Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana

Sommario

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana utilizzando l'associazione del ricevitore dell'ordinamento, sortilina, per il primo ciclo di luminal della proteina del trasportatore del glucosio, GLUT4, ad esempio.

Abstract

La nostra capacità di esplorare le interazioni proteina-proteina è la chiave per comprendere collegamenti normativi nella cella. Tuttavia, rilevamento delle interazioni proteina-proteina in molti casi è associata con sfide sperimentali significative. In particolare, smistamento recettori interagiscono con il loro carico di proteine nel lume dei compartimenti di membrana spesso in maniera sensibile detergente, rendendo inutilizzabile la co-immunoprecipitazione di queste proteine. Associazione dell'ordinamento sortilina recettore al trasportatore di glucosio che GLUT4 può servire come un esempio di Luminale deboli interazioni tra proteine di membrana. Qui, descriviamo un test veloce, semplice e poco costoso per convalidare l'interazione tra sortilina e GLUT4. Per questo, abbiamo progettato e sintetizzato chimicamente il peptide myc-tagged corrispondente per l'epitopo sortilina-associazione potenziale nella parte luminale di GLUT4. Sortilina taggato con sei istidine è stato espresso in cellule di mammifero e isolato da lisati cellulari usando le perle di cobalto. Sortilina immobilizzata sulle perle è stato incubato con la soluzione del peptide a valori di pH diversi, e il materiale è stato analizzato mediante Western blotting. Questo test può essere facilmente adattato per studiare altre interazioni proteine sensibili al detersivo.

Introduzione

GLUT4 è una proteina del trasportatore del glucosio che si esprime principalmente in cellule di grasso e muscolo scheletrico dove media l'effetto dell'insulina, il glucosio post-prandiale sangue liquidazione¹. Essendo una proteina molto stabile, GLUT4 è regolamentata a livello post-traduzionale. In assenza di insulina, GLUT4 è in gran parte esclusi dalla membrana plasmatica (quindi bassa permeabilità basale per glucosio) ed è localizzata principalmente all'interno della cellula in piccole vescicole insulina-sensible a reagire (IRVs) e trans-Golgi network (TGN) che rischia di rappresentare il vano di donatore IRV. Somministrazione di insulina, il IRVs si fondono con la membrana plasmatica e consegnare GLUT4 al sito del suo funzionamento. Questo aumenta la permeabilità della membrana del plasma per il glucosio, in modo che l'assorbimento di glucosio dal sangue in adipociti e miociti scheletrici aumenta 10 a 40 volte. Dopo il ritiro di insulina, GLUT4 è interiorizzato in endosomi precoce/ordinamento e quindi estratto a TGN dove il IRVs sono ri-formata. Sia l'ordinamento passi nel pathway di GLUT4, cioè recupero dall'endosomi precoce periferici ad perinucleare TGN e la formazione del IRVs sul donatore TGN membrane sono abilitate per il membro della famiglia Vps10p, sortilina, che rappresenta un tipo la proteina del transmembrane e un recettore ordinamento. Secondo un modello, sortilina funziona come una proteina transmembrana impalcatura: si lega GLUT4 in lumen del endosomi e TGN e reclute retromer o clatrina adattatori al lato citoplasmico del donatore membrana tramite suo C-terminus^{2, 3}. questo facilita la distribuzione di GLUT4 in vettori vescicolari che traslocano GLUT4 tra compartimenti intracellulari.

L'interazione della coda citoplasmatica di sortilina con retromer e varie proteine adattatrici è stata ben documentata. Tuttavia, l'associazione di sortilina per GLUT4 (e molti dei suoi altri ligandi di proteina) è stato impegnativo per dimostrare. In particolare, i tentativi di co-immunoprecipitate sortilina e GLUT4 non hanno avuto successo probabilmente a causa della natura sensibile detergente dell'interazione tra queste due proteine. Inoltre, come una proteina di trasporto tipico, GLUT4 ha 12 domini transmembrane e 6 anelli di luminal qualsiasi combinazione di cui potenzialmente può rappresentare un luogo sortilina-legante. Allo stesso tempo, un grande corpo di prova indiretta, ad esempio la sostanziale co-localizzazione nella cella, cross-linking con membrana permeabile DSP e l'interazione in due sistema ibrido del lievito suggeriscono che sortilina può associare a GLUT4. Inoltre, utilizzando l'approccio di quest'ultimo in combinazione con l'alanina scansione mutagenesi, precedentemente abbiamo determinato che il dominio di Vps10p di sortilina lega principalmente per il primo ciclo di luminal di GLUT4. Tuttavia, la prova di tale interazione in cellule di mammifero è scomparso. Qui, abbiamo isolato sortilina His-tag da cellule trasfettate 3T3-L1 con la resina cobalto e ha dimostrato che può interagire con peptide sintetizzato chimicamente corrispondente per il primo ciclo di luminal di GLUT4 pH 6 e pH 8 simile milieu acide nella endosomal lumen e ambiente neutro nel lume delle membrane TGN. Nessuna associazione di peptide è stata rilevata in esperimenti di controllo cui estratto preparato da cellule trasfettate con non è stato caricato sui branelli stessi.

Protocollo

1. movimentazione del Peptide

1. Progettazione e ordinazione del peptide
   1. Scegliere la sequenza desiderata del peptide e aggiungere un tag, ad esempio myc epitopo (EQKLISEED) presso suo entrambi N - o C-terminus.
   2. Controllare la solubilità prevista del peptide in acqua, usando peptide solubilità calcolatrice http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se la solubilità è basso, provare ad aggiungere un altro tag solubile in acqua per cambiare il bilanciamento di carica.
      Nota: Abbiamo usato il peptide corrispondente al primo ciclo luminal (fll) di GLUT4 taggati con l'epitopo di myc (grassetto) al capolinea N (Myc-fll-GLUT4): LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA di EQKLISEEDche ha predetto "buona" solubilità in acqua .
   3. Ordinare il peptide personalizzato con almeno 75% purezza che è sufficiente per il dosaggio e chieda al provider per test di solubilità. Separare l'ordine in almeno due aliquote in caso di problemi imprevisti con il peptide di dissoluzione.
      Nota: Myc-fll-GLUT4 è stato ordinato in due aliquote. La relativa solubilità segnalata in acqua ultrapura è ≤ 10 mg/mL.
2. Il peptide di dissoluzione
   Nota: Acqua ultrapura è il solvente migliore. Se il peptide non sembra essere solubile in acqua, fare riferimento a http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html per le istruzioni.
   1. Preparare la soluzione di lavoro del peptide in acqua ultrapura o nel buffer della scelta, con la concentrazione di 100 µ g/mL: 100x.
   2. Separare la soluzione in aliquote di 50-100 µ l e conservarli a-20 ° C.

2. il trattamento delle cellule

1. Coltura cellulare
   1. Utilizzare cellule Wild type (WT) come controllo negativo e le cellule che esprimono la proteina dell'obiettivo con sei istidine (HisP) etichetta.
      Nota: Abbiamo usato 3T3 L1 pre-adipociti trasfettate stabilmente con sortilina-myc/His⁵.
   2. Crescere le cellule in per volta Eagle Medium (DMEM) alta zucchero di Dulbecco, completati con 10% siero bovino vitello, glutamina (2 mM) e penicillina/streptomicina (5 μg/mL) a 37 ° C in 10% CO₂.
   3. Sedersi quattro piatti di 10cm di cellule, due di loro con HisP transfect e transfect gli altri due con il plasmide di controllo (WT). 48 ore dopo la trasfezione, le cellule dovrebbero raggiungere confluency di 80-90%.
2. Preparazione dei lisati cellulari
   1. Preparare il tampone di lisi (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% glicerolo, 10 mM imidazolo, 0,5% Triton X-100 e proteasi inibitore cocktail senza EDTA per l'isolamento di His-Tag proteine, pH 7.4) e tenerlo a 4 ° c:
   2. Lavare le cellule tre volte con 10 mL di 1x tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C.
   3. Mettere i piatti sul ghiaccio e aggiungere 500 µ l di tampone di lisi per ogni piatto. Raccogliere i lisati cellulari utilizzando un raschietto di cella.
   4. Posto il lysate delle cellule da ogni piatto in una provetta diverse 1,5 mL. Etichettare le provette come WT-pH6, WT-pH8, HisP-pH6 HisP-pH8.
   5. Passare i lisati cellulari attraverso una siringa con un ago da 26G cinque volte su e giù, a lisi completa.
   6. Centrifugare i lisati cellulari a 16.000 x g per 10 min a 4 ° C.
   7. Trasferire i surnatanti in nuove provette identicamente etichettati.
   8. Analizzare la concentrazione nella proteina utilizzando il Kit di dosaggio della proteina BCA o altri kit.
   9. Utilizzando un buffer di Lisi, equalizzare la concentrazione nella proteina di tutti e quattro i lysates.
   10. Separare un'aliquota di piccolo (ca. 20 µ l) di ciascun lisato e tenerlo a-20 ° C per possibili esperimenti di controllo e/o risoluzione dei problemi.

3. legame delle proteine His-tag per le perle di cobalto HisPur

1. Utilizzare il tampone di lavaggio disponibili in commercio o preparare uno (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, imidazolo di 20 mM, pH 8) e tenerlo a 4 ° C.
2. Prepari la lavata tampone con pH 6 di sorrisi lavaggio tampone a pH 8 con HCl. Keep esso a 4 ° C.
3. Agitare delicatamente la bottiglia delle perline di cobalto per rendere la sospensione omogenea.
4. Dispensare 40 µ l della sospensione di perline di cobalto nelle quattro provette da 1,5 mL contrassegnate come sopra (punto 2.2.4).
5. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi per ogni tubo, centrifugare le provette a 1000 x g per 5 s. aspirare il supernatante e aggiungere 40 µ l di tampone di lisi per perline depositati.
6. Aggiungere i lisati cellulari provette corrispondenti.
7. Incubare le provette per 90 min a 4 ° C su un rotatore tubo 20 giri/min.
8. Centrifugare le provette a 1000 x g per 5 s e raccogliere il surnatante. Conservare il supernatante a 4 ° C.
9. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio di pH 6 o pH 8 corrispondenti provette e Risospendere delicatamente le perline.
10. Centrifugare le provette a 1000 x g per 5 s e scartare i sovranatante.
11. Ripetere i passaggi da 3.9 e 3.10 per quattro volte.

4. associazione del Peptide alla proteina His-Tag immobilizzato le perline

1. Utilizzando la soluzione di lavoro x 100 del peptide (punto 1.2.1), preparare 1 x lavoro soluzioni a pH 6 o tampone pH 8 (aliquote di due 100 µ l per ciascuno, 1 µ g/mL).
2. Aggiungere 100 μL di soluzione 1x peptide ai talloni lavati con il pH corrispondente.
3. Incubare le perline per 30 min a 4 ° C su un rotatore tubo 20 giri/min.
4. Centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 s, raccogliere il surnatante e tenerlo a-20 ° C.
5. Ripetere i passaggi da 3.9 e 3.10 per quattro volte.
   Nota: Al fine di ridurre possibile priorità bassa, la seguente procedura potrebbe sostituire punti 4.4 e 4.5.
6. Prendere quattro colonne micro con 30 μm pori, etichettarli come descritto al punto 2.2.4 e posizionare le colonne in provette per la raccolta.
7. Dopo il completamento della fase 4.3, trasferire la miscela di incubazione nelle colonne, lasciare che la soluzione di passare attraverso per gravità. Mantenere il flusso attraverso la a-20 ° C.
8. Passare 500 µ l di tampone di lavaggio con pH 6 o pH 8 attraverso colonne corrispondenti per gravità. Scartare il flusso attraverso.
9. Ripetere il punto 4.8 quattro volte.
10. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare le colonne a 1.000 x g per 15 s.

5. eluizione da perle di cobalto

1. Tampone di uso commerciale Tricine campione (200 mM Tris-HCl, 40% glicerolo, 2% SDS, 0,04% Blue di Coomassie, pH 6.8) e aggiungere il β-mercaptoetanolo alla concentrazione finale di 2%.
2. Aggiungere 40 µ l di Tampone tricina (con β-mercaptoetanolo) per le perline lavati e vortexare il campione.
3. Riscaldare i campioni per 10 min a 100 ° C, vortice ancora una volta, i campioni e centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 s.
   Nota: Al fine di ridurre il possibile legame non specifico nell'eluizione, la seguente procedura potrebbe sostituire passaggi 5.1-5.3.
4. Aggiungere 40 µ l di tampone di eluizione dell'imidazolo (50mm Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, imidazolo 0,25 M) per il lavato dei branelli, vortex e incubare le provette a temperatura ambiente per 20 min.
5. Centrifugare le provette a 3.000 x g per 30 s, raccogliere il surnatante (campioni eluiti) e trasferirlo in provette di nuovi.
6. Aggiungere 40 μL di Tampone tricina in ogni provetta, riscaldare i campioni per 10 min a 100 ° C, vortex e centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 s.
   Nota: Se si utilizzano micro colonne, aggiungere il tampone di eluizione ai branelli lavati, incubare per 20 minuti e raccogliere l'eluizione mediante centrifugazione a 8.000 x g per 2 min.
   Nota: Campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a quando elettroforesi viene eseguita.

6. elettroforesi e Western blotting

Nota: I campioni sono pronti per la separazione mediante SDS-PAGE e successivo Western blotting. Seguire il protocollo di elettroforesi del gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) con le seguenti modifiche.

1. Utilizzare commercialmente disponibile 10-20% Tricine gel gradiente.
2. Sul gel, caricare 20 µ l di campioni eluiti e 20 µ l di lisati (passo 2.2.10). Per la risoluzione dei problemi, è consigliabile caricare 20 µ l di materiale non legato (punto 3.8) e 10 ng del peptide; prima del caricamento, aggiungere pari quantità di Tampone tricina a questi campioni.
3. Eseguire l'elettroforesi in commerciale Tris/Tricine/SDS in esecuzione di tampone (100 mM Tris, 100mm Tricine e 0.1% SDS, pH 8.3).
4. Trasferire il materiale dal gel su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 µm mediante tampone di trasferimento (base Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,4) completati con 20% metanolo.
5. Bloccare la membrana con 3% albumina di siero bovino (BSA) per 1 h a temperatura ambiente. Usando gli indicatori pre-colorato peso molecolare come guide, tagliare la membrana in senso orizzontale, macchia la parte superiore con un anticorpo contro HisP e asciugare la parte inferiore con un anticorpo contro l'epitopo di myc per identificare il peptide myc-tagged.
   Nota: Nel nostro caso particolare, taglio della membrana non è necessaria poiché sia HisP e Myc-fll-GLUT4 può essere rilevata con un anticorpo anti--myc.

7. analisi dei risultati

1. Quantificare l'intensità di tutti i segnali di Western blot utilizzando un programma di immagine stazione o ImageJ.
2. Normalizzare il segnale dal peptide myc-tagged contro il segnale da HisP a entrambi valori di pH.

Risultati

Lisati sono stati preparati da 3T3 L1 cellule transfettate stabile con sortilina-myc/His⁵ e da cellule WT 3T3 L1, usate come controllo negativo. Entrambi lisati sono stati incubati con perle di cobalto a pH 6 o pH 8 e lavate accuratamente. Perline con proteine immobilizzate sono state incubate nella soluzione di Myc-fll-Glut4. Dopo attenti lavaggi, proteine legate ai talloni sono stati eluiti con 0,25 M imidazolo. Campioni sono stati sottoposti, insieme con i lisat...

Discussione

Sortilina è un recettore di evolutiva conservata multi-ligando proteina che è coinvolta in entrambi segnalazione alla membrana del plasma e intracellulare ordinamento eventi^6,7. Tuttavia, la ricerca di ligandi di sortilina autentico (alcuni dei quali sono proteine di membrana luminale o integrale) è complicata come l'interazione di sortilina con alcuni dei suoi partner di associazione sembra essere sensibili ai detersivi. Di conseguenza, un facile e un approccio ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma	P8849	per l'uso nella purificazione della proteina tag dell'istidina
Soluzione salina tamponata con fosfato	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Siringa da insulina U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Kit per il dosaggio delle proteine	Pierce	23228
Tampone di lavaggio	Boston BioProducts	BP-234	Per la purificazione delle proteine His-tag
HisPur Resina di cobalto	Thermo Scientific	89964
Tampone campione di tricina	Bio-Rad	161-0739	con SDS, bMercaptaethanol dovrebbe essere aggiunto
Eluizione  Tampone	Boston BioProducts	BP-236	per la purificazione delle proteine His-tag con 250mM di imidazolo
Mini-Protean Tris-Tricine gel prefabbricati 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Per la separazione di peptidi e piccole proteine
Tris/Tricine/SDS che eseguono il tampone	Bio-Rad	161-0744
Tampone di trasferimento	Boston BioProducts	BP-190	Aggiungi il 20% di metanolo
Membrana in nitrocellulosa   0,45 mm	Bio-Rad	1620115
Albumina sierica bovina	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc	anticorpo Segnalazione cellulare	2272
Peptide di	Genscipt		Personalizza l'ordine
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374