Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide

Summary

Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell'analisi genetica.

Abstract

Semplice sequenza ripetere (SSR) è uno degli indicatori più efficaci utilizzati in programmi di allevamento molecolare e ricerca genetica vegetale e animale. Macchiatura d'argento è un metodo ampiamente usato per l'individuazione di marcatori SSR in un gel di poliacrilammide. Tuttavia, protocolli convenzionali per la macchiatura d'argento sono tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Come molti altri laboratorio biologico tecniche, argento che macchia i protocolli sono stati costantemente ottimizzati per migliorare l'efficienza di rivelazione. Qui, segnaliamo un semplificato argento che macchia il metodo che significativamente riduce i costi di reagente e migliora la chiarezza di rilevamento ad alta risoluzione e foto. Il nuovo metodo richiede due passaggi principali (impregnazione e sviluppo) e tre reagenti (nitrato d'argento, idrossido di sodio e formaldeide) e solo 7 min di elaborazione per un non-denaturante del gel di poliacrilammide. Rispetto ai protocolli precedentemente segnalati, questo nuovo metodo è più facile, più veloce e utilizza meno reagenti chimici per il rilevamento di SSR. Pertanto, questo argento semplice, basso costo ed efficace protocollo di colorazione trarranno beneficio mappatura genetica e riproduzione assistita da una rapida generazione di dati marcatore SSR.

Introduction

Lo sviluppo di marcatori basati sulla PCR ha rivoluzionato la scienza della genetica vegetale e allevamento¹. Indicatori di sequenza semplice ripetizione (SSR) sono tra i marcatori di DNA più versatili e più comunemente utilizzati. Loro genoma ampia copertura, abbondanza, specificità del genoma e ripetibilità sono solo alcuni dei meriti di marcatori SSR oltre alla loro eredità codominante per l'individuazione di genotipi eterozigoti². Parecchi studi hanno utilizzato i marcatori SSR per indagare la diversità genetica, tenere traccia di ascendenza, costruire mappe di collegamento genetico e mappare geni per tratti economic....

Protocol

1. preparazione dei prodotti PCR di marcatori SSR

1. Preparare tutti i prodotti chimici e reagenti per reazioni di PCR, compreso il modello DNA (30 ng / µ l), 2 × mix PCR master (contenente 2 × PCR tampone, 0,4 mM di ogni dNTP, 3mm di MgCl₂, 0,1 U / µ l di Taq DNA polimerasi e coloranti), 10 µM di ciascuno avanti e indietro gli iniettori e acqua distillata o deionizzata (dH₂O).
   Nota: I marcatori SSR utilizzati nel presente studio sono stati PT51333 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e sequenza inversa primer: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - AAATTTCTTTCGG....

Results

Gli ampliconi PCR sono state prodotte utilizzando le corrispondenti coppie di primer SSR in fioritura cavolo cinese e tabacco. Dopo l'elettroforesi, il gel di poliacrilammide erano macchiate usando l'argento di cui sopra che macchia protocollo, che senza ambiguità rilevate i disegni a strisce di marcatori SSR (Figura 1).

Per confrontare l'efficienza di rivelazione d'argento diverso protocolli di col.......

Discussion

Il lavaggio del gel dopo l'impregnazione è un passaggio fondamentale. Volume di tempo e acqua di lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta di impregnazione soluzione sulla superficie della piastra e il gel e causare uno sfondo scuro. Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passaggio chiave, eccesso di sviluppo può risultare in una priorità bassa scura con immagine a basso contrasto dei frammenti del DNA. Inoltre, il passaggio di impregnazione influenza in modo significativo l'efficienza colorazione d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, Cina	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 Marcatore DNA	Takara Bio Inc., Giappone	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, Cina	#77-86-1
Acido borico	Sangon Biotech Shanghai, Cina	#10043-35-3
EDTA-NA2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, Cina	#6381-92-6
Acrilammide	Sangon Biotech Shanghai, Cina	#79-06-1
N,N'-metilene-bis-acrilammide	Sangon Biotech Shanghai, Cina#	110-26-9
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina	Sangon Biotech Shanghai, Cina	#110-18-9
persolfato di	ammonio Guangzhou, Cina	#7727-54-0
Bind-silano	Solarbio Pechino, Cina	#B8150
AgNO3	Sinopharm reagente chimico Beijing Co., Ltd, Cina	#7761-88-8
reagenti chimici Formaldeide Tianjin DaMao, Cina	#50-00-0
Fabbrica	reagenti chimici NaOH Guangzhou, Cina	#1310-73-2
reagenti chimici di	Canton per acido acetico	#64-19-7
Na2CO3	Fabbrica di reagenti chimici Tianjin DaMao, Cina	#497-19-8
per etanolo	Guangzhou, Cina	#64-17-5
HNO< sub>3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, Cina	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Cina#	10102-17-7
Eriochrome black T (EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Vassoio di plastica	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,	China-TS-1
Shaker	Qilinbeter JiangSu,	China-BenQ
Alimentatore	Beijing Liuyi Instrument Factory,	China-High
in tutti i sistemi di gel verticali, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Cina	-