Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microglia rappresentano il 5-10% di tutte le cellule del sistema nervoso centrale (SNC) e sono di disegno sempre più attenzione grazie al loro contributo durante lo sviluppo, l'omeostasi e la malattia. I macrofagi sono stati studiati in dettaglio per decenni, caratteristiche specializzate di microglia, i macrofagi residenti in tessuto del SNC, sono rimaste in gran parte misterioso, in parte a causa di limitazioni nella capacità di ricapitolare microglial maturo Proprietà nella cultura. Qui, vi illustriamo una procedura semplice per l'isolamento rapido di microglia pura da roditore cervello maturo. Descriviamo anche condizioni di coltura privo di siero che supportano alti livelli di redditività microglial nel corso del tempo. Microglia coltivate in queste condizioni definite e medie mostre elaborati processi ramificati e comportamento dinamico sorveglianza. Illustriamo alcuni effetti di esposizione sierica sulla microglia coltivate ed discutere come queste culture senza siero confrontare culture siero-esposti così come il microglia in vivo.
Introduzione
Come i macrofagi del parenchima CNS, microglia interagire con una vasta gamma di circuiti neuronali e gliali reti di segnalazione. Essi svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella omeostasi del cervello attraverso potatura sinaptica, liquidazione delle cellule apoptotiche e transitorie interazioni con processi neuronali1,2. Le microglia sono primi radar-risponditore a lesioni neurologiche, estendendo le proprie procedure lunghe e sottili ai siti di lesione per coordinare le risposte infiammatorie e limitare il sanguinamento3,4. Cambiamenti ne....
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono roditori conformano alle linee guida della Stanford University, conformi alle politiche e nazionali e le leggi dello stato. Tutte le procedure di animali sono state approvate dal pannello di amministrazione dell'Università di Stanford sulla cura degli animali di laboratorio.
Nota: Tutte le composizioni di soluzione e buffer sono fornite nella Tabella materiali.
1. preparare una piastra di Petri per CD11b Immunopanning (giorno 0)
Nota: Preparare 1 immunopanning piatto per ogni cervello di ratto giovanile di 1-2.
- Aggiungere 25....
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Risultati
Questo protocollo descrive un metodo di cultura elevata purezza ramificata microglia da ratti giovani. Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando animali immaturi, perinatali e adulti, come discusso di seguito. Poiché gli isolamenti delle cellule includono spesso sottili sfumature e molte opportunità per cellule di morire, abbiamo usato i punti di controllo di controllo di qualità per aiutare a determinare il successo alle varie fasi. Abbiamo controllato in genere sospensioni ce.......
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Discussione
Poiché microglia fungono da cellule immunitarie sentinella del SNC, sono altamente sensible a reagire ai cambiamenti ambientali; di conseguenza, molta cura è necessaria per ridurre le risposte infiammatorie all'interno delle cellule durante il loro isolamento e cultura8. Questa operazione viene eseguita in questo protocollo attraverso velocità e temperatura. Ogni qualvolta possibile riduce notevolmente l'attivazione, quindi tutte le fasi di centrifugazione prendere posto a 4 ° C, mantenendo le cel.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Christopher e Dana Reeve Foundation International Research Consortium sulla ferita del midollo spinale, il Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fondazione di JPB, la Novartis Istituto di ricerca di base, generosi contributi da Vincent e Stella Coates e il Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ratto: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| topo anti-ratto CD11b monoclonale (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1.000; Colorazione: 1:500 |
| Capra policolonale anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Colorazione: 1:500 |
| Coniglio policlonale anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Macchia: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Colorazione: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-capra 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Colorazione: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Colorazione: 1:500 |
| Triton-X (detergente in colorazione ICC) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan solfato | Galeno Forniture da laboratorio | Cat# GAG-HS01 | |
| Eparina | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone da solidi del latte | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β 2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R& D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Lana di Pecora Colesterolo | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagene IV | Corning | Cat # 354233 | |
| Acido oleico | Cayman Chemicals | Cat # 90260 | |
| 11 (Z) Eicosadienoic (Gondoic) Acido | Cayman Chemicals | Gatto # 20606 | |
| Calceina AM colorante | Invitrogen Gatto | # C3100MP | |
| Etidio omodimero-1 | Invitrogeno | Gatto # E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Gatto # DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Gatto # 17-5445-02 | |
| Tripsina | Sigma | Gatto # T9935 | |
| DMEM / F12 | Gibco | Gatto # 21041-02 | |
| Penicillina / Streptomicina | Gibco | Gatto # 15140-122 | |
| Glutammina | Gibco | Gatto # 25030-081 | |
| N-acetil cisteina | Sigma | Cat # A9165 | |
| Insulina | Sigma | Cat # 16634 | |
| Apo-transferrina | Sigma | Cat # T1147 | |
| Selenito di sodio | Sigma | Cat # S-5261 | |
| DMEM (alto glucosio) | Gibco | Cat # 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat # 0100-20 | |
| Poli-D-Lisina | Piastre Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Reagenti di riserva | |||
| Apo-transferrina | Ricostituzione: 10 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -20 gradi; C | ||
| N-acetil cisteina | Ricostituzione: 5 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C | ||
| Selenito | Ricostituzione: 2,5 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:25.000 Conservazione: -20 gradi; C | ||
| Collagene IV | Ricostituzione: 200 μ g/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -80° C | ||
| TGF-b2 | Ricostituzione: 2 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C | ||
| IL-34 | Ricostituzione: 200 μ g/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -80° C | ||
| Lana di pecora colesterolo | Ricostituzione: 1,5 mg/mL in etanolo al 100% Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C | ||
| Eparan solfato | Ricostituzione: 1 mg/mL in H2O Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Conservazione: -20 gradi; C | ||
| Acido oleico/Acido | Ricostituzione: Gondoico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL in etanolo al 100% Concentrazione utilizzata: 1:1.000 Stoccaggio: -20 gradi; C | ||
| Ricostituzione dell'eparina | : 50 mg/mL in PBS Concentrazione utilizzata: 1:100 Conservazione: -20 gradi; C | ||
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Solutions Ricetta tampone | |||
| Perfusion: | 50 μ g/mL di eparina in DPBS++ (PBS con Ca++ e Mg+ +) Commenti: Utilizzare quando ghiacciato | ||
| Douncing Buffer | Ricetta: 200 μ L di 0,4% DNaseI in 50 mL di DPBS++ Commenti: Utilizzare quando il Panning ghiacciato | ||
| Ricetta del tampone | : 2 mg/mL di peptone da solidi del latte in DPBS++ | ||
| Terreno di crescita della microglia (MGM) | Ricetta: DMEM/F12 contenente 100 unità/mL di penicillina, 100 μ g/mL di streptomicina, 2 mM di glutammina, 5 μ g/mL di N-acetil cisteina, 5 μ g/mL di insulina, 100 μ g/mL di apo-transferrina e 100 ng/mL di selenito di sodio Commenti: Utilizzare MGM ghiacciato per estrarre la microglia dal piatto di immnopanning. | ||
| Ricetta del rivestimento | : MGM contenente 2 μ g/mL di collagene IV | ||
| separazione della mielina | Ricetta: 9 mL di Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS senza Ca++ e Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2 Commenti: Mescolare bene dopo l'aggiunta di CaCl2 e MgCl2 | ||
| TGF-b2/IL-34/Colesterolo contenente mezzi di crescita (TIC) | Ricetta: MGM contenente 2 ng/mL di TGF-b2 umano, 100 ng/mL di IL-34 murino, 1,5 μ g/mL di colesterolo della lana ovina, 10 μ g/mL di eparan solfato, 0,1 μ g/ml di acido oleico e 0,001 μ g/ml di acido gondoico Commenti: Assicurati di aggiungere colesterolo ai terreni riscaldati a 37 gradi C e non aggiungere più di 1,5 μ g/mL o precipiterà fuori. Non filtrare i terreni contenenti colesterolo. Equilibrare il terreno TIC con il 10% di CO2 per 30 minuti-1 ora prima di aggiungerlo alle cellule per assicurare un pH ottimale. |
Riferimenti
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development ....
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Ristampe e permessi
