Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.
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Articolo metodologico
Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) sono popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono nella loro membrana cellulare marcatori, modelli di migrazione e distribuzione e nella loro presentazione dell'antigene e la capacità di attivazione delle cellule T. Poiché la maggior parte delle vaccinazioni di modelli sperimentali di tumore richiedono milioni di DC, sono ampiamente isolate dal midollo osseo o milza. Tuttavia, questi DC differiscono significativamente da sangue e tumore DC nelle loro risposte di immunocomplessi (IC) e presumibilmente di altri recettori lectinici Syk-accoppiato. D'importanza, data la sensibilità della DC a molecole associate al pericolo, la presenza di endotossine o anticorpi che passi crosslink recettori di attivazione in una dell'isolamento potrebbe provocare l'innesco della DC e incidere, di conseguenza i parametri, o almeno il dosaggio, richiesto per attivarli. Di conseguenza, qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare MoDC da sangue e tumori, evitando loro attivazione prematura. Inoltre, è fornito un protocollo per l'attivazione di MoDC con tumore IC e loro analisi successive.
Introduzione
Fin dalla loro scoperta, le cellule dendritiche (DC) sono stati un fuoco di approfondite ricerche a causa della loro capacità unica di inclinare di differenziazione delle cellule T1. Nel corso degli ultimi decenni, uno sforzo di ricerca ha cercato di definire i vari sottoinsiemi di DC e la loro funzione durante la progressione del tumore e immunità 2. DCs sono composte da popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono gli uni dagli altri in loro recettori di riconoscimento di pattern, distribuzione tissutale, e migratori e antigene presentazione funzionalità3,4<....
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Protocollo
I seguenti protocolli si riferiscono all'isolamento del mouse MoDC, ancora sui principi generali possono applicare ad altre celle di sottoinsiemi DC, pure. 12 - i topi C57Bl/6j 16-settimana-vecchio sono stati mantenuti in un'associazione americana per l'accreditamento di laboratorio Animal Care – accreditato animale impianto. Tutti i protocolli sono stati approvati dalla Stanford University e Tel-Aviv University istituzionale Animal Care e Comitato di uso.
1. isolamento del tumore associato monocito-derivate DC
- In una cappa a flusso laminare, rimuovere tumori da topi di CO2 eutanasizzati e tumori nel medium RPMI senza s....
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Risultati
Inizialmente abbiamo confrontato la capacità degli anticorpi da topi syngeneic e trapianto allogeneic ingenuo di legarsi alle cellule del tumore. A tal fine, B16F10 e LMP linee cellulari del tumore erano fissate in paraformaldeide e lavate estensivamente. B16F10 è una linea cellulare di melanoma, che è stato originariamente isolato da metastasi del polmone in topi C57Bl/6. LMP è una cellula di tumore pancreatico che è stata isolata da KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + e Pdx-1-Cre topi e cr.......
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Discussione
Dato il gran numero di DC necessaria per vaccinare i topi (circa 2-4 x 106 DC per un topo), la maggior parte della vaccinazione strategie nei topi si basano sull'isolamento di DC da BM e milza seguita da loro attivazione ex vivo . Tuttavia, i tentativi di attivare tumore DC in vivo, utilizzando le stesse condizioni per l'attivazione della milza e BM DC, spesso rimaste soccombenti nella produzione efficace immunità. In due successive pubblicazioni, Carmi et al. hanno trovato che sangu.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano non hanno alcun conflitto di interessi e che non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Kit di isolamento dei monociti StemCell | Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test per ogni lotto per l'endotossina |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test per ogni lotto per l'endotossina |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
Riferimenti
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S.
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Ristampe e permessi
Tag
Attivazione del complesso immunitarioisolamento di cellule tumoraliisolamento di cellule ematicheseparazione mediante sferette magnetichecentrifugazione a gradiente di densitàanalisi tramite citometria a flussoselezione di cellule CD11bcomplesso tumorale marcato con CFSEattivazione delle cellule dendritiche
