° C.
- Per eseguire questo esperimento, utilizzare uova di quaglia circa 20 e 40 uova di gallina.
Nota: Questi numeri dovrebbero essere raddoppiati quando si stabilisce la procedura per la prima volta.
2. isolamento di quaglia embrionale regione contenente il territorio presuntivo di rudimenti timiche e paratiroidali
Nota: Eseguire uovo procedure di manipolazione in condizioni sterili, utilizzando materiali e strumenti sterilizzati e cappa a flusso laminare orizzontale.
- Preparare una ciotola di vetro di borosilicato grande circa 3/4 riempito con soluzione fredda tampone fosfato salino (PBS).
- Aprire un uovo di quaglia dopo 3 giorni di incubazione toccando la shell e taglio di un'apertura circolare sul lato opposto della sua estremità smussata con forbici curve. Con attenzione rimuovere i pezzi di guscio e trasferimento dell'embrione nella ciotola di vetro riempita con PBS freddo.
- Tenere l'embrione di quaglia (q) all'E3 (qE3) (la fase di quaglia corrispondono alla HH-fase 21 del pollo) con l'aiuto di pinzette sottili. Fare un taglio nella membrana vitellina avvolgente il tuorlo utilizzando forbici curve. Continuare a tagliare intorno ed esternamente alla circonferenza dei vasi extra-embrionali.
- Trasferimento dell'embrione ad una piccola ciotola circa 3/4 pieno di PBS freddo con l'aiuto di pinzette sottili. Lavare accuratamente l'embrione dal restante tuorlo allegato.
- Utilizzare una schiumarola per trasferire l'embrione in un bicchiere di 100mm di Petri con base nera (Vedi Tabella materiali) contenente 10 mL di PBS freddo.
- Posto di Petri sotto un microscopio stereoscopico.
Nota: Da questo punto in avanti, eseguire le procedure di microchirurgia sotto un microscopio stereoscopico per ingrandimento progressivo. Come fonte di illuminazione, si consiglia di utilizzare luci a LED incorporati nello stereomicroscopio o in fibre ottiche, considerando il carico di calore limitato. - Tenere l'embrione alla parte inferiore della piastra con spilli entomologici sottili. Posizionare i quattro perni formando una forma quadrata della regione extra-embrionali.
- Rimuovere le membrane extra-embrionali della regione cefalica con l'aiuto di pinze sottili e mettete un perno di quinto ci.
Nota: Se l'embrione è correttamente posizionato, quindi la vescicola otica, il tubo di cuore e 1st, 2nde archi pharyngeal 3rd (PAs) dovrebbero essere visibili. - Sezionare la regione embrionale di interesse, vale a dire, il 3rd e regione di Arco faringeo 4th (3/4PAR), usando le forbici Wecker occhio.
- Iniziare a tagliare longitudinalmente e parallelamente all'asse dell'embrione, tra la zona di tubo somite/neurale e la PAs.
- Rimuovere il tubo posizionato ventralmente cuore tagliandolo. Tenendo le forbici nella stessa posizione, ruotare la piastra di Petri per riposizionare l'embrione secondo la direzione del taglio.
- Taglio tra la 2nd e 3rd PAs e sotto il 4th PA
- Staccare le membrane rimanenti dal 3/4PAR con l'aiuto di pinzette sottili.
- Aspirare l'organi isolati (il 3/4PAR) e trasferire loro di un piatto di vetro 3/4 riempita con PBS freddo utilizzando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.
Nota: D'ora in avanti, tessuti possono essere coltivato in vitro fino a 48 ore o immediatamente essere innestati la CAM di un embrione di pollo a E8. - Tenere il piatto di vetro contenente l'isolato 3/4PAR sul ghiaccio durante la preparazione del test in vitro .
3. in Vitro organotipiche Assay: cultura della regione embrionale contenente il territorio presuntivo di rudimenti timiche e paratiroidali
- Preparare il terreno di coltura con RPMI-1640 supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina.
Nota: Solubili farmacologici reagenti possono essere aggiunti al supporto (ad esempio, LY-411.575 (Ly) e di-benzazepine o cyclopamine e vismodegib, per inibire la tacca e segnalazione percorsi, rispettivamente di Hedgehog (Hh). Per questo test, utilizzare 50-200 nM di Ly o 5-15 µM di-benzazepine per inibire la tacca di segnalazione in 3 / 4PAR. uso 20 µM di cyclopamine o 10 µM di vismodegib per inibire signaling di Hh in 3/4PAR5. - Preparare la coltura in vitro del explant 3/4PP in una piastra a 6 pozzetti.
- Riempire un pozzo dalla piastra 6-pozzetti con 5 mL di terreno di coltura. Posizionare un 24 mm inserto di membrana in policarbonato (Vedi Tabella materiali) sul bene con l'aiuto di pinzette sottili.
- Sotto lo stereomicroscopio, trasferire l'espianto 3/4PAR dal piatto di vetro alla superficie della membrana facendo scorrere delicatamente con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Posizionare gli espianti con il lato ventrale verso l'alto e il lato dorsale a contatto con la membrana. Aggiungi fino a sette espianti per inserto di membrana. Procedere al punto 3.4.
- In alternativa, cultura espianti in filtri a membrana di galleggiamento.
- Preparare una capsula di Petri con 5 mL di terreno di coltura da 35 mm. Con l'aiuto di pinze sottili, float una membrana filtro (Vedi Tabella materiali) e mantenere una superficie asciutta a contatto con l'aria.
- Sotto lo stereomicroscopio, trasferimento explant 3/4PAR dal piatto di vetro per la membrana filtrante in scorrimento delicato con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Posizionare gli espianti con il lato ventrale verso l'alto e il lato dorsale a contatto con la membrana. Aggiungere fino a 8 espianti per filtro a membrana.
- Posizionare con attenzione gli espianti preparati ai punti 3.2 e 3.3 in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
- Dopo un periodo di incubazione di 48 h, rimuovere la piastra a 6 pozzetti e il 35mm di Petri dall'incubatrice.
- Raccogliere gli espianti coltivati dall'inserto di membrana della piastra 6 pozzetti.
- Consente di aggiungere l'inserto di membrana PBS a temperatura ambiente (TA).
- Staccare gli espianti dalla membrana irrigando vigoroso utilizzando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.
- Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, trasferire gli espianti coltivati per un piatto di vetro 3/4 pieni di PBS a TA.
- Allo stesso modo, è possibile raccogliere gli espianti coltivati dal filtro membrana galleggiante nella capsula di Petri in 35 mm.
- Trasferire la membrana filtrante con una pinza sottile per un nuovo piatto di Petri 35 mm riempito con PBS a TA.
- Staccare gli espianti della membrana filtrante vigoroso pipettaggio usando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.
- Con l'aiuto di pinzette sottili, scarico del filtro a membrana privo di espianto dopo conferma che nessun espianti è rimasto collegato ad esso.
- Con una spatola e sottile forcipe, trasferire gli espianti a un piatto di vetro riempito con PBS a TA.
- Raccogliere gli espianti coltivati dall'inserto di membrana della piastra 6 pozzetti.
- Trasferire 1 mL di un reagente per isolamento di RNA totale gli espianti coltivati con una spatola e utilizzare per gli studi di espressione genica.
Attenzione: L'esposizione a questo reagente (Vedi Tabella materiali) può essere un pericolo per la salute gravi. Indossare guanti, indumenti e occhiali protettivi appropriati. Seguire le istruzioni di manipolazione e leggere le schede di sicurezza fornite dal produttore. - In alternativa, dell'innesto di tessuti coltivati sul CAM di embrioni di pollo a E8. Seguire al passaggio 4.
4. preparazione della camma
- Rimuovere le uova di pollo con 8 giorni di sviluppo embrionale dall'incubatrice.
Nota: Le uova sono state incubate con camera d'aria rivolto verso l'alto a 38 ° C in un incubatore. - Coprire l'estremità smussata dell'uovo con nastro in plastica trasparente per impedire la caduta nella camera d'aria di pezzi del guscio. Toccare la shell e tagliare un'apertura circolare nell'uovo con forbici curve. La camera d'aria deve essere visibile.
- Rimuovere con cautela la membrana bianca della camera d'aria con le pinzette sottili. CAM è quindi visibile e accessibile per il trapianto di tessuto ectopico.
Nota: Non utilizzare PBS per idratare la CAM, prima o dopo il trapianto, poiché promuove la PBS scorrevole e smarrimento degli espianti. Se la membrana si asciuga, scartare l'uovo.
5. l'innesto degli espianti coltivati sul CAM
- Creare piccole lesioni vascolari/ferite nei vasi più piccoli della camma con un microscalpel in un supporto.
Nota: Utilizzare la punta di una pipetta di Pasteur per rimuovere il sangue per capillarità in caso di sanguinamento in eccesso. - Utilizzare una spatola e sottile forcipe per trasferire explant coltivate per l'area ferita della camma.
- Tagliare un pezzo di carta da filtro leggermente più grande l'espianto e posizionarlo sulla parte superiore l'espianto.
Nota: La carta da filtro consente di tracciamento della posizione di espianto dopo il suo sviluppo nel CAM. Inoltre, permette una consegna giornaliera del farmaco per l'espianto durante in ovo lo sviluppo, se necessario (descritto al punto 5.6). - Sigillare la finestra uovo con nastro in plastica trasparente e identificarlo con una matita di carbone di legna.
Nota: Il nastro di plastica protegge l'embrione dalla disidratazione durante il periodo di incubazione. - Incubare l'uovo manipolato per 10 giorni in un incubatore a 38 ° C. Seguire al passaggio 6.
- Passaggio facoltativo: Amministrazione della droga quotidiana durante il periodo di incubazione.
- Per accedere al filtro, sollevare parzialmente il nastro di plastica. Aggiungere 100 µ l di soluzione della droga, goccia a goccia, in cima alla carta. Richiudere e sigillare la finestra e inserire l'uovo indietro nell'incubatore umidificato a 38 ° C.
Nota: Per questa analisi, la dose di 20 µM di cyclopamine inibirà signaling di Hh durante in ovo sviluppo5.
- Per accedere al filtro, sollevare parzialmente il nastro di plastica. Aggiungere 100 µ l di soluzione della droga, goccia a goccia, in cima alla carta. Richiudere e sigillare la finestra e inserire l'uovo indietro nell'incubatore umidificato a 38 ° C.
6. ectopica organo formazione nel CAM dopo 10 giorni di sviluppo In Ovo
- Dopo 10 giorni di incubazione, rimuovere l'uovo dall'incubatrice ed estrarre delicatamente il nastro di plastica.
- Tagliare il CAM intorno alla regione di filtro utilizzando forbici curve e trasferimento explant CAM-derivati con carta da filtro per un piccolo bicchiere ciotola circa 3/4 pieno di PBS freddo.
- Con l'aiuto del forcipe sottile trasferire explant CAM-derivato a un 100 mm di Petri con base nera contenente 10 mL di PBS. Rimuovere delicatamente la carta da filtro e l'eccesso di membrana utilizzando Wecker occhio forbici e pinzette sottili.
- Trasferimento CAM-explant a soluzione fissante (3,7% PFA in PBS) con una schiumarola. Eutanasia gli embrioni di pollo senza rimuoverli dall'uovo facendo un taglio preciso nella regione del collo dell'embrione con l'aiuto di forbici grandi.
- Valutare l'insorgenza di organo nelle sezioni della paraffina di espianti di CAM-derivato dall'esame immuno-istochimico e dall'istologia convenzionale.
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Risultati
Quanto sopra descritto dettagli del protocollo un metodo che permette la ricerca di entrambi - e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi, spesso limitata da complesse interazioni cellulari e molecolari.
Questo metodo è stato precedentemente impiegato in Figueiredo et al. 5 per svelare il ruolo della tacca e Hh segnalazione nello sviluppo paratiroidale aviaria/timo comune primordio.
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Discussione
Un aspetto cruciale per il successo di questo metodo è la qualità del pollo e quaglia uova. Considerando i periodi di incubazione lungo, particolarmente durante il dosaggio in ovo , una buona qualità di uova di gallina migliora la redditività prezzi (fino al 90%) entro la fine della procedura. Per raggiungere questo obiettivo, test di uova provenienti da fornitori diversi. Incubare uova unmanipulated per lunghi periodi (fino a 16-17 giorni) e controllare il loro sviluppo. Per essere considerato un batch di buona...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a António Cidadão, Isabel Alcobia e Leonor Parreira per la lettura critica del manoscritto, a Padma Akkapeddi per video narrazione, e a Vitor Proa dal servizio istologia dell'Instituto de Histologia e fare Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, per il supporto tecnico. Siamo particolarmente grati a Paulo Caeiro e Hugo Silva dalla Unidade de audiovisuais (unità audiovisivi), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa per il loro eccezionale impegno alla produzione di questo video. Riconosciamo Leica Microsystems per gentilmente fornire uno stereoscopio equipaggiato con sistema video e a Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, s. a per aver contribuito con Quaglia fecondate le uova. Questo lavoro è stato supportato da Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Uova fecondate di gallina (Gallus gallus) | Pintobar, Portogallo | Allevamento di pollame | |
| Uova fecondate di quaglia (Coturnix coturnix) | Interaves, Portogallo | Allevamento di uccelli | |
| Provette da centrifuga in PP da 15 mL | Corning | 430052 | |
| Provette da centrifuga in PP da 50 mL | Corning | 430290 | |
| Piastre in pyrex da 60 x 20 mm | Gruppo Duran | 21 755 41 | |
| Piastre in pyrex da 100 x 20 mm | Gruppo Duran | 21 755 48 | |
| Inserto membrana in policarbonato | Corning | 3412 | Pozzetto da 24 mm con inserto a membrana in policarbonato con pori da 0,4 mm |
| Filtro a membrana | Millipore | DTTP01300 | 0,6 mm Filtro a membrana Isopore |
| Piastre di coltura a 6 pozzetti | Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675 | ||
| Piastra di Petri, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Ciotole in | dal supermercato | ||
| Pipette di trasferimento | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL pipetta in plastica |
| Pipetta pasteur in vetro | normax | 5426015 | |
| Whatman carta da filtro qualitativa | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Carta da filtro |
| Nastro | dal supermercato | ||
| Citocheratina (pan; acida e basica, citocheratine di tipo I e II), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Ciclopamina idrato | Sigma-Aldrich | C4116 | Inibitore farmacologico della trasduzione del segnale Hh |
| Fetale Siero bovino | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | dell'anticorpo | |
| QCPN QCPN | QCPN | ||
| RPMI 1640 Medium, integratore GlutaMAX | GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010 | ||
| /B Elastomero siliconico Kit 1,1 kg | ELKEM/Silmid | RH141001KG | Per preparare la base posteriore per la capsula di Petri |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Inibitore farmacologico della segnalazione Notch |
| Reagente TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 Reagente per l'isolamento totale dell'RNA | |
| Dumont #5 Pinze | Strumenti per le scienze fini | 11251-30 | Pinze sottili |
| Forbici Bonn extra fini, curve | Fine Science Tools | 14085-08 | Forbici curve |
| Perni per insetti | Strumenti per la scienza fine | 26001-30 | |
| Micro spatola | Fine Science Tools | 10087-12 | Cucchiaio da trapianto |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microbisturi |
| Moria Nichelato Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Cucchiaio perforato | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Fotocamera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscopio | Leica Microsystems | Microscopio Leica M80 | |
| Leica Microsystems | DM2500 |
Riferimenti
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