Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

Sommario

Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.

Abstract

Microglia rappresentano il 5-10% di tutte le cellule del sistema nervoso centrale (SNC) e sono di disegno sempre più attenzione grazie al loro contributo durante lo sviluppo, l'omeostasi e la malattia. I macrofagi sono stati studiati in dettaglio per decenni, caratteristiche specializzate di microglia, i macrofagi residenti in tessuto del SNC, sono rimaste in gran parte misterioso, in parte a causa di limitazioni nella capacità di ricapitolare microglial maturo Proprietà nella cultura. Qui, vi illustriamo una procedura semplice per l'isolamento rapido di microglia pura da roditore cervello maturo. Descriviamo anche condizioni di coltura privo di siero che supportano alti livelli di redditività microglial nel corso del tempo. Microglia coltivate in queste condizioni definite e medie mostre elaborati processi ramificati e comportamento dinamico sorveglianza. Illustriamo alcuni effetti di esposizione sierica sulla microglia coltivate ed discutere come queste culture senza siero confrontare culture siero-esposti così come il microglia in vivo.

Introduzione

Come i macrofagi del parenchima CNS, microglia interagire con una vasta gamma di circuiti neuronali e gliali reti di segnalazione. Essi svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella omeostasi del cervello attraverso potatura sinaptica, liquidazione delle cellule apoptotiche e transitorie interazioni con processi neuronali^1,2. Le microglia sono primi radar-risponditore a lesioni neurologiche, estendendo le proprie procedure lunghe e sottili ai siti di lesione per coordinare le risposte infiammatorie e limitare il sanguinamento^3,4. Cambiamenti nella morfologia microglial e funzione sono onnipresenti nelle lesioni di CNS sia acute che croniche, e microglia espositivo alterata morfologia, localizzazione ed espressione dei mediatori infiammatori in una vasta gamma di Stati di malattia¹. Gli studi genetici umani indicano che le mutazioni che alterano il rischio per le malattie neurodegenerative sono espressi spesso prevalentemente o esclusivamente da microglia nel SNC intatto, che punta a un ruolo critico di microglia nella patogenesi della malattia o la progressione⁵ . Dato loro risalto nella ferita e nella malattia, favorire la comprensione della biologia microglial è una priorità per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.

Molti avanzamenti critici per la comprensione della biologia microglial sono sorti estrapolando meccanismi scoperti negli studi di altre popolazioni del macrofago, inclusi i metodi di coltura, profili di espressione genica e definizioni di funzionali e tecniche / morfologica degli Stati. Anche se generalizzato del macrofago funzioni spesso giocano fuori in modo sorprendente all'interno del paesaggio di CNS, microglia sono essi stessi altamente specializzata, che esibiscono una morfologia ramificata e una firma di espressione genetica unica che li distingue da altri tessuti macrofagi⁶. Microglia hanno un lignaggio che è distinto dalla maggior parte degli altri macrofagi dei tessuti; Essi colonizzano SNC durante un'ondata di embrionale precoce dell'emopoiesi primitivo e auto-rinnovarsi per tutta la vita, indipendente di contributi da ematopoiesi definitivo⁷. La firma di espressione genica pienamente matura di microglia adulta non viene raggiunta fino alla seconda settimana postnatale⁸. Stimoli ambientali dal tessuto circostante ha un ruolo importante nel dettare tessuto-specifica del macrofago caratteristiche⁶, che nel SNC comprende limitata esposizione ai fattori ematica concesso dalla barriera emato - encefalica⁹.

Un ostacolo alla piena comprensione microglial contributi al CNS omeostasi e malattia è la difficoltà di ricapitolare le proprietà specializzate di microglia maturo visto nel vivo con le cellule purificate in vitro. Sono stati sviluppati molti metodi per isolare e cultura intatta microglia, ma la maggior parte degli approcci si basano su siero per sostenere la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo dimostrato che l'aggiunta di siero, che è un reagente intrinsecamente variabile contenente una vasta gamma di molecole bioattive, è particolarmente problematico quando lavoro con microglia perché promuove una morfologia ameboide, aumento della proliferazione, e fagocitosi aumentata⁹ spesso visto in vivo quando microglia sono esposti a fattori di ematica dopo l'interruzione della barriera sangue - cervello. Di queste metriche, le cellule esposte al siero assomigliano microglia in lesioni o Stati di malattia, ma tali alterazioni sono ridotti quando microglia sono coltivate in mezzo di sviluppo definito contenente CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterolo e selenite.

Questo protocollo fornisce dettagli per la coltura di microglia giovanile del ratto nelle circostanze senza siero, relazionati al lavoro recentemente pubblicato⁹. Questo protocollo è stato ottimizzato per i ratti da giorno postnatale 21-30 (P21 - P30), ma può essere adattato per isolare microglia da ratti e topi di qualsiasi età, anche se resa e redditività complessiva varia a seconda della specie e l'età dell'animale. Maximal cede e redditività ottimale è raggiunta quando si utilizza un po' immatura microglia (~ P9), con rendimenti e vitalità si assottiglia gradualmente per un po ' i livelli più bassi negli animali adulti. Microglia può anche essere isolata dai topi, ma abbiamo trovato che le cellule del ratto mostrano significativamente più alti rendimenti, attuabilità e la complessità delle morfologie ramificate, rispetto alle cellule di topo in culture senza siero. Gli animali di età compresa tra maggiore di P50 non sono state valutate con questo protocollo. Questa procedura di isolamento di immunopanning è stata ottimizzata per minimizzare i cambiamenti nei profili trascrizionali microglial durante l'isolamento e per massimizzare a valle vitalità delle cellule. Utilizzando queste tecniche e formulazioni di media, alta redditività colture primarie possono essere sostenuti per settimane. Microglia in coltura in queste condizioni presentano una morfologia altamente ramificata che coinvolgono rapida estensione e retrazione dei processi e relativamente basso tasso di proliferazione. Evidenziamo il significato di siero-esposizione su queste proprietà e discutere i punti di forza e di debolezza di questo metodo rispetto altri approcci.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono roditori conformano alle linee guida della Stanford University, conformi alle politiche e nazionali e le leggi dello stato. Tutte le procedure di animali sono state approvate dal pannello di amministrazione dell'Università di Stanford sulla cura degli animali di laboratorio.

Nota: Tutte le composizioni di soluzione e buffer sono fornite nella Tabella materiali.

1. preparare una piastra di Petri per CD11b Immunopanning (giorno 0)

Nota: Preparare 1 immunopanning piatto per ogni cervello di ratto giovanile di 1-2.

1. Aggiungere 25 mL di 50 mM Tris soluzione pH 9.5 a una capsula di Petri 15 cm.
2. Aggiungere anti-topo di capra IgG (catene di H + L) al piatto per una concentrazione finale di 6 µ g/mL. Turbinio piastra per distribuire uniformemente.
3. Incubare il piatto per 1-3 h a 37 ° C.
4. Piatti di lavare tre volte con DPBS +⁺ (tampone fosfato salino (PBS) con Ca^{2 +} e Mg^{2 +}), quindi sostituire con una soluzione di panning tampone contenente 1 µ g/mL OX42 anticorpo. Lasciare i piatti durante la notte a temperatura ambiente su una superficie piana.

2. tessuto collezione (giorno 1)

Nota: Questo protocollo dovrebbe prendere circa 3-4 h.

1. Prima di iniziare, verificare che tutte le soluzioni sono sterili e refrigerati sul ghiaccio. Tutti gli strumenti sul ghiaccio di chill e sterilizzare con etanolo prima dell'uso.
2. Seguenti procedure regolamentari appropriate, sacrificare un topo di laboratorio giovanile da asfissia di anidride carbonica.
   Nota: In alternativa, gli animali più giovani possono essere sacrificati con una dose letale di chetamina/xilazina (100-200 µ l di 24 mg/mL di ketamina, xilazina 2,4 mg/mL). Chetamina/xilazina deve essere utilizzato se gli animali sono meno di 14 giorni di età. Se si utilizza più animali, estrarre il tessuto da un animale e inserirlo pre-refrigerati DPBS +⁺ sul ghiaccio prima di procedere alla successivi animali.
3. Pizzicare un hindpaw e garantire l'apatia completa dall'animale prima di procedere.
4. Via irrorare l'animale con 10-30 mL di buffer di aspersione ghiacciata utilizzando un ago 27½-G fino a quando il buffer viene eseguito chiaro.
   Nota: Il Volume di tampone di aspersione variano a seconda la dimensione/età dell'animale.
5. Subito dopo aspersione rimuovere la testa dell'animale. Provenienti dal midollo spinale tagliato il condilo occipitale su ogni lato con le forbici di dissezione, fare attenzione a non danneggiare il cervello. Dopo aver tagliato attentamente ogni lato, tagliare un lato lungo parietali e osso frontale verso l'osso nasale. Con il forcipe attentamente tirare indietro la parte superiore del cranio, rimuovere rapidamente il cervello (o strutture CNS di interesse) e mettere in pre-refrigerati DPBS +⁺ sul ghiaccio.
6. Ripetere per tutti gli animali restanti.
   Nota: Tutte le fasi del procedimento dovrebbero essere eseguite in una cappa a flusso laminare in adeguate condizioni di sterilità.

3. meccanica dissociazione (giorno 1)

1. Dopo tutti i cervelli sono stati raccolti, tritare un cervello tocchetti³ a 1 mm in una capsula Petri sul ghiaccio con un bisturi freddo e trasferire a un omogeneizzatore lisata ghiacciata con 5-7 mL di tampone douncing ghiacciata. Dissociare un cervello alla volta.
2. Dissociare il tessuto usando tratti di dolce e incomplete di 10-20 con un omogeneizzatore lisata larghi. Fare attenzione a non schiacciare direttamente il tessuto nella parte inferiore dell'omogeneizzatore, ma invece spingono il tessuto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e l'omogeneizzatore.
3. Rimuovere delicatamente il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Consenti blocchi di tessuto scarsamente dissociato a stabilirsi a fondo l'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da refrigerata 50 mL.
4. Sostituire il volume rimosso con buffer di douncing fresco e ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 per un totale di 3-4 giri, o fino a quando tutto il tessuto è stato dissociato. Ripetere la procedura per ogni cervello.

4. mielina rimozione (giorno 1)

Nota: Rimozione di mielina è utilizzato per l'isolamento di microglia da animali più vecchi di P12.

1. Misurare il volume della sospensione cellulare in tubo conico da 50 mL utilizzando una pipetta 25 mL, quindi aggiungere tampone douncing ghiacciata per regolare il volume totale di 33,5 mL.
2. Aggiungere 10 mL di tampone di separazione della mielina (MSB) sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta diverse volte. Questo si tradurrà in una concentrazione finale di 23% di MSB in un volume di 43,5 mL.
3. Centrifugare le cellule per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta.
   Nota: La centrifuga dovrebbe prendere circa 1.5-2 min per decelerare. Questo genererà uno strato superiore di mielina e detriti cellulari morti, un surnatante un po' torbida e una più piccola a pellet che si arricchisce di cellule vive.
4. Rimuovere lo strato superiore di residui del myelin e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per garantire come gran parte di essa viene rimosso come possibile.
5. Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di tampone di panning. Delicatamente e triturare la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi di cellule che potrebbero rimanere.

5. Immunopanning (giorno 1)

1. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm per rimuovere detriti di grandi dimensioni o grumi di cellule.
2. Risciacquare il piatto panning rivestite con OX42 tre volte con DPBS +⁺. Non fate la piastra completamente asciutto tra i lavaggi.
3. Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS +⁺ e applicare la sospensione cellulare filtrata al piatto panning. Delicatamente la piastra per distribuire le cellule di turbinio, quindi incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Incubare per non più di 20 min o cellule diventerà molto difficile recuperare dal piatto.
4. Risciacquare il piatto panning con DPBS +⁺ 10 volte per rimuovere le cellule non-aderenti. Microglia sarà così saldamente fissato alla piastra, agitare la piastra con ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti.
5. Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS +⁺ e sostituire con 15 mL DPBS +⁺ e 200 μL tripsina (1,25% soluzione di riserva).
6. Incubare il piatto per ≤ 10 min a 37 ° C con 10% CO₂ per tripsinizzano.
   Nota: Non continuare più di 10 min o microglia diventerà difficile da rimuovere.
7. Dopo 10 min di trypsinization, microglia sarà ancora bloccata alla piastra. Versare fuori tripsina/DPBS +⁺ e lavare delicatamente 2x con DPBS +⁺ per rimuovere la tripsina, sostituire con 12 mL di terreno di coltura di microglia ghiacciata (MGM).
8. Posto panning piatto sul ghiaccio per 2 min per indebolire l'interazione cellula/substrato e assicurarsi che il piatto è piatto per evitare zone del panning piatto dall'asciugarsi.
9. Pipettare vigorosamente con un controller di pipetta e dispensare 10 mL ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto panning. Disegnare una 16x16 griglia con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule.
10. Controllare le cellule al microscopio a 20 ingrandimenti per assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra. Mark macchie sulla parte superiore del piatto dove le cellule sono ancora bloccate e ripetere il pipettaggio in quelle zone.
11. Raccogliere la sospensione cellulare e aliquota 3-4 mL di surnatante per provetta conica da 15 mL. Spin per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta.
    Nota: Microglia attraverso un piccolo volume di filatura consente il massimo recupero delle cellule.
12. Aspirare il supernatante, lasciando 0,5 mL di MGM con il pellet cellulare.
13. Ogni risospendere in MGM rimanenti e le cellule da tutti i tubi della piscina.
14. Contare le celle con un emocitometro.
15. Cellule di piastra come descritto nei passaggi 6 - 7 a seconda dell'applicazione.
16. Cellule di coltura a 37 ° C con 10% CO₂.
    Nota: Le cellule possono essere cultura per fino a 3-4 settimane con le modifiche di supporto regolare o una settimana senza modifiche di media.

6. posto rivestimento piastre/lamelle di coltura tissutale (giorno 1)

1. Piastra 15 µ l di rivestimento di collagene IV direttamente nel centro di una piastra di coltura del tessuto rivestito 24 pozzetti anionici/cationici (per dettagli, vedere Tabella materiali ) e incubare per 15 min a 37 ° C con 10% CO₂.
2. Dopo il conteggio di cellule con un emocitometro diluire le cellule a 2.3 x 105/ml in MGM. Aspirare il collagene IV spot e immediatamente piastra 15 µ l di sospensione cellulare fino a questo punto; Questo vi darà 3,5 x 10 cellule/spot³ . Incubare per 5-10 min a 37 ° C con 10% CO₂ per consentire alle cellule di aderire, aggiungere 500 µ l di CO_{2 -}equilibrata contenente il mezzo di crescita TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC) delicatamente al pozzo.
3. Se placcatura sulle lamelle, primo cappotto sterile vetrini coprioggetti con 10 µ g/mL stratagemma-D-lisina (PDL) in H₂O per 1h a RT, lavare 3 volte con H₂O e lasciare asciugare in una cappa sotto luce UV. Una volta che le lamelle sono asciutte, procedere con spot placcatura su lamelle come descritto al punto 6.2.

7. placcatura per isolamento di RNA/proteine

1. Il giorno 1, cappotto l'intera area di un 24 pozzetti anionici/cationici rivestite in lamiera di coltura del tessuto con rivestimento in collagene IV e incubare per 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO₂, quindi rimuovere e immediatamente piastra 3-5 x 10⁴ cellule/pozzetto in CO₂ equilibrato Media TIC.
2. Il giorno 2, eseguire una variazione media del 50% per ogni bene il giorno dopo la preparazione. Le cellule morte tendono a cluster al centro del pozzo, così prendono i media da lì.
3. Eseguire una modifica di media 50% ogni 2-3 giorni per mantenere le culture. Se le modifiche di supporto introducano una variabile di indesiderate per le culture, le cellule possono sopravvivere per circa una settimana, senza alcuna modifica di media, al contrario di oltre 3 settimane con una manutenzione regolare.

Risultati

Questo protocollo descrive un metodo di cultura elevata purezza ramificata microglia da ratti giovani. Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando animali immaturi, perinatali e adulti, come discusso di seguito. Poiché gli isolamenti delle cellule includono spesso sottili sfumature e molte opportunità per cellule di morire, abbiamo usato i punti di controllo di controllo di qualità per aiutare a determinare il successo alle varie fasi. Abbiamo controllato in genere sospensioni ce...

Discussione

Poiché microglia fungono da cellule immunitarie sentinella del SNC, sono altamente sensible a reagire ai cambiamenti ambientali; di conseguenza, molta cura è necessaria per ridurre le risposte infiammatorie all'interno delle cellule durante il loro isolamento e cultura⁸. Questa operazione viene eseguita in questo protocollo attraverso velocità e temperatura. Ogni qualvolta possibile riduce notevolmente l'attivazione, quindi tutte le fasi di centrifugazione prendere posto a 4 ° C, mantenendo le cel...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ratto: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
topo anti-ratto CD11b monoclonale (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1.000; Colorazione: 1:500
Capra policolonale anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Colorazione: 1:500
Coniglio policlonale anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Macchia: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Colorazione: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-capra 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Colorazione: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Colorazione: 1:500
Triton-X (detergente in colorazione ICC)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan solfato	Galeno Forniture da laboratorio	Cat# GAG-HS01
Eparina	Sigma	Cat# M3149
Peptone da solidi del latte	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Lana di Pecora Colesterolo	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagene IV	Corning	Cat # 354233
Acido oleico	Cayman Chemicals	Cat # 90260
11 (Z) Eicosadienoic (Gondoic) Acido	Cayman Chemicals	Gatto # 20606
Calceina AM colorante	Invitrogen Gatto	# C3100MP
Etidio omodimero-1	Invitrogeno	Gatto # E1169
DNaseI	Worthington	Gatto # DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Gatto # 17-5445-02
Tripsina	Sigma	Gatto # T9935
DMEM / F12	Gibco	Gatto # 21041-02
Penicillina / Streptomicina	Gibco	Gatto # 15140-122
Glutammina	Gibco	Gatto # 25030-081
N-acetil cisteina	Sigma	Cat # A9165
Insulina	Sigma	Cat # 16634
Apo-transferrina	Sigma	Cat # T1147
Selenito di sodio	Sigma	Cat # S-5261
DMEM (alto glucosio)	Gibco	Cat # 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat # 0100-20
Poli-D-Lisina	Piastre Sigma	Cat# A-003-E
Primaria	VWR	Cat# 62406-456
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Reagenti di riserva
Apo-transferrina			Ricostituzione: 10 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -20 gradi; C
N-acetil cisteina			Ricostituzione: 5 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C
Selenito			Ricostituzione: 2,5 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:25.000 Conservazione: -20 gradi; C
Collagene IV			Ricostituzione: 200 μ g/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -80° C
TGF-b2			Ricostituzione: 2 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C
IL-34			Ricostituzione: 200 μ g/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -80° C
Lana di pecora colesterolo			Ricostituzione: 1,5 mg/mL in etanolo al 100% Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C
Eparan solfato			Ricostituzione: 1 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C
Acido oleico/Acido			Ricostituzione: Gondoico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL in etanolo al 100% Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Stoccaggio: -20 gradi; C
Ricostituzione dell'eparina			: 50 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -20 gradi; C
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Solutions  Ricetta tampone
Perfusion:			50 μ g/mL di eparina in DPBS++ (PBS con Ca++ e Mg+ +) Commenti: Utilizzare quando ghiacciato
Douncing Buffer			Ricetta: 200 μ L di 0,4% DNaseI in 50 mL di DPBS++ Commenti: Utilizzare quando il Panning ghiacciato
Ricetta del tampone			: 2 mg/mL di peptone da solidi del latte in DPBS++
Terreno di crescita della microglia (MGM)			Ricetta: DMEM/F12 contenente 100 unità/mL di penicillina, 100 μ g/mL di streptomicina, 2 mM di glutammina, 5 μ g/mL di N-acetil cisteina, 5 μ g/mL di insulina, 100 μ g/mL di apo-transferrina e 100 ng/mL di selenito di sodio Commenti: Utilizzare MGM ghiacciato per estrarre la microglia dal piatto di immnopanning.
Ricetta del rivestimento			: MGM contenente 2 μ g/mL di collagene IV
		separazione della mielina	Ricetta: 9 mL di Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS senza Ca++ e Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2 Commenti: Mescolare bene dopo l'aggiunta di  CaCl2 e MgCl2
TGF-b2/IL-34/Colesterolo contenente mezzi di crescita (TIC)			Ricetta: MGM contenente 2 ng/mL di TGF-b2 umano, 100 ng/mL di IL-34 murino, 1,5 μ g/mL di colesterolo della lana ovina, 10 μ g/mL di eparan solfato, 0,1 μ g/ml di acido oleico e 0,001 μ g/ml di acido gondoico Commenti: Assicurati di aggiungere colesterolo ai terreni riscaldati a 37 gradi C e non aggiungere più di 1,5 μ g/mL o precipiterà fuori. Non filtrare i terreni contenenti colesterolo. Equilibrare il terreno TIC con il 10% di CO2 per 30 minuti-1 ora prima di aggiungerlo alle cellule per assicurare un pH ottimale.

di sodio gondoico di collagene IVTampone di