Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana

Summary

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana utilizzando l'associazione del ricevitore dell'ordinamento, sortilina, per il primo ciclo di luminal della proteina del trasportatore del glucosio, GLUT4, ad esempio.

Abstract

La nostra capacità di esplorare le interazioni proteina-proteina è la chiave per comprendere collegamenti normativi nella cella. Tuttavia, rilevamento delle interazioni proteina-proteina in molti casi è associata con sfide sperimentali significative. In particolare, smistamento recettori interagiscono con il loro carico di proteine nel lume dei compartimenti di membrana spesso in maniera sensibile detergente, rendendo inutilizzabile la co-immunoprecipitazione di queste proteine. Associazione dell'ordinamento sortilina recettore al trasportatore di glucosio che GLUT4 può servire come un esempio di Luminale deboli interazioni tra proteine di membrana. Qui, descriviamo un test veloce, semplice e poco costoso per convalidare l'interazione tra sortilina e GLUT4. Per questo, abbiamo progettato e sintetizzato chimicamente il peptide myc-tagged corrispondente per l'epitopo sortilina-associazione potenziale nella parte luminale di GLUT4. Sortilina taggato con sei istidine è stato espresso in cellule di mammifero e isolato da lisati cellulari usando le perle di cobalto. Sortilina immobilizzata sulle perle è stato incubato con la soluzione del peptide a valori di pH diversi, e il materiale è stato analizzato mediante Western blotting. Questo test può essere facilmente adattato per studiare altre interazioni proteine sensibili al detersivo.

Introduction

GLUT4 è una proteina del trasportatore del glucosio che si esprime principalmente in cellule di grasso e muscolo scheletrico dove media l'effetto dell'insulina, il glucosio post-prandiale sangue liquidazione¹. Essendo una proteina molto stabile, GLUT4 è regolamentata a livello post-traduzionale. In assenza di insulina, GLUT4 è in gran parte esclusi dalla membrana plasmatica (quindi bassa permeabilità basale per glucosio) ed è localizzata principalmente all'interno della cellula in piccole vescicole insulina-sensible a reagire (IRVs) e trans-Golgi network (TGN) che rischia di rappresentare il vano di donatore IRV. Somministrazione di insulina, i....

Protocol

1. movimentazione del Peptide

1. Progettazione e ordinazione del peptide
   1. Scegliere la sequenza desiderata del peptide e aggiungere un tag, ad esempio myc epitopo (EQKLISEED) presso suo entrambi N - o C-terminus.
   2. Controllare la solubilità prevista del peptide in acqua, usando peptide solubilità calcolatrice http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se la solubilità è basso, provare ad aggiungere un altro tag solubile in acqua per cambiare il bilanciamento di carica.
      Nota: Abbiamo usato il peptide corrispondente al primo ciclo luminal (fll) di GLUT4 taggati con l'epitopo di myc (grassetto) al capolinea N (Myc-fll-GLUT4): LNAPQKVI....

Results

Lisati sono stati preparati da 3T3 L1 cellule transfettate stabile con sortilina-myc/His⁵ e da cellule WT 3T3 L1, usate come controllo negativo. Entrambi lisati sono stati incubati con perle di cobalto a pH 6 o pH 8 e lavate accuratamente. Perline con proteine immobilizzate sono state incubate nella soluzione di Myc-fll-Glut4. Dopo attenti lavaggi, proteine legate ai talloni sono stati eluiti con 0,25 M imidazolo. Campioni sono stati sottoposti, insieme con i lisat.......

Discussion

Sortilina è un recettore di evolutiva conservata multi-ligando proteina che è coinvolta in entrambi segnalazione alla membrana del plasma e intracellulare ordinamento eventi^6,7. Tuttavia, la ricerca di ligandi di sortilina autentico (alcuni dei quali sono proteine di membrana luminale o integrale) è complicata come l'interazione di sortilina con alcuni dei suoi partner di associazione sembra essere sensibili ai detersivi. Di conseguenza, un facile e un approccio .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma	P8849	per l'uso nella purificazione della proteina tag dell'istidina
Soluzione salina tamponata con fosfato	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Siringa da insulina U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Kit per il dosaggio delle proteine	Pierce	23228
Tampone di lavaggio	Boston BioProducts	BP-234	Per la purificazione delle proteine His-tag
HisPur Resina di cobalto	Thermo Scientific	89964
Tampone campione di tricina	Bio-Rad	161-0739	con SDS, bMercaptaethanol dovrebbe essere aggiunto
Eluizione  Tampone	Boston BioProducts	BP-236	per la purificazione delle proteine His-tag con 250mM di imidazolo
Mini-Protean Tris-Tricine gel prefabbricati 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Per la separazione di peptidi e piccole proteine
Tris/Tricine/SDS che eseguono il tampone	Bio-Rad	161-0744
Tampone di trasferimento	Boston BioProducts	BP-190	Aggiungi il 20% di metanolo
Membrana in nitrocellulosa   0,45 mm	Bio-Rad	1620115
Albumina sierica bovina	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc	anticorpo Segnalazione cellulare	2272
Peptide di	Genscipt		Personalizza l'ordine
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374