Articolo metodologico

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DOI:

10.3791/57146

⸱

30 aprile 2018

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1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

In questo articolo

Sommario

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Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Abstract

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Tempo di replicazione del DNA è una caratteristica importante di cellulare, che esibiscono le relazioni significative con i tassi di mutazione del DNA, trascrizione e struttura della cromatina. Cambiamenti nel tempo di replicazione si verificano durante lo sviluppo e nel cancro, ma il tempo di replicazione di ruolo svolge nello sviluppo e la malattia non è noto. Zebrafish recentemente sono stati stabiliti come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di zebrafish per determinare il tempo di replicazione del DNA. Dopo l'ordinamento delle cellule da embrioni e zebrafish adulto, ad alta definizione modelli di genoma del DNA replica temporizzazione possono essere costruiti determinando cambiamenti nel numero di copia di DNA attraverso l'analisi dei dati di sequenziamento di generazione successivi. Il sistema di modello di Danio rerio consente per la valutazione dei cambiamenti di temporizzazione di replica che si verificano in vivo durante lo sviluppo e può anche essere utilizzato per valutare i cambiamenti nei tipi di cellule individuali, modelli di malattia o linee mutanti. Questi metodi consentirà gli studi che studiano i meccanismi e i fattori determinanti di replica temporizzazione stabilimento e manutenzione durante lo sviluppo, il tempo di replicazione di ruolo gioca a mutazioni e tumorigenesi e gli effetti di perturbazione tempo di replicazione su sviluppo e malattia.

Introduzione

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Per cellule a dividersi con successo, essi devono essere prima accuratamente e fedelmente replicate loro intero genoma. Duplicazione del genoma si verifica in un modello riproducibile, noto come il DNA replica temporizzazione programma1. Tempo di replicazione del DNA è correlata con l'organizzazione della cromatina, segni epigenetici e gene expression2,3. Cambiamenti nel tempo di replicazione si verificano nel corso dello sviluppo e sono significativamente correlati a trascrizionale programmi e alterazioni della cromatina marchi e organizzazione4,

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Protocollo

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Tutti gli animali erano gestiti in stretta conformità con protocolli approvati dal comitato di uso e Oklahoma Medical Research Foundation istituzionali cura degli animali.

1. configurazione di zebrafish adulto per l'allevamento

  1. Utilizzare un'ampia coorte di zebrafish adulto maschio e femmina di un singolo ceppo per l'allevamento. Ci sono piccole differenze nel corredo genetico di zebrafish di persino un singolo ceppo, utilizzare un'ampia coorte affinché i risultati siano rappresentativi della variabilità genetica della popolazione e non limitato a un piccolo sottoinsieme della popolazione.
  2. La notte prima che gli embrioni....

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Risultati

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Utilizzando dati di intervallo di replica pubblicati, rappresentante replica temporizzazione profili e misure di controllo di qualità sono disponibili15. I passi iniziali dell'elaborazione coinvolgono allineando i dati di sequenziamento del genoma, calcolo lunghezza lettura e statistiche relative alla copertura del genoma e il filtraggio di bassa qualità, spaiati, e letture duplicate PCR. Statistiche di lettura per un esempio di sequenziamento di zebrafish tipici s.......

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Discussione

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Zebrafish forniscono un sistema di modello nuovo e unico in vivo per studiare tempo di replicazione del DNA. Quando temporizzati accoppiamenti vengono eseguiti come dettagliato in questo protocollo sperimentale, migliaia di embrioni possa essere raccolti in un solo giorno per esperimenti. Questi embrioni si sviluppano in modo sincrono attraverso stadi di sviluppo precisamente cronometrati e distintamente caratterizzati. Zebrafish può essere facilmente ed accuratamente organizzato dalla morfologia utilizzando un .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health attraverso concede 5P20GM103636-02 (tra cui il supporto core citometria a flusso) e 1R01GM121703, come pure premi dal centro di Oklahoma per cellule staminali adulte. Ricerca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NaClFisher ScientificBP358-10
KClFisher ScientificP217-500
CaCl2Fisher ScientificC79-500
MgSO4EMD MilliporeMMX00701
NaHCO3Fisher ScientificBP328-500
Soluzione diproteasiPronasi Sigma 10165921001
salina tamponata con fosfato (PBS)SigmaD1408
Etanolo (EtOH)KOPTECV1016
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA9647-100G
Ioduro di propidio (PI)InvitrogenP3566
Tris-HClFisher ScientificBP153-500
EDTASigmaE9844
SDSSanta Cruzsc-24950
Proteinasi KNEBP8107S
Fenolo: CloroformioSigmaP3803-100ML
Acetato di sodioJ.T.Baker3470
GlicogenoAmbionAM9510
RNasi AThermo ScientificEN0531
Quanit-iTInvitrogenQ33130Reagenti per la quantificazione del DNA basata sulla fluorescenza
Covaris AFA microTUBECovaris520045provetta specializzata per la sonicazione
Covaris E220 SonicatoreCovarisE220Ultrasuoni focalizzati
Agilent 4200 TapestationAgilentG2991AAmacchina per elettroforesi automatizzata
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582Reagenti per macchina per elettroforesi automatizzata
NEBNext Kit di preparazione della libreria di DNA Ultra per IlluminaNEBCat#E7370LKit di preparazione della libreria di DNA
NEBNext Kit di oligo multiplex per Illumina (Index Primers Set 1)NEBCat#E7335Soligo multiplex per kit
di preparazione della libreria di DNANEBNext Multiplex Oligos Kit per Illumina (Index Primers Set 2)NEBCat#E7500Soligo multiplex per kit di preparazione della libreria
di DNA NEBNext Library Quant Kit per IlluminaNEBE7630Lkit di quantificazione per la preparazione della libreria
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882perline magnetiche
Illumina HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501Piattaforma di sequenziamento del DNA di nuova generazione
40 & micro; m Filtro cellulare in nylon FalconFisher Scientific08-771-1
VWR Piastra di Petri monouso 100 x 25 mmVWR89107-632
Siringa da 6,0 ml per Nichiryo Modello 8100VWR89078-446
Provette Posi-Click, 1,7 mL, colore naturaleDenville ScientificC2170 (1001002)Senza Dnase/RNASI
Vortex Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Flaconi di lavaggioVWR16650-022Polietilene a bassa densità, filtro a bocca larga
VWR470092-4406,9 cm, vasca
di corpettoAcquariofiliaZHCT100vasca di riproduzione individuale
iSpawnTechniplastN/A grandevasca di riproduzione
FACSAria IIBD biosciencesN/Aselezionatrice cellulare
Wild M5a steromicroscopioWild Heerbrugg Microscopioda dissezioneN/A
Qubit 3 FluorimeterThermo ScientificQ33216metodo quantitativo basato sulla fluorescenza per determinare la concentrazione di DNA
MatlabMathworksversione 2017a
Matlab Statistics ToolboxMathworksversione 11.1
Matlab Curve Fitting ToolboxMathworksversione 3.5.5
Soluzione ulteriori a maglia fine

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  2. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  3. Rivera-Mulia, J. C., et al.

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Ristampe e permessi

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DNA Replication TimingZebrafish EmbryosCell SortingNext Generation SequencingPropidium Iodide StainingFlow CytometryGenome wide AnalysisReplication Fork InitiationEmbryonic Development StagesSingle cell Suspension

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