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Articolo metodologico

Un metodo per definire gli effetti dell'arricchimento ambientale sul Colon Microbiome biodiversità in un modello di tumore del Colon del topo

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DOI:

10.3791/57182

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28 febbraio 2018

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1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

In questo articolo

Sommario

Arricchimento ambientale (EE) è un ambiente di stabulazione degli animali che viene utilizzato per rivelare i meccanismi che sottendono le connessioni tra stile di vita, lo stress e la malattia. Questo protocollo descrive una procedura che utilizza un modello murino di tumorigenesis dei due punti ed EE per definire specificamente alterazioni nel microbiota biodiversità che potrebbero influenzare la mortalità degli animali.

Abstract

Parecchi studi recenti hanno illustrato gli effetti benefici di vivere in un ambiente arricchito sul miglioramento della malattia umana. Nei topi, arricchimento ambientale (EE) riduce la tumorigenesi attivando il sistema immunitario del mouse, o colpisce sopravvivenza animale di cuscinetto del tumore stimolando la risposta di riparazione della ferita, incluso migliorata microbiome diversità, nel microambiente tumorale. Fornito qui è una procedura dettagliata per valutare gli effetti dell'arricchimento ambientale sulla biodiversità del microbioma in un modello di tumore del colon del topo. Precauzioni relative all'allevamento di animali e considerazioni per l'integrazione Colonia animale genotipo e mouse sono descritti, che infine colpiscono la biodiversità microbica. Ascoltando queste precauzioni può consentire più uniforme microbiome trasmissione e di conseguenza allevierà non-trattamento effetti dipendenti che possono confondere i risultati dello studio. Inoltre, in questa procedura, microbiota modifiche sono caratterizzate tramite sequenziamento del 16S rDNA del DNA isolato dalle feci raccolti dal colon distale dopo arricchimento ambientale a lungo termine. Lo squilibrio del microbiota intestinale è associato con la patogenesi di infiammatorie intestinali malattia e cancro del colon, ma anche di obesità e diabete tra gli altri. D'importanza, questo protocollo per l'analisi EE e microbiome può essere utilizzato per studiare il ruolo della patogenesi microbiome attraverso una varietà di malattie dove esistono modelli murini robusto che può ricapitolare la malattia umana.

Introduzione

Studi di arricchimento ambientale (EE) utilizzano parametri complessi alloggiamento per interessare la stimolazione sociale (gabbie di custodia di grandi dimensioni, grandi gruppi di animali), stimolazione cognitiva (capanne, tunnel, materiali di nidificazione, piattaforme) e attività fisica (in esecuzione ruote). EE è stato utilizzato da molti laboratori per capire gli effetti di una maggiore attività e interazioni sociali e cognitive migliorate sulla malattia iniziazione e progressione utilizzando una vasta gamma di modelli murini, inclusi barbering alopecia indotta, morbo di Alzheimer, La sindrome di Rett e la malattia del tumore e digestivo diversi modelli1,2,3,4,5,6.

Sono stati sviluppati diversi modelli di mouse per studiare il tumorigenesis dei due punti in topi. Forse il modello più ben definito è il mouse ApcMin . Il mouse di ApcMin è stato sviluppato nel laboratorio di William colomba nel 19907e viene utilizzato come un modello murino di mutazioni del gene APC che sono comunemente associati con cancro colorettale umano. In contrasto con gli esseri umani che harboring le mutazioni di APC , ApcMin topi sviluppano principalmente piccoli tumori intestinali, con un avvenimento molto raro di tumori del colon. Tuttavia, un allele Tcf4Het con una singola mutazione eterozigotica Knockin ' knock-out in Tcf4, aumenta considerevolmente il tumorigenesis dei due punti quando combinato con l' allele di ApcMin 8. Recentemente, questo modello del topo di tumorigenesis dei due punti è stato utilizzato per determinare gli effetti di EE il colon tumorigenesi6. Nella Bice et al. lo studio, gli effetti fisiologici e fenotipici dell'EE su maschi e femmine di quattro linee di diverso tipo di mouse (wild type (WT), Tcf4Het / + Apc+ +, Tcf4+ + ApcMin / +, e Tcf4 Het / + APCMin / +)) sono stati definiti. Forse la scoperta più interessante era che EE aumenta significativamente la durata della vita degli animali del colon del tumore-cuscinetto sia maschile che femminile. Questo ha dimostrato che EE può ridurre almeno alcuni dei sintomi associati con tumorigenesis dei due punti e migliorare la salute degli animali. Notevolmente, questa durata migliorata nei maschi non è un risultato diretto della ridotta tumorigenesi e invece era legata all'avvio di una risposta, incluso il miglioramento microbiome biodiversità6di cicatrizzazione del tumore.

Sono stati pubblicati diversi studi specifici di EE con risultati interessanti. Tuttavia, dal punto di vista tecnico, importanti risultati spesso non sono traducibili in altri laboratori. Il mantenimento di metodologie EE identici tra laboratori diversi è un problema incredibilmente complesso, non solo a causa di dispositivi di arricchimento e alloggio utilizzato, ma anche biancheria da letto, cibo, ventilazione, allevamento, genetica, attività in camera e protocollo animale requisiti, tra gli altri9,10,11. Un esempio è integrazione animale, dove gli animali devono essere stabilmente integrati nella Colonia del mouse, quindi normalizzare la composizione genetica di sfondo e la dieta, per evitare gli effetti correlati non-trattamento. Ulteriormente, molti studi EE sono stati completati prima della realizzazione dell'importanza del microbioma nella malattia e il modo che comuni pratiche di allevamento del mouse possono influenzare la composizione del microbioma intestinale10,12.

Posizionamento di strategia e animale di allevamento in EE può aumentare lo sforzo, se non effettuata correttamente. Poiché gli studi EE utilizzano un numero elevato di animali maschii e femminili e di genotipi multipli, messa a punto sperimentale può essere difficile dato il requisito per gli animali da cucciolate diverse da combinare. Di conseguenza, un allevamento e lo svezzamento di strategia è stato sviluppato per consentire la combinazione di animali svezzati del genotipo corretto da diverse cucciolate. La motivazione principale per questo era a normalizzare il microbiota tra cucciolate e a ridurre lo stress quando gli animali sono stati spostati all'ambiente sperimentale. Il microbioma è stata trasmessa dalla diga10. Per garantire la diversità microbica alla Colonia, le femmine erano acquistate da Jackson Labs e integrate nella Colonia per un mese prima che l'esperimento ha cominciato9,10,12. Per normalizzare ulteriormente microbiome biodiversità tra gli animali, le femmine erano co-ospitate prima dell'allevamento. A seguito allevamento, alloggio comunale durante l'allevamento e la possibilità di fuggire cura cuccioli migliorato i livelli di stress di cure materne13,14, possibilmente promuovendo microbiome normalizzazione. Per evitare la non-EE correlati effetti sul microbioma, questa custodia comune di tutti gli animali sperimentali ha impedito lo stress di combattimento e altre che si sono verificati quando si combinano diversi maschi da cucciolate diverse in una gabbia sperimentale. Infine, un numero uguale di animali di tutti i genotipi sono stati inclusi nelle gabbie. Questo ha offerto l'opportunità per la biodiversità microbiota migliorata attraverso genotipi e rimosso il contributo di coprofagia (tendenza dell'animale a consumare sgabello) o possibili differenze di comportamento di genotipo specifico allo studio generale.

Questo protocollo fornisce una strategia che si espande gli studi per includere aspetti noti del microbioma ricerca, compresa l'integrazione di microbiota animale e trasmissione Colonia per la normalizzazione del microbiota, per consentire più uniforme microbiome popolazioni precedenti-EE tra gli animali da esperimento. Ascoltando queste precauzioni è essenziale a causa della capacità di non-trattamento correlate microbiota differenze per confondere i risultati dello studio. Eliminando non-EE relative modifiche microbiota permetterà ai ricercatori di definire specificamente il ruolo di EE sulla composizione del microbiota durante lo sviluppo della malattia e la progressione.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati effettuati secondo protocolli approvati dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) presso l'Università dello Utah.

1. disegno sperimentale ed EE e controllo gabbia Setup

Nota: Per riferimento, è illustrato un contorno del disegno sperimentale (Figura 1).

  1. Impostare controllo (NE) e gabbie EE (Figura 2).
    1. Per impostare NE gabbie, utilizzare gabbie di controllo convenzionali in autoclave (tabella 1) che non dispongono di dispositivi di arricchimento.
    2. Per grandi gabbie, praticare un foro per gabbia che è grande abbastanza per ospitare un gommino di protezione e tunnel (Tabella materiali).
    3. Per impostare il cucciolo allevamento e gabbie EE, collegare due grandi gabbie in autoclave con un tunnel protetto sterilizzati gommino e sterilizzati 2 piattaforme per aumentare lo spazio di pavimento (tabella 1). Per gli esperimenti EE, fornire sterilizzato in esecuzione ruote, tunnel, igloo, capanne, palle di ricerca per indicizzazione e nidificazione materiale all'interno delle gabbie EE.
    4. Posto sia EE e NE gabbie in un rack ventilato per fornire la ventilazione uguale.
      Nota: Due grandi gabbie con 2 piattaforme (tabella 1) consentono per un massimo di 12 femmine gravide al cucciolo allevamento installazione15 (Vedi Tabella materiali, passo 3.2 nel documento e tabella 2).
    5. Alimentazione topi ad libitum irradiati in autoclave ad osmosi inversa acqua e cibo standard.
    6. Fornire topi con materiali da lettiera sterile.
      Nota: Tutte le manipolazioni delle gabbie vuote e le gabbie con gli animali devono essere fatto nella cappa per prevenire la contaminazione. Per la manipolazione di gabbia di grandi gabbie, coprire il foro nella gabbia con una pellicola adesiva.
  2. Preparare gli animali per l'allevamento. Gruppo 15 femmine 2 - mese-vecchia casa in una grande gabbia singola (tabella 1) per 2 settimane prima dell'accoppiamento. Separatamente casa 2 - mese-vecchio littermate maschi per 2 settimane prima dell'accoppiamento.
    Nota: Il numero di femmine per allevamento dipende l'esperimento e il numero di animali necessari. In questo studio, 15 femmine venivano utilizzate per ottenere 12 femmine collegate, che è il massimo numero consentito nel cucciolo allevamento installazione descritto al punto 1.1.2 (tabella 2).
  3. Per l'allevamento, combinare gli animali sire e diga, 1 maschio a 2 femmine. Il primo check-nella mattina dovrebbe essere per spine vaginale, che possono essere un segno visivo che gli animali hanno accoppiato durante la notte.
    Nota: Casa maschi e femmine insieme fino a quando ogni femmina ha collegato. Un plug vaginale può essere identificato visivamente, se è esterno.
    1. Per rilevare tappi interiorizzati, una sonda è inserita nell'apertura vaginale e se il plug vaginale è presente, la sonda non è facilmente inserita (16; vedere paragrafo 4.3.6).
      Nota: Registrare la mattina che una spina viene rilevata come ½ giornata, poiché l'accoppiamento si è verificato nella notte.
    2. Una volta che le femmine hanno spine vaginali, trasferirli a un cucciolo di grande allevamento gabbia di stabulazione in gruppo con altre femmine accoppiate (programma di installazione nel passaggio 1.1.2 senza dispositivi di arricchimento).
    3. Sostituisci accoppiato femmine con nuove femmine spaiato gruppo ospitato per l'accoppiamento e continuare l'accoppiamento per ottenere il massimo numero di cucciolate in un periodo di 7 giorni.
      Nota: Tutti gli animali devono avere una data di consegna entro 7 giorni uno da altro.
  4. Consentire le femmine gravide a partorire nel gruppo alloggiamento in modo che tutte le cucciolate vengono generati all'interno di un grande cucciolo allevamento gabbia (programma di installazione nel passaggio 1.1.2 senza dispositivi di arricchimento).
    1. Tenere traccia delle date di nascita e numeri di pup e inizio cuccioli di genotipizzazione a 7 giorni di età.
      1. Tatuaggio cuccioli sulle loro punte a 7 giorni di età con un codice numerico per identificarli13,17.
      2. Pulire la punta con etanolo al 70% e inserire delicatamente un dispositivo di micro-tatuaggio contenenti inchiostro nella superficie della pelle parallela al punta17 (Vedi Tabella materiali).
      3. Raccogliere del tessuto con le forbici per genotipizzazione dalle punte della coda di pungere un piccolo pezzo di tessuto da neonati 7 - giorno-vecchi.
    2. Isolare il DNA di genomic dal tessuto ed eseguire PCR utilizzando un metodo convenzionale di HotSHOT come descritto in 18.
    3. Animali separati per sesso a 14-21 giorni in grandi gabbie con le madri.
      Nota: Assicurarsi che i cuccioli più vecchi sono in grado di alimentare proprio, e che i cuccioli più giovani continuano ad allattare fino al vecchio abbastanza per sfamare proprio.
    4. Alle 21-28 giorni, distribuire gli animali maschii e femminili separatamente dal genotipo in ambienti NE o EE, assicurandosi di mantenere proporzioni uguali di ciascun genotipo per gabbia (Figura 2A).
      Nota: Assicurarsi che il numero totale di animali ammessi in ogni gabbia NE o EE si basa sul numero massimo consentito di IACUC (tabella 2). Le gabbie NE hanno al massimo 5 animali (tabella 2). In gabbie EE, per stimolazione sociale, non meno di 20 e con le limitazioni di spazio, non più di 41 animali dovrebbero essere consentiti nella gabbia EE (tabella 2).

2. sgabello collezione a 16 settimane di età

  1. Iniziare la raccolta di feci 1 a 2 giorni prima del sacrificio e raccogliere separatamente sgabello il giorno del sacrificio durante la dissezione utilizzando strumenti sterili.
    Nota: Sgabello raccolta allo stesso tempo 1-2 giorni prima della raccolta può contribuire ad per evitare la perdita di un campione dalla possibilità che no sgabello è presente al momento della raccolta.
    1. A raccogliere Sgabello da animali vivi, attentamente collottola l'animale sopra una gabbia pulita. Raccogliere le feci utilizzando pinze sterili in una provetta sterile microfuge.
      Nota: Animali in genere eliminerà sgabello quando immobilizzato, che permette di rapido sgabello collezione direttamente in una provetta sterile microfuge. Se un animale non immediatamente defecare quando immobilizzato, metterlo in una gabbia pulita e attendere che l'animale a defecare (in genere fino a 1 h).
    2. Raccogliere le feci il giorno del sacrificio.
      1. Per eutanasia animale, metti l'animale sotto una campana di vetro contenente un piccolo contenitore con un batuffolo di cotone imbevuto di isoflurane. Una volta che la cessazione della respirazione è osservata (solitamente dopo 2 min), posare l'animale sul dorso per consentire la dissezione del colon.
      2. Applicare etanolo al 70% all'addome del mouse.
      3. Sollevare la pelle anteriore l'apertura uretrale con il forcipe e usare le forbici per tagliare lungo la linea mediana ventrale fino a raggiungere la gabbia toracica e tagliato dalla base della prima incisione verso ogni gamba. Piegare indietro la pelle e usare le forbici per tagliare attraverso la parete peritoneale nello stesso modello.
      4. Utilizzare pinze per afferrare il colon distale all'ano da sezionare e staccare il colon distale dal retto. Tirando i due punti in verticale con il forcipe, usare le forbici per tagliare attraverso il mesentere per rilasciare i due punti.
      5. Tagliare i due punti appena sotto l'intestino cieco ed adagiarlo su carta da filtro. Utilizzare pinze per sollevare la parte superiore del tubo del colon, apertura del lume per consentire un lato delle forbici aperte da inserire. Tagliare longitudinalmente, Apri distale prossimale e strombatura colon longitudinalmente.
      6. Raccogliere feci dal colon distale in una provetta sterile microfuge utilizzando pinze sterili.
  2. Sgabello di archivio in un tubo di microfuge a-80 ° c fino al momento dell'isolamento del DNA batterico.
    Nota: Il giorno del sacrificio, oltre allo sgabello, raccogliere altri campioni quali sangue intero, siero, plasma, normale e il tessuto del tumore da colon e intestino tenue, microsomi, tessuto adiposo, ecc. alle domande di indirizzo definito nello studio.

3. isolamento genomic del DNA da sgabello

Nota: Utilizzare un kit commerciale per isolare il DNA microbico da sgabello seguendo un protocollo di rilevamento del patogeno sgabello. Rimuovere i campioni direttamente per il congelatore ˚ c-80 e l'archivio su ghiaccio secco durante la pesatura.

  1. Trasferimento fino a 220 mg di feci in una provetta pulita microfuge contenente 1,4 mL di tampone di lisi sgabello di temperatura ambiente (TA) (Vedi Tabella materiali).
  2. Esempio di vortice per 1 min a omogeneizzare accuratamente solidi (Figura 2B). Riscaldare la sospensione a 95 ˚ c per 5 min lisare tutti i batteri (compresi i batteri Gram-positivi).
  3. Esempi di vortice per 15 s e poi Centrifugare a 20.000 x g per 1 min a pellet i solidi di sgabello. Trasferire il surnatante in una provetta 2 mL microfuge. Aggiungere una compressa per ogni campione di inibitori della PCR, vortice fino a quando la compressa è sciolta, di assorbire e mantenere in incubazione il campione a temperatura ambiente per 1 min.
  4. Centrifugare il campione a 20.000 x g per 3 min e trasferire il surnatante in una provetta di microfuge nuovo. Centrifugare a 20.000 x g per 3 min Aliquot 15 µ l di proteinasi K (20 mg/mL di brodo) in una nuova provetta microfuge 1,5 mL. Aggiungere 200 μL del campione nella provetta contenente proteinasi K.
  5. Aggiungere 200 μL di tampone di lisi di cloruro di guanidinio al tubo, vortice accuratamente per 15 s (Vedi Tabella materiali) e incubare il campione a 70 ˚ c per 10 min. aggiungere 200 μL di etanolo (96-100%) ai tubi e mescolare bene su Vortex.
  6. Posto una silice colonna spin in una provetta 2 mL di base e applicare i campioni alla colonna. Chiudere il coperchio e centrifugare per 1 min a 20.000 x g.
  7. Trasferire la colonna ad un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 1 alla colonna, cap la colonna e centrifugare per 1 min 20.000 x g. trasferimento della colonna ad un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 2 nella colonna , chiudere il tappo e centrifugare a 20.000 x g per 3 min.
  8. Con il cappuccio chiuso, trasferire la colonna ad un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e centrifugare per un ulteriore 1 min a 20.000 x g per rimuovere il tampone di lavaggio residua. Trasferire la colonna a un 1,5 mL etichettato microfuge tubo ed eluire il campione aggiungendo 200 μL di tampone di eluizione contenenti EDTA alla membrana (Vedi Tabella materiali).
  9. Chiudere il tappo e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Centrifugare il campione per 1 min a 20.000 x g. gettare la colonna.

4. DNA concentrazione determinazione e preparazione del campione per la PCR

Nota: Utilizzare un fluorimetro e un'analisi fluorescente dsDNA disponibile in commercio per determinare la concentrazione di DNA genomica in ciascun campione (Vedi Tabella materiali). Il colorante fluorescente deve associare specificamente DNA a doppio filamento.

  1. Preparare una diluizione di 1: 200 di ogni campione (1 µ l di ciascun campione in 199 mix master di dsDNA µ l) e un 01:50 diluizione degli standard. Analizzare su un fluorometro utilizzando l'impostazione di dsDNA.
    Nota: Un elevato volume di DNA in PCR può essere inibitorio, di conseguenza, il volume di DNA utilizzato non deve essere oltre il 10% del volume finale del PCR. Un fluorometro consente misure accurate di DNA nel campione, come solo DNA associato alla tintura fluorescente darà fluorescenza, eliminando il possibile contributo di contaminanti alla concentrazione finale calcolata del DNA. Questo livello di quantificazione accurata è essenziale per l'applicazione di sequenziamento a valle.
  2. Preparare modelli PCR diluiti a 5 ng/μL con il volume appropriato di 10 mM Tris, pH 8.5 a fare scorte di modello di lavoro di ciascun campione.
  3. Conservare i campioni a-20 ° C.

5. design primer per il 16S desiderato V regioni

  1. Disegnare primers per amplificare selettivamente la regione di rRNA 16S V desiderata.
  2. Analizzare gli iniettori con sonda partita, dal progetto di Database Ribosomal19, per determinare il tasso di successo approssimativo per vari phyla.
    Nota: Per le regioni di V1-V3, lo studio corrente ha utilizzato pubblicato primer Bosshard avanti20, che si legano alla posizione 8 nella regione di V1 e 533 inversa21, che si lega alla posizione 533 all'interno della regione V3. Primer deve includere sporgenza adattatore sequenze per l'indicizzazione.
  3. Quando progettazione degli iniettori, includere sequenze di adattatore all'estremità 5' di ogni primer, come consigliato per 16S metagenomica sequenziamento libreria preparazione22 (tabella 3).
  4. Sintetizzare questi grandi iniettori con purificazione cartuccia. Primer essiccata di ricostituire e diluire una PCR lavorandoin stock a 1 μM 10 mM Tris, pH 8.5.

6. amplicone PCR per amplificare le regioni V con sporgenza adattatore sequenze allegato 22

  1. Impostare l'amplicone miscela di reazione PCR come descritto nella tabella 4.
  2. Inserire un sigillo di piastra PCR chiaro adesivo sulla piastra ed eseguire l'amplicone PCR utilizzando i parametri nella tabella 5.
  3. (Opzionale) Eseguire amplicone PCR prodotti su un gel dell'agarosi o un'analisi di DNA ad alta sensibilità che consente la misurazione quantitativa di amplicon dimensioni (Vedi Tabella materiali).
    Nota: La dimensione amplicone da questo studio è di 550 bp (Figura 3A).

7. PCR di pulitura mediante magnetico perline 22

  1. Centrifugare la piastra di amplicone PCR rapidamente a 1.000 x g per 1 min raccogliere la condensa.
    Nota: PCR tubo strisce possono essere utilizzati invece di piastre PCR per minimizzare la contaminazione. Scartare il tubo coperchi e non riutilizzare mai.
  2. Vortice i branelli magnetici uniformemente disperderli e aggiungere 20 μL di magnetico perline per ogni amplicone PCR bene, quindi dispensare l'intero volume su e giù lentamente 10 volte.
  3. Incubare a RT per 5 min. Posizionare la piastra PCR su un supporto magnetico per 2 min, fino a biglie magnetiche sono raccolti e il surnatante è chiaro. Rimuovere e scartare il surnatante.
  4. Perle di lavaggio con 200 μL fresco 80% etanolo mentre il piatto PCR è il magnetico stand e incubare per 30 s a RT su supporto magnetico. Rimuovere con cautela il supernatante.
  5. Ripetere il lavaggio per una seconda volta. Ora, è possibile utilizzare una punta fine per rimuovere qualsiasi residuo etanolo dai pozzi e permettere all'aria di essiccazione per 10 min.
  6. Rimuovere la piastra PCR dal supporto magnetico e aggiungere 52,5 μL di Tris 10 mM pH 8,5 in ciascun pozzetto. Pipettare fino e giù 10 volte a sospendere perline e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
  7. Trasferire la piastra PCR per il supporto magnetico per raccogliere perle magnetiche e trasferire 50 μL del surnatante di un piatto pulito di PCR. Collocare un sigillo di piastra PCR chiaro adesivo sulla piastra e conservare a-20 ° c fino a una settimana.

8. preparazione di un regime di piastra per indice PCR

Nota: Per generare una libreria di V1-V3, una seconda PCR è stata effettuata con un indice kit (Vedi Tabella materiali). Uno schema di indicizzazione predefinito è stato utilizzato per mappare combinazioni Indice dual univoco per ogni campione (Figura 3B e 23).

  1. Garantire che ogni campione ha una combinazione unica di 2 primer di indice (cioè, doppia indicizzazione).

9. eseguire Indice PCR per collegare i codici a barre per le sequenze di adattatore come descritto 22 .

  1. Trasferire 2,5 μL di ampliconi PCR (pulito ampliconi) una nuova piastra ben 96 e posto in un dispositivo a piastra di indice per facilitare l'indicizzazione.
  2. Organizzare l'indice 1 e indice 2 primer come nell'esempio del grafico piatto preparato (Figura 3B).
    Nota: Segnali visivi vengono forniti per evitare confusioni di primer: Indice 2 primer tubi dovrebbero hanno cappucci bianchi e soluzione limpida, mentre tubi primer indice 1 dovrebbero avere tappi arancione e giallo soluzione.
  3. Assemblare l'indice della reazione di PCR Mix come descritto nella tabella 6. Mescolare pipettando su e giù per 10 volte. Coprire con un sigillo di piastra PCR chiaro adesivo e centrifugare per raccogliere a 1.000 x g a temperatura ambiente per 1 min.
  4. Eseguire l'indice PCR utilizzando i parametri nella tabella 7.

10. purificare PCR finale biblioteca

Nota: Questo PCR clean-up è identico al passaggio 7 sopra e utilizza microsfere magnetiche per eseguire PCR Clean-Up dell'indice PCR22.

  1. Centrifugare la piastra PCR dal passaggio 10 rapidamente a 1.000 x g per 1 min raccogliere la condensa.
  2. Vortice i branelli magnetici uniformemente disperderli, quindi aggiungere 20 μL di magnetico perline per ogni amplicone PCR Beh, pipettare quindi l'intero volume su e giù lentamente 10 volte per mescolare.
  3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Piastra di PCR posto su un supporto magnetico per 2 min fino a biglie magnetiche sono raccolti e surnatante è chiaro. Rimuovere e scartare il surnatante.
  5. Perle di lavaggio con 200 μL fresco 80% etanolo mentre il piatto PCR è il magnetico stand e incubare per 30 s a temperatura ambiente su supporto magnetico. Rimuovere con cautela il supernatante.
  6. Ripetere il lavaggio per una seconda volta.
  7. Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una punta fine per rimuovere qualsiasi residuo etanolo dai pozzi e permettere all'aria di essiccazione per 10 min.
  8. Rimuovere la piastra PCR dal supporto magnetico e aggiungere 52,5 μL di Tris 10 mM pH 8,5 in ciascun pozzetto. Pipettare fino e giù 10 volte a sospendere perline e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
  9. Trasferire la piastra PCR per il supporto magnetico per raccogliere perle magnetiche e trasferire 50 μL del surnatante di un piatto pulito di PCR. Collocare un sigillo di piastra PCR chiaro adesivo sulla piastra e conservare a-20 ° c fino a una settimana.
  10. (Opzionale) Eseguire i prodotti PCR di indice su un gel dell'agarosi o un'analisi di DNA ad alta sensibilità che consente la misurazione quantitativa di amplicon dimensioni (Vedi Tabella materiali).
    Nota: La dimensione finale raccolta indicizzata da questo studio è stato 668 bp (Figura 3C-D).

11. quantificare, normalizzare e piscina le librerie indicizzate per il sequenziamento

  1. Determinare la concentrazione di DNA di ciascun campione con un fluorimetro e un kit di analisi fluorescente di dsDNA (Vedi tabella materiali).
    1. Preparare una diluizione di 1: 200 del campione (1 µ l di ciascun campione in 199 µ l dsDNA mix master, che include il buffer e reagente) per ciascuno dei campioni indicizzati e standard (mix master dsDNA di 190 µ l e 10 µ l di standard). Analizzare su un fluorometro utilizzando l'impostazione di dsDNA.
  2. Dopo il calcolo di concentrazione di DNA, normalizzare le librerie di calcolo della dimensione media biblioteca. Fare questo sommando lunghezze adattatore, lunghezze di indice e V amplicone dimensioni da primer e Mostra i prodotti di gel di agarosio per essere certi che la dimensione effettiva è simile alla dimensione calcolata (cfr.Figura 3C, 22).
    1. In alternativa, utilizzare un test di DNA ad alta sensibilità che consente la misurazione quantitativa dell'integrità del DNA, dimensione amplicone e concentrazione (tabella materiali, Figura 3D).
      Nota: In questo studio, la dimensione media library è stata calcolata sulla base sommando le lunghezze di adattatore, lunghezze di indice e dimensione amplicone V1-V3 da primer. La dimensione media è 668 bp.
    2. Le concentrazioni di campioni sono normalizzate utilizzando la formula nella tabella 8.
  3. Diluire i campioni a 4 nM e piscina 5 µ l di ogni campione 4-nM in un singolo tubo per il sequenziamento.

12. la libreria utilizzando un sistema di sequenziamento di nuova generazione di sequenza e analizzare i dati

  1. Sequenza della libreria.
    Nota: Per questo studio, l'Università dello Utah High Throughput genomica Core eseguita biblioteca denaturazione e sequenziamento di campione (come descritto in 6,22).
  2. Analizzare i dati.
    Nota: Per separare i dati dal pool di campioni, letture di indice sono state identificate e separate (come descritto in 22).
  3. Generare i file FASTQ e utilizzare questo per l'analisi di dati successivi.

13. analizzare i dati in sequenza dalla libreria amplicone 16S

Nota: Questa operazione viene eseguita come descritto in Bice et al., 20176.

  1. Installare gli strumenti di analisi di dati liberamente disponibili (Vedi Tabella materiali; 24).
  2. Assemblare i file fastq demoltiplicato da dati in sequenza (come descritto in25,26). Scarta tutte le sequenze smontate.
  3. Eseguire analisi seguendo un'unità tassonomica aperta di de novo (OTU) picking protocollo (come descritto in 27).
    1. Bin sequenze in un file di singolo fastq di sampleID e sequenze di gruppo con 97% o maggiore somiglianza in OTUs, come descritto in 28. Allineare sequenze rappresentative del nucleo con lunghezza di sequenza minima di 150 e 75% per cento identità29,30. Assegnare tassonomia come descritto28.
      Nota: I campioni possono essere cestinati e analizzato31, seguita da assegnazione tassonomica e OTU tabella costruzione32.
    2. Creare un file di mapping che identifica i nomi descrittivi e le caratteristiche dei campioni per collegare a identificazione del campione e convalidare il file di mappatura33,34.
    3. Fare una rete OTU che collega OTUs a descrizioni di esempio utilizzando un file di mappatura35.
    4. Calcolare i riepiloghi di tassonomia in termini di relativa abbondanza Riassumendo taxa attraverso trame36.
    5. Esplorate alfa diversità dei campioni a profondità uniforme sequenziamento appropriato ai campioni. Per definire la profondità adeguata per alfa diversità, riepilogare conteggi totali osservati in ciascun campione utilizzando il comando di riassumere-table di bioma, come descritto in 37.

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Risultati

Parecchi studi hanno dimostrato che la pratica della medicina mente-corpo migliora i risultati di salute. Allo stesso modo, nei topi, arricchimento ambientale migliora i risultati tra cui una migliore durata della vita e tumore ferito riparazione6. Di conseguenza, una procedura EE è stata sviluppata con l'obiettivo di definire il ruolo del microbiota in questo fenotipo mentre prima normalizzazione il microbioma prima dell'inizio dell'esperimento (

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Discussione

Questa procedura permette l'analisi del microbiota isolato dalle feci dopo arricchimento ambientale di normale o animali del cuscinetto del tumore. Perché questi sono grandi esperimenti che coinvolgono allevamento per ottenere molti animali di sesso diverso e genotipi, normalizzando il microbioma tra animali prima dell'inizio dell'esperimento è essenziale per evitare la non-EE correlati effetti sul microbioma biodiversità.

Per coerenza tra condizioni NE ed EE, il processo di allevamento viene ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo B. Dalley nel nucleo della University of Utah genomica per sequenza di biblioteca e K. Boucher nel nucleo della University of Utah Biostatistica per consulenza statistica e l'accesso a questi tecnici core supportati dal premio del National Cancer Institute P30 CA042014. Il progetto descritto è stato sostenuto dal National Cancer Institute sovvenzioni P01 CA073992 e K01 CA128891 e la Huntsman Cancer Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Teklad Diets/Harlan Labs ChowHarlan Labs3980XCibo irradiato standard formulato dal Dr. Mario Capecchi in collaborazione con Harlan Labs.
Cell-Sorb Plus lettieraFangman Specialties82010Autoclave prima dell'uso.
Sistema di tatuaggio AIMS per neonatiAIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Altri sistemi di tatuaggi e inchiostri per animali possono essere utilizzati con risultati simili, incluso l'Aramis Micro Tattoo Kit.
Sistema di microisolatori per topi Zyfone One Cage 2100 AllerZone Completo di gabbia, parte superiore del filtro AllerZone e sistema di somministrazione della dieta modulareProdotti da laboratorio82120ZFOgni gabbia EE richiede uno di ogni catalogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, nonché due di 82109ZF. Il cibo è solo da un lato.
Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment DeviceLab Products82109ZFOgni gabbia EE richiede uno di ogni catalogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, nonché due di 82109ZF. Il cibo è solo da un lato.
Zyfone One Cage 2100 Gabbia 13-7/8" Lunghezza x 19-1/16" Larghezza x 7-3/4" ProfonditàProdotti da laboratorio82100ZFOgni gabbia EE richiede uno di ciascun catalogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, oltre a due di 82109ZF. Il cibo è solo da un lato.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filtro superioreProdotti da laboratorio82101ZFOgni gabbia EE richiede uno di ogni catalogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, nonché due di 82109ZF. Il cibo è solo da un lato.
TunnelBio-ServK3323 o K3332Collegare le gabbie insieme e utilizzarle per l'arricchimento
Passacavo per collegare il tunnel alle gabbieFabbricato dall'Università dello Utah Machine Shopn/aAssicurarsi che il materiale sia resistente alla masticazione e autoclavabile
Ruota rapidaBio-ServK3250 o K3251Utilizzare con igloo per mouse e igloo per topi da pavimento
Bio-ServK3328, K3570 o K3327Utilizzo con ruota Fast-track e pavimento
Mouse Igloo pavimentoBio-ServK3244Utilizzo con mouse Igloo e Fast-Track
Mouse HutBio-ServK3272, K3102 o K3271
Crawl BallBio-ServK3330 o K3329
Bio-hutBio-ServK3352Capanna in polpa di legno utilizzata per il ricovero e la nidificazione
Pellicola adesiva VWR60941-072Utilizzare per coprire temporaneamente il foro praticato in una gabbia grande per impedire ai topi di fuoriuscire
Rack ventilato a flusso laminareTechniplastBio-C36L'armadio che abbiamo utilizzato in questo studio non è attualmente fornito. Il Bio-C36 è molto simile.
Provetta per microfugo da 1,5 mL - Senza RNAsi e DNAsiQualsiasi fornitore
QIAamp DNA Sgabello MiniKitQiagen51504Questo kit fornisce reagenti per 50 preparazioni di DNA. tampone per lisi delle feci=ASL; tampone di lisi del cloruro di guanidinio = AL; Tampone di lavaggio 1 con cloruro di guanidinio = AW1; Tampone di lavaggio 2= AW2; Tampone di eluizione con EDTA=AE
Waterbath (in grado di riscaldare a 95)Qualsiasi fornitorePer l'incubazione a 94 gradi di campioni di feci per lisi le cellule.
Bagno d'acqua (in grado di riscaldare a 70 gradi)Qualsiasi fornitorePer l'incubazione a 70 gradi di campioni di feci.
Etanolo (200 proof)Fluorimetro Sigma AldrichE7023
: QubitThermoFisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA kit di analisi ad ampio raggioThermoFisher ScientificQ32850
EB Buffer o 10 mM Tris pH 8.5Qiagen19086
Primer specifici per esperimentoQualsiasi fornitore
Grado PCR acquaQualsiasi fornitore
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix Kapa BiosystemsKK2601per amplificazione con ampliconi (1,25 mL consente 100 rxns).
Agarosio per l'esecuzione di gel diagnostici Qualsiasifornitore
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape TraceAgilent5067-5583Gli strumenti TapeStation o Bioanalyzer sono comuni nei nuclei di genomica istituzionale per analizzare la qualità delle librerie. In alternativa, è possibile utilizzare un bioanalizzatore DNA1000 un chip (Agilent, 5067-1504).
Agencourt AMPure XP Magnetic BeadsBeckman CoulterA63880Perle mageniche Per la pulizia PCR: 5 ml puliranno 250 reazioni PCR
Supporto magneticoLife TechnologiesAM10027
Guida alla preparazione della libreriaIlluminaIllumina. Sequenziamento metagenomico 16S Preparazione della libreria: Preparazione degli ampliconi del gene dell'RNA ribosomiale 16S per il sistema Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
IlluminaIllumina Experiment Managerdoppia indicizzazioneDisponibile gratuitamente all'indirizzo: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index KitIlluminaFC-131-1002Utilizzato per aggiungere codici a barre agli ampliconi
MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzettiApplied Biosystems/ThermoFisherN8010560
TruSeq Index Plate FixtureIlluminaFC-130-1005
Guarnizione adesiva trasparente per piastraApplied Biosystems /ThermoFisher4360954Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp Sequenziamento della pellicola adesiva
di MiSeq con reagenti v3 e doppia lettura da 300 bpIlluminaMS-102-3003
Kit di controllo PhiXIlluminaFC-110-3001
Proteinasi K (600 mAU/ml)Qiagen19131Equivalente a 20 mg/ml di proteinasi K. Fornito con il kit QiaAmp
Strumenti di analisi dei datiSoftware QIIME QiimeStrumentiL'installazione può variare in base al sistema e il sito Web QIIME descrive diverse opzioni (http://qiime.org/install/install.html). Per questo studio è stato utilizzato il pacchetto software MacQIIME 1.9.1 (compilato da Werner Lab, SUNY,
http://www.wernerlab.org/software/macqiime Passaggio 13.2.Metodo di unione QiimeFastQ ( http://code.google.com/p/ea-utils  ).   Per questo studio sono state utilizzate estremità accoppiate a più join http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Strumenti a riga di comando per l'elaborazione di dati di sequenziamento biologico. Analisi dell'espressione, Durham, NC. (2011).
Passaggio 13.3.QiimeDe-Novo OTU protocollo di pickinghttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Passaggio 13.3.1.Open Taxonomic Units (OTUs) utilizzando UclustEdgar, R.C. Ricerca e clusterizzazione di ordini di grandezza più velocemente di BLAST. Bioinformatica. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Passaggio 13.3.1.PynastPynastCaporaso, J.G. et al. PyNAST: uno strumento flessibile per allineare le sequenze a un allineamento di modelli. Bioinformatica. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). 
Passaggio 13.3.1.PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. et al. Greengenes, un database di geni 16S rRNA controllato da chimera e un workbench compatibile con ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). In questo studio è stata utilizzata la versione 13_8 di Greengenes
13.3.1. Nota: Qiimepiù librerie divisehttp://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Nota: QiimePick de novo OTUs scripthttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html 
Passaggio 13.2.2.QiimeCrea un file di mappaturahttp://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Passaggio 13.2.2.QiimeConvalida un file di mappaturahttp://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Passaggio 13.3.3.QiimeCollega l'OTU alla descrizione del campione al file di mappaturahttp://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Passaggio 13.3.4.QiimeRiassumere i Taxa attraverso tramehttp://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Passaggio 13.3.5.QiimeBioma Riassumi la tabellahttp://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  In questo studio, tutti i campioni sono stati rarefatti a 20.000 OTU, seguiti dall'analisi utilizzando lo script di rarefazione alfa in QIIME.
Esclusivo software a

Riferimenti

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