Articolo metodologico

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

DOI:

10.3791/57188

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31 maggio 2018

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1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Abstract

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Le cellule dendritiche (DC) sono popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono nella loro membrana cellulare marcatori, modelli di migrazione e distribuzione e nella loro presentazione dell'antigene e la capacità di attivazione delle cellule T. Poiché la maggior parte delle vaccinazioni di modelli sperimentali di tumore richiedono milioni di DC, sono ampiamente isolate dal midollo osseo o milza. Tuttavia, questi DC differiscono significativamente da sangue e tumore DC nelle loro risposte di immunocomplessi (IC) e presumibilmente di altri recettori lectinici Syk-accoppiato. D'importanza, data la sensibilità della DC a molecole associate al pericolo, la presenza di endotossine o anticorpi che passi crosslink recettori di attivazione in una dell'isolamento potrebbe provocare l'innesco della DC e incidere, di conseguenza i parametri, o almeno il dosaggio, richiesto per attivarli. Di conseguenza, qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare MoDC da sangue e tumori, evitando loro attivazione prematura. Inoltre, è fornito un protocollo per l'attivazione di MoDC con tumore IC e loro analisi successive.

Introduzione

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Fin dalla loro scoperta, le cellule dendritiche (DC) sono stati un fuoco di approfondite ricerche a causa della loro capacità unica di inclinare di differenziazione delle cellule T1. Nel corso degli ultimi decenni, uno sforzo di ricerca ha cercato di definire i vari sottoinsiemi di DC e la loro funzione durante la progressione del tumore e immunità 2. DCs sono composte da popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono gli uni dagli altri in loro recettori di riconoscimento di pattern, distribuzione tissutale, e migratori e antigene presentazione funzionalità3,4<....

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Protocollo

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I seguenti protocolli si riferiscono all'isolamento del mouse MoDC, ancora sui principi generali possono applicare ad altre celle di sottoinsiemi DC, pure. 12 - i topi C57Bl/6j 16-settimana-vecchio sono stati mantenuti in un'associazione americana per l'accreditamento di laboratorio Animal Care – accreditato animale impianto. Tutti i protocolli sono stati approvati dalla Stanford University e Tel-Aviv University istituzionale Animal Care e Comitato di uso.

1. isolamento del tumore associato monocito-derivate DC

  1. In una cappa a flusso laminare, rimuovere tumori da topi di CO2 eutanasizzati e tumori nel medium RPMI senza s....

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Risultati

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Inizialmente abbiamo confrontato la capacità degli anticorpi da topi syngeneic e trapianto allogeneic ingenuo di legarsi alle cellule del tumore. A tal fine, B16F10 e LMP linee cellulari del tumore erano fissate in paraformaldeide e lavate estensivamente. B16F10 è una linea cellulare di melanoma, che è stato originariamente isolato da metastasi del polmone in topi C57Bl/6. LMP è una cellula di tumore pancreatico che è stata isolata da KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + e Pdx-1-Cre topi e cr.......

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Discussione

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Dato il gran numero di DC necessaria per vaccinare i topi (circa 2-4 x 106 DC per un topo), la maggior parte della vaccinazione strategie nei topi si basano sull'isolamento di DC da BM e milza seguita da loro attivazione ex vivo . Tuttavia, i tentativi di attivare tumore DC in vivo, utilizzando le stesse condizioni per l'attivazione della milza e BM DC, spesso rimaste soccombenti nella produzione efficace immunità. In due successive pubblicazioni, Carmi et al. hanno trovato che sangu.......

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori dichiarano non hanno alcun conflitto di interessi e che non hanno nulla da rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep Kit di isolamento dei monociti StemCellTechnologies19861
Collagenase IVSigmaC9697-50MGTest per ogni lotto per l'endotossina
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071Test per ogni lotto per l'endotossina
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S.

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Attivazione del complesso immunitarioisolamento di cellule tumoraliisolamento di cellule ematicheseparazione mediante sferette magnetichecentrifugazione a gradiente di densitanalisi tramite citometria a flussoselezione di cellule CD11bcomplesso tumorale marcato con CFSEattivazione delle cellule dendritiche

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