Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell'analisi genetica.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Semplice sequenza ripetere (SSR) è uno degli indicatori più efficaci utilizzati in programmi di allevamento molecolare e ricerca genetica vegetale e animale. Macchiatura d'argento è un metodo ampiamente usato per l'individuazione di marcatori SSR in un gel di poliacrilammide. Tuttavia, protocolli convenzionali per la macchiatura d'argento sono tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Come molti altri laboratorio biologico tecniche, argento che macchia i protocolli sono stati costantemente ottimizzati per migliorare l'efficienza di rivelazione. Qui, segnaliamo un semplificato argento che macchia il metodo che significativamente riduce i costi di reagente e migliora la chiarezza di rilevamento ad alta risoluzione e foto. Il nuovo metodo richiede due passaggi principali (impregnazione e sviluppo) e tre reagenti (nitrato d'argento, idrossido di sodio e formaldeide) e solo 7 min di elaborazione per un non-denaturante del gel di poliacrilammide. Rispetto ai protocolli precedentemente segnalati, questo nuovo metodo è più facile, più veloce e utilizza meno reagenti chimici per il rilevamento di SSR. Pertanto, questo argento semplice, basso costo ed efficace protocollo di colorazione trarranno beneficio mappatura genetica e riproduzione assistita da una rapida generazione di dati marcatore SSR.
Introduzione
Lo sviluppo di marcatori basati sulla PCR ha rivoluzionato la scienza della genetica vegetale e allevamento1. Indicatori di sequenza semplice ripetizione (SSR) sono tra i marcatori di DNA più versatili e più comunemente utilizzati. Loro genoma ampia copertura, abbondanza, specificità del genoma e ripetibilità sono solo alcuni dei meriti di marcatori SSR oltre alla loro eredità codominante per l'individuazione di genotipi eterozigoti2. Parecchi studi hanno utilizzato i marcatori SSR per indagare la diversità genetica, tenere traccia di ascendenza, costruire mappe di collegamento genetico e mappare geni per tratti economic....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. preparazione dei prodotti PCR di marcatori SSR
- Preparare tutti i prodotti chimici e reagenti per reazioni di PCR, compreso il modello DNA (30 ng / µ l), 2 × mix PCR master (contenente 2 × PCR tampone, 0,4 mM di ogni dNTP, 3mm di MgCl2, 0,1 U / µ l di Taq DNA polimerasi e coloranti), 10 µM di ciascuno avanti e indietro gli iniettori e acqua distillata o deionizzata (dH2O).
Nota: I marcatori SSR utilizzati nel presente studio sono stati PT51333 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e sequenza inversa primer: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - AAATTTCTTTCGG....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Gli ampliconi PCR sono state prodotte utilizzando le corrispondenti coppie di primer SSR in fioritura cavolo cinese e tabacco. Dopo l'elettroforesi, il gel di poliacrilammide erano macchiate usando l'argento di cui sopra che macchia protocollo, che senza ambiguità rilevate i disegni a strisce di marcatori SSR (Figura 1).
Per confrontare l'efficienza di rivelazione d'argento diverso protocolli di col.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il lavaggio del gel dopo l'impregnazione è un passaggio fondamentale. Volume di tempo e acqua di lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta di impregnazione soluzione sulla superficie della piastra e il gel e causare uno sfondo scuro. Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passaggio chiave, eccesso di sviluppo può risultare in una priorità bassa scura con immagine a basso contrasto dei frammenti del DNA. Inoltre, il passaggio di impregnazione influenza in modo significativo l'efficienza colorazione d.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato il Natural Science Foundation di Guangdong (2015A030313500), la piattaforma di ricerca di Key International Cooperative provinciali e i principali scientifico ricerca progetto di Guangdong istruzione superiore (2015KGJHZ015), la scienza e Piano per le tecnologie di Guangdong amministrazione del monopolio del tabacco (201403, 201705), la scienza e la tecnologia piano di Guangdong, Cina (2016B020201001), il progetto di formazione nazionale di innovazione per gli studenti (201711078001). Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approva....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, Cina | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 Marcatore DNA | Takara Bio Inc., Giappone | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, Cina | #77-86-1 | |
| Acido borico | Sangon Biotech Shanghai, Cina | #10043-35-3 | |
| EDTA-NA2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, Cina | #6381-92-6 | |
| Acrilammide | Sangon Biotech Shanghai, Cina | #79-06-1 | |
| N,N'-metilene-bis-acrilammide | Sangon Biotech Shanghai, Cina# | 110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina | Sangon Biotech Shanghai, Cina | #110-18-9 | |
| persolfato di | ammonio Guangzhou, Cina | #7727-54-0 | |
| Bind-silano | Solarbio Pechino, Cina | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm reagente chimico Beijing Co., Ltd, Cina | #7761-88-8 | |
| reagenti chimici Formaldeide Tianjin DaMao, Cina | #50-00-0 | ||
| Fabbrica | reagenti chimici NaOH Guangzhou, Cina | #1310-73-2 | |
| reagenti chimici di | Canton per acido acetico | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Fabbrica di reagenti chimici Tianjin DaMao, Cina | #497-19-8 | |
| per etanolo | Guangzhou, Cina | #64-17-5 | |
| HNO< sub>3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, Cina | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Cina# | 10102-17-7 | |
| Eriochrome black T (EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Vassoio di plastica | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, | China-TS-1 | |
| Shaker | Qilinbeter JiangSu, | China-BenQ | |
| Alimentatore | Beijing Liuyi Instrument Factory, | China-High | |
| in tutti i sistemi di gel verticali, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Cina | - |
Riferimenti
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
