Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Sommario

Questo protocollo fornisce una panoramica delle procedure per l'isolamento di RNA per la profilazione di trascrittomica di linfonodo tessuti da grandi animali, compresi i passaggi nell'identificazione e l'asportazione dei linfonodi da bestiame e animali selvatici, approcci di campionamento per garantire la consistenza attraverso più animali e considerazioni più risultati rappresentativi per la conservazione post-raccolta e l'elaborazione per l'analisi del RNA.

Abstract

Grandi animali (bestiame e animali selvatici) servono come importanti serbatoi di agenti patogeni zoonotici, compreso Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaed e. colie sono utili per lo studio della patogenesi e/o diffusione dei batteri negli ospiti naturali. Con la funzione chiave di linfonodi nella risposta immunitaria ospite, linfonodo tessuti servire come una potenziale fonte di RNA per analisi trascrittomica a valle, al fine di valutare i cambiamenti temporali nell'espressione genica in cellule nel corso di un'infezione. Questo articolo presenta una panoramica del processo di raccolta di linfonodo, campioni tissutali e a valle RNA processing in bestiame, usando bovini (Bos taurus) come un modello, con ulteriori esempi forniti dal bisonte americano (bisonte del bisonte di ). Il protocollo comprende le informazioni relative all'ubicazione, identificazione e rimozione dei linfonodi da più siti chiave nel corpo. Inoltre, è presentata una metodologia di prelievo bioptico che consente per una consistenza di campionamento attraverso più animali. Diverse considerazioni per la conservazione del campione sono discusse, compreso la generazione di RNA adatto a valle metodologie come RNA-sequenziamento e RT-PCR. A causa dei lunghi ritardi insiti nella grande animale vs mouse tempo corso di studi, risultati rappresentativi da bison e tessuti bovini linfonodo sono presentati per descrivere il corso di tempo del degrado in questo tipo di tessuto, nel contesto di una revisione del precedenti lavori metodologici sulla degradazione del RNA in altri tessuti. Nel complesso, questo protocollo sarà utile per entrambi ricercatori veterinari inizio transcriptome progetti su grandi campioni di animali e per i biologi molecolari sono interessati ad apprendere tecniche per in vivo campioni tissutali e trattamento in vitro .

Introduzione

RNA-ordinando l'analisi del trascrittoma di linfonodi offre l'opportunità di caratterizzare la risposta immunitaria degli animali ad una varietà di agenti patogeni. Mentre questa metodologia è stata utilizzata estesamente in topi, analisi recentemente sono state espandendo in più grandi mammiferi^1,2. Bestiame/grande animale dei linfonodi può essere utilizzati per caratterizzare la risposta dell'ospite all'infezione, non solo per il loro uso nel vaccino o gli studi di predisposizione genetica e per l'identificazione di bersagli per lo sviluppo di farmaci, ma anche come sistemi modello per studi umani su malattie zoonotiche. Ad esempio, nel caso di brucellosi (una malattia zoonotica batterica che impatti mezzo milione di persone nel mondo ogni anno), nonostante ha aumentato significativamente i costi, gli studi in pecore o capre sono più rilevanti per l'infezione umana e vaccino umano sviluppo di modelli animali di laboratorio. Modelli murini di infezione ricapitolano l'infezione del sistema reticoloendoteliale ma non i segni clinici caratteristici³_.

Negli esperimenti sugli animali grandi rispetto agli studi sugli animali di laboratorio, il processo di tessuto raccolta necessariamente comporta un ritardo maggiore tra l'eutanasia e l'insieme del tessuto, che presenta una sfida per la conservazione della RNA di alta qualità. Il RNA intatto è essenziale per la generazione di dati di trascrittomica biologicamente rilevanti. La generazione di RNA di alta qualità da campioni di tessuto è particolarmente critica per gli studi di grande agente patogeno animale condotto in strutture di contenimento. Tali studi sono intrinsecamente più difficili da eseguire come non solo richiedono impianti autorizzati e personale altamente qualificato, ma anche portare significativi costi finanziari, che, a seconda del lavoro, possono variare da decine a centinaia di migliaia di dollari. Questi tipi di studi implicano anche una collaborazione interdisciplinare e conoscenza interdisciplinare per il loro completamento, aggiungendo alla loro complessità. Di conseguenza, formazione, sviluppo di e il rispetto di un sistema semplificato per la raccolta dei campioni e conservazione offre notevoli vantaggi per gli studi molecolari a valle dei tessuti da animali infetti.

La collezione dei linfonodi più grande presenta ulteriori sfide per la raccolta di tessuto rispetto al simile campionamento dei linfonodi murini. La preparazione per l'asportazione di campione richiede una conoscenza di base dell'anatomia del linfonodo, comprese le pertinenti strutture interne. La struttura di un linfonodo è costituita da lobuli linfoidi circondati da seni pieni di linfa. Queste strutture sono racchiuse da una capsula fibrosa, dura. ⁴ un lobulo linfoide è il "anatomica e funzionale unità base del linfonodo" ed è composto di follicoli, un'unità profonda corticale e cordoni midollari e seni⁴ (Figura 1A). I linfociti B e T sono sede del follicoli e corticale profonda unità, rispettivamente. Queste strutture forniscono un ponteggio 3D e facilitano l'interazione tra linfociti e cellule presentanti l'antigene o antigene.

Grossolanamente, follicoli e unità profonda corticale può essere identificato sulla superficie di taglio, dato che contengono un denso reticolo reticolare e appaiono più scuri rispetto i seni, che sono costituiti da un reticolo reticolare più delicato e appaiono più chiare (Figura 1B). Per convenzione, i patologi si riferiscono alle regioni dei linfonodi come la corteccia superficiale (follicoli), la paracorteccia (profondità corticale unità) e il midollo (cordoni midollari e seni paranasali). Un esame adeguato di tutte le tre regioni è stato considerato come migliore pratica negli orientamenti per l'esame patologico sistematico per linfonodi⁵. Nota che c'è una considerevole variazione nella consistenza, dimensione e il colore dei linfonodi, anche all'interno di un singolo animale. Come età animali, loro linfonodi tenderà a diminuire di dimensioni e diventare più forte di quelli degli animali più giovani, in genere a causa di un aumento nel loro tessuto connettivo e una riduzione del normale linfoide struttura^6,7.

Figura 1. Anatomia del linfonodo. (A) questa immagine del fumetto Mostra l'anatomia del linfonodo, raffiguranti strutture chiave. (B) questo fermo immagine mostra un linfonodo bovino tagliato in sezione trasversale. Sono evidenziati le pertinenti strutture/strati che sono visibili ad occhio nudo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A seconda della domanda sperimentale, vari linfonodi sarà di interesse per la raccolta e l'analisi. Linfonodi periferici sono quelli situati nel tessuto sottocutaneo profondo. Nei bovini, linfonodi periferici o superficiale, spesso utilizzati nella pratica clinica e sperimentale includono parotide, sottomandibolare, retropharyngeal, -prescapolari, prefemorali (precrural) e superficiale inguinale (soprammammari in femmine, scrotale nei maschi) ( Figura 2). In tabella 1, sono descritte le proprietà della chiave linfonodi superficiali, come descritto nel bestiame sistema⁸. Sotto, alcuni potenziali piani di raccolta di linfonodo per malattie infettive batteriche del bestiame sono presentati come punto di partenza per l'indagine.

Brucella abortus/Brucella melitensis: Standard necropsies per b. abortus-infetti bestiame e b. melitensis-capre infette al National Animal Disease Center recupero tessuto linfonodo parotideo, prescapular e soprammammari , sia per la macinazione per l'enumerazione batterica e per la preparazione di RNA per il delineamento di espressione host RNA. B. abortus possono essere recuperati regolarmente in ciascuno di questi linfonodi in bestiami infettati sperimentalmente⁹_. La presenza di batteri in ognuno di questi tipi di linfonodo può essere rilevata in b. melitensis-infettati capre fino a post-infezione almeno nove mesi, usando le metodologie basate su RNA dai nostri studi (Boggiatto et al., non pubblicato). Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemorali), e i linfonodi mesenterici sono stati utili durante la profilatura delle carcasse di bovini per una prevalenza di Salmonella ^10,11,12 e sarebbe di potenziale interesse per gli studi di trascrittomica. Escherichia coli O157: H7: linfonodi mesenterici (a medio piccolo intestino e intestino tenue distale posizioni) possono essere i siti di un recupero occasionale dei batteri in vitelli infetti (ma non in bovini adulti infetti)¹³. Leptospirosi (Leptospira SP.): una persistenza cronica dei batteri è stata osservata nei linfonodi drenanti la ghiandola mammaria¹⁴. Mycobacterium bovis : Nei bovini, i batteri sono stati recuperati di infezione post-sperimentale dai linfonodi mediastinici e tracheobronchial vitelli¹⁵. Inoltre, RNA di linfonodo è stato utilizzato per esaminare le risposte di grande animale ospite ai virus, come la sindrome riproduttiva e respiratoria del suino virus². Figura 2 descrive la posizione di un sottoinsieme di questi linfonodi principali nel corpo del bestiame.

Figura 2: Cartone animato raffigurante località selezionata di linfonodo in Bos taurus . I linfonodi numerati vengono annotati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo articolo e il video associato, presentiamo un protocollo per l'isolamento dei linfonodi grandi animali per studi di RNA, progettati per essere informativo per i biologi molecolari coinvolti negli studi di trascrittomica di grandi infezioni degli animali. In primo luogo, forniamo una panoramica della procedura di isolamento per i linfonodi, mediante campionamento dai tessuti bovini e bisonte come esempi. Accoppiato con questa dimostrazione, come mostrato nel video, è un flusso di lavoro per un campione del tessuto riproducibile per isolamento del RNA. Descriveremo inoltre considerazioni importanti per l'elaborazione di un linfonodo infetto, con un focus sulla sicurezza, la coerenza e la qualità di RNA.

La preparazione di RNA dal tessuto con un reagente di isotiocianato di fenolo-guanidina acidificato è basata sul metodo originale di Chomczynski e Sacchi^16,17, con una purificazione su colonne di spin a base di silice in presenza di agenti caotropici basati sul lavoro originale di Vogelstein e Gillespie¹⁸. Esaminiamo anche il potenziale per il recupero di RNA per trascrittomica dai linfonodi bestiame conservati con metodi alternativi. Infine, abbiamo esplorare l'impatto della variabile tempo sulla qualità di RNA in grande autopsie animali, tra cui un esperimento rappresentanza raffigurante l'effetto di un aumento nel tempo tra l'eutanasia e il campionamento sul profilo del RNA recuperato da bison e bovina nei linfonodi. Questo articolo sarà utile non solo per i biologi molecolari, ma anche a veterinari ricercatori che inizia gli studi di trascrittomica.

Protocollo

Le procedure di autopsia degli animali qui raffigurate sono coperti da protocolli approvati IACUC presso il National Animal Disease Center, Ames, IA. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli orientamenti approvati per la cura degli animali e il benessere.

1. pre-pianificazione prima autopsia

1. Prima l'autopsia, preparare i seguenti materiali per il trasporto per la suite di autopsia:
   1. microcentrifuga da 1,5 o 2 mL riempita con ~ 1,0 mL di soluzione di conservazione di RNA, in un contenitore rack o trasporto. Assicurarsi di seguire le linee guida del produttore per il rapporto tra il volume di soluzione di conservazione per il volume del tessuto.
   2. Bisturi monouso e forcipe pulito, sterilizzato nell'autoclave: uno impostato per la dissezione della pelle e un set diverso per la raccolta dei linfonodi (uno per ogni linfonodo, per animale), impedendo così una contaminazione della pelle e dell'ambiente flora con il linfonodo tessuti.
   3. 3 punzone mm utensili biopsia, l'autopsia, un apposito contenitore per il bisturi usati e strumenti di biopsia e taglieri o vassoi monouso per uso nella dissezione di linfonodo.
   4. Utilizzare dispositivi di protezione individuale, compresi PPE necessari per il lavoro al livello BSL appropriato per il sistema.
   5. Autoclave riutilizzabile utensili metallici, tra cui il forcipe, in recipienti in metallo prima dell'autopsia, usando le merci di utensili/a secco l'impostazione.

2. identificazione e campionamento dei linfonodi nei bovini e Bison

Figura 3 . I linfonodi del collo e testa del bovino. (A) questa immagine cartone spettacoli selezionati dei linfonodi della testa e del collo di Bos taurus. (B) questa immagine mostra il linfonodo parotideo in sezione trasversale (a sinistra) rispetto alla ghiandola salivaria parotidea in sezione trasversale (a destra). Si noti la differenza tra i tipi di due tessuto texture. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Isolamento dei linfonodi-prescapolari nei bovini e bisonte
   1. Eutanasia animale (bovini o bisonte di qualsiasi età, come appropriato per l'esperimento) basato sul protocollo IACUC locale. Confermare la morte di metodi specificamente descritti nel protocollo IACUC istituzionale, tra cui la mancanza di un battito cardiaco, la mancanza di respirazione e l'assenza di un riflesso corneale. Spostare l'animale al piano l'autopsia.
      Nota: Ci sono vari metodi di eutanasia umana usato nella pratica di laboratorio di grandi animali. Tuttavia, la somministrazione endovenosa di soluzione di sodio sodio pentobarbital e fenitoina è il più comunemente approvato e utilizzato forma. Consultare le linee guida di AVMA per l'eutanasia degli animali. ¹⁹
      Attenzione: Seguire tutti i protocolli di biosicurezza rilevanti per un'autopsia presso l'Istituto ospitante, compresi gli orientamenti per lo smaltimento sicuro dei dispositivi taglienti in un contenitore a prova di puntura e la decontaminazione di coltelli in metallo riutilizzabili e forcipe. Questo protocollo genera rifiuti taglienti dall'uso di bisturi monouso. Indossare indumenti protettivi, come dettato dalle linee guida istituzionali, tra cui stivali, tute, guanti e occhiali di protezione.
   2. Identificare 3 partecipanti a lavorare sui tessuti animali.
      Nota: Qui, dissettore 1 verrà essere incaricato il su grande scala di sezionamento dei tessuti animali desiderati, dissettore 2 recupererà i linfonodi dalle diverse sezioni animali e dissettore 3 lavorerà ad un tavolo separato per isolare le sezioni da ogni linfonodo e trasferirli ai tubi con una soluzione conservante.
   3. Inizia mettendo l'animale in decubito laterale.
   4. Estendere la spalla spostando indietro l'arto anteriore a livello del ginocchio (carpo); Questo movimento riporterà la spalla e consentire una più facile palpazione del linfonodo. Sentire la presenza del linfonodo "grumo".
      Nota: In condizioni di malattia, linfoadenopatia può essere presente, che rende più facile l'identificazione dei linfonodi, ma questo processo può anche influenzare la coerenza, la composizione e l'architettura del linfonodo.
   5. Una volta individuato e con la spalla ancora esteso, è possibile utilizzare un coltello bisturi o l'autopsia per fare un'incisione della pelle lungo il contorno della spalla.
      Nota: Non limita la dimensione dell'incisione, anche se il linfonodo è stato posizionato tramite la palpazione. Una grande incisione fornisce l'accesso più facile ai tessuti più profondi e facilita l'asportazione del linfonodo per il dissettore.
   6. Utilizzando un paio di pinze, ritrarre la pelle per rivelare il punto della spalla e muscolatura del collo.
      Nota: Il linfonodo-prescapolari si trova spesso nel grasso sottocutaneo, soprattutto negli animali overconditioned.
   7. Ancora una volta, palpare la posizione del linfonodo (Figura 3A).
      Nota: A differenza del grasso sottocutaneo, il linfonodo terrà la sua forma quando palpated. Inoltre, i linfonodi non sono contigui con qualsiasi tessuto circostante, come essi sono racchiusi da una capsula fibrosa sottile.
   8. Dopo aver individuato il linfonodo-prescapolari, accuratamente sezionare il grasso sottocutaneo, usando un bisturi e pinze e isolare il linfonodo.
      1. Cercare la presenza di una capsula fibrosa sottile, come raffigurato in Figura 1B, per distinguere tra il linfonodo e tessuto adiposo; i linfonodi non sono contigui con qualsiasi tessuto circostante.
   9. Trasferire il linfonodo alla tabella di dissezione di linfonodo, utilizzando un vassoio di plastica per il trasferimento del tessuto, per ulteriore sezionamento.
      Nota: L'aspetto di questi linfonodi in bisonte è simile. Il video associato raffigura l'aspetto del linfonodo-prescapolari come dissecato fuori la spalla destra di un bisonte americano.
2. Isolamento dei linfonodi parotidei nei bovini e bisonte
   1. Inizia mettendo l'animale in decubito laterale sul pavimento l'autopsia. Individuare il giunto temporomandibular (TMJ).
      1. Se questo è difficile da individuare, spostare lentamente la mandibola e determinare la posizione in cui la mandibola si attacca al cranio; si tratta di TMJ.
   2. Con attenzione usando un coltello bisturi o l'autopsia, fare un'incisione nella pelle. Iniziare l'incisione dorsale al giunto ed estenderlo ventralmente/verticalmente lungo la linea della mascella.
   3. Sezionare la pelle via per rivelare il tessuto sottocutaneo. Ghiandola salivaria parotidea saranno visibile in primo luogo, a causa di grandi dimensioni, aspetto superficie lobulated e colorazione rossa.
   4. Utilizzando forcipe e un bisturi, spostare la ghiandola salivaria parotidea da parte per trovare il linfonodo parotideo che si siede appena craniale e mediale alla ghiandola salivare (Figura 3A). Esaminare il tessuto del linfonodo parotideo per trama prima del successivo trattamento.
      Nota: i linfonodi del viso (parotide e sottomandibolare) sono associate a ghiandole salivari, che può confondere l'isolamento di linfonodo. Rispetto ai linfonodi, ghiandole salivari sono molto più grandi e hanno un aspetto lobulato. Inoltre, sulla superficie di taglio, ghiandole salivari sono omogenee in natura e non presentano il classico modello architetturale corticale e midollare dei linfonodi (Figura 3B).
   5. Asportare la ghiandola con un bisturi. Trasferirlo alla tabella di dissezione di linfonodo, utilizzando un vassoio di plastica per il trasferimento del tessuto, per ulteriore sezionamento.
3. Isolamento dei linfonodi soprammammari nei bovini femminili e bisonte
   1. Metti l'animale in decubito laterale.
   2. Elevare la gamba posteriore per esporre la regione inguinale e individuare la mammella.
      Nota: In un animale sano, che non allattano, palpazione di questi linfonodi potrebbe non essere possibile. In un animale durante l'allattamento, questi linfonodi può essere palpabili al bordo caudale della base della mammella.
   3. Usando un bisturi, fare un'incisione appena dorsale alla mammella, che corre lungo la parte superiore della gamba, per esporre le ghiandole soprammammari.
   4. Sezionare il tessuto sottocutaneo e trovare il linfonodo soprammammari incorporato in un sottile strato di grasso sottocutaneo. Se non è visivamente distinguibile, palpare il tessuto esposto per la presenza di una struttura costante all'interno del grasso sottocutaneo.
   5. Usando un bisturi e pinze, sezionare con cura il linfonodo dal grasso. Trasferirlo alla tabella di dissezione di linfonodo, utilizzando un vassoio di plastica per il trasferimento del tessuto, per ulteriore sezionamento.

3. sezionamento e deposito dei linfonodi

1. Passare i linfonodi isolati da dissettore 2 a dissettore 3 a un tavolo di dissezione adiacente allo spazio principale autopsia. Posizionare ogni linfonodo su una sezione fresca di un tagliere. Pre-etichettare i taglieri in sezioni di linfonodo, per facilitare la ricezione dei linfonodi multipli in successione. Per campioni infetti, utilizzare vassoi monouso.
2. Utilizzando pinze e una lama di bisturi o l'autopsia monouso, rimuovere una sezione del linfonodo. Usando un coltello affilato, fare un taglio sagittale ad aprirsi il linfonodo.
3. Esaminare l'interno del linfonodo, soprattutto negli esemplari di animali infetti, alla ricerca di asimmetria, lesioni, differenze di colore, ecc. registrare le osservazioni.
4. (Opzione 1) Sezioni di tessuto piccolo
   1. Utilizzare bisturi monouso per asportare pezzi di ogni linfonodo che sono meno di 5 mm di spessore e trasferire ogni pezzo in una provetta con una soluzione di conservazione di RNA con una pinza pulita.
5. (Opzione 2) Metodologie di sezionamento o di biopsia di linfonodo
   Nota: Le biopsie o metodologie di sezionamento, quando applicato alle sezioni parallele di linfonodo in diversi nodi e animali, forniscono coerenza del tessuto campione per un'analisi del RNA di massa.
   1. Zeppa di metodo a sezione ottica
      1. Dopo aver esaminato la sezione sagittale per catturare le cellule attraverso il profilo del linfonodo, asportare un cuneo a forma di torta dal linfonodo, dal centro verso la capsula esterna. Per un nodo di 2 cm di larghezza (dimensione standard; si veda tabella 1), un cuneo tagliato al centro che è di 4 mm di lunghezza di arco esterno e 5 mm di spessore avrà un peso bagnato di ~ 100 mg.
      2. Utilizzando il bisturi, tagliare il cuneo in piccoli pezzi, non più spesse di 5 mm e circa 50-100 mg ogni peso tessuto bagnato.
         Nota: Per motivi di coerenza, elabora tutti i pezzi di Cuneo da un singolo linfonodo in un batch o in provette separate seguita da RNA pool per fornire un profilo rappresentativo di RNA dal linfonodo di interesse.
      3. Mettere i pezzi di tessuto con il forcipe in provette contenenti almeno 10 volumi di soluzione di conservazione di RNA, rispetto al volume del tessuto.
   2. Punch biopsia metodo
      1. Selezionare uno strumento di biopsia del punzone se l'obiettivo è quello di raccogliere le sezioni specifiche, quali specifici follicoli dal nodo. Selezionare uno strumento coerenza con la dimensione del campione desiderato per la raccolta. Punch biopsia strumenti sono disponibili in una gamma di dimensioni, da 1 a 8 mm di diametro.
      2. Individuare visivamente le regioni di interesse per esempio nel linfonodo.
      3. Utilizzare lo strumento di biopsia del punzone per asportare le sezioni di interesse, premendo e ruotando lo strumento nel tessuto per creare il nucleo. Trasferire il pezzo di tessuto con il forcipe in una provetta contenente almeno 10 volumi di soluzione di conservazione di RNA. Se più spessa di 5 mm, è possibile utilizzare un bisturi e pinze per dividere ulteriormente il tessuto in pezzi più piccoli.
6. Una volta che i campioni sono stati trasferiti alla soluzione di conservazione (ad es., RNALater), trasportarli indietro al laboratorio a temperatura ambiente.
7. Conservare i campioni a 4 ° C durante la notte per consentire la penetrazione del tessuto.
8. Il giorno dopo, versare la soluzione conservante di RNA in eccesso e conservare i campioni di tessuto a-80 ° C. Rimuovere tanto preservativo possibili prima di congelare i campioni. Usare una punta di una micropipetta P1000 e/o P200 per un'efficiente rimozione di soluzione conservante di RNA.
   Attenzione: Ignora la soluzione decantata conservazione in modo appropriato, sulla base delle proprietà infettive dell'agente patogeno utilizzato così come i rischi chimici e ambientali della soluzione conservante come specificato nella scheda di dati di sicurezza.
   Nota: Le linee guida qui riportate sono fornite per la soluzione di conservazione RNA descritta nella Tabella materiali. Consultare le linee guida del produttore se utilizza soluzioni di conservazione alternativo.

4. elaborazione da RNA linfonodi

Attenzione: Indossare un camice da laboratorio, guanti e protezione degli occhi adeguata per le fasi di lavorazione.

Nota: Il reagente fenolo-basato usato qui è descritta nella Tabella materiali (e il protocollo si basa sulle linee guida del produttore)²⁰. L'uso di reagenti alternativi a base di fenolo può richiedere una modifica della procedura, sulla base delle raccomandazioni del fabbricante del prodotto specifico acquistato.

1. Prima di accedere i campioni, pre-aliquota il reagente di fenolo-basato di freddo (4 ° C) per tubi di omogeneizzazione (1,5 mL/tubo), utilizzando una pipetta.
   Attenzione: Il fenolo è tossico, corrosivo e un pericolo per la salute. Il cloroformio è tossico e un pericolo per la salute. Completare i passaggi di elaborazione 4.1-4.9 in una cappa chimica e indossare i guanti per impedire qualsiasi contatto con le sostanze chimiche. Negli Stati Uniti, il cloroformio è un rifiuti pericolosi; Smaltire le provette contenenti rifiuti pericolosi secondo le linee guida locali e istituzionali. Campioni di tessuto di processo da animali infettati con gli agenti patogeni sotto il corrispondente BSL-2, BSL-3 o linee guida BSL-4.
2. Una volta che un campione può essere allentato dalla microcentrifuga con una pinza pulita, trasferire immediatamente circa 50-100 mg di tessuto conservato nella provetta di omogeneizzazione contenente il reagente fenolo-basato.
   1. Limitare lo scongelamento prima dell'aggiunta per il reagente fenolo-basato. Utilizzare l'archiviazione su ghiaccio secco quando campioni multipli vengono rimossi dal freezer per l'elaborazione.
3. Strettamente richiudere la provetta, posizionarlo sull'omogeneizzatore e omogeneizzare il campione con un omogeneizzatore del tessuto di rotore-statore nel reagente fenolo-basato. Completare il trattamento a temperatura ambiente. Quando completato, controllare per un'apparenza nuvolosa garantire che il campione è stato omogeneizzato con successo; il tessuto deve essere dispersa in una sospensione torbida.
   Nota: Viene utilizzata un'impostazione di estrazione di 2 min RNA (l'impostazione di RNA_02_1 pre-impostato per l'omogeneizzatore descritto in Tabella materiali; progettato per tessuti congelati). Rotore-statore specificato nel presente protocollo (Vedi la Tabella materiali) sono grande-dentato e adattato per l'omogeneizzazione di una gamma di tipi di tessuti, compreso il materiale fibroso. L'impostazione di RNA_02_01 è progettato specificamente per congelati (al contrario di fresco) tessuti. Come i linfonodi hanno componenti del tessuto connettivo fibroso, un omogeneizzatore a rotore-statore Analogamente ottimizzato è raccomandato per ottenere un efficace dissociazione. Vedere il National Institute of Environmental Health Sciences²¹ per ulteriori informazioni sui suggerimenti di omogeneizzazione.
   1. Se grandi blocchi di tessuto rimangono dopo l'omogeneizzazione, ripetere la procedura di omogeneizzazione. Al fine di recuperare in modo efficiente il RNA, il tessuto deve essere ben dissociato.
   2. Per pezzi più fibrosi di linfonodo, utilizzare pinze e le forbici pre-tagliare il pezzo di linfonodo in diversi piccoli pezzi prima del trasferimento al tubo di omogeneizzazione. Come descritto nell'introduzione, linfonodo tessuti dagli animali più anziani possono essere più fibrosi.
      Nota: Se si desidera un'analisi dual dell'ospite e patogeno RNA, trattamento supplementare (ad esempio di omogeneizzazione della perla) può essere necessaria per il recupero di RNA batterico, soprattutto se gli agenti patogeni Gram-positivi sono presenti nei tessuti.
4. Immediatamente rimuovere il campione omogeneizzato dai tubi e trasferirlo al RNAsi-libera per microcentrifuga (2,0 mL di dimensioni) con una micropipetta P1000.
5. Centrifugare il campione per 5 min a 12.000 x g a 4 ° C per rimuovere eventuali detriti di campione. Utilizzando una punta di una micropipetta P1000, trasferire il surnatante ad un tubo del microcentrifuge fresco, lasciando il pellet.
6. Incubare il surnatante per 5 min a temperatura ambiente. Dividere ogni campione tra due 1.5 microcentrifuga.
7. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio per 1 mL di reagente fenolo-basato (cioè, 0,3 mL per un campione di 1,5 mL); negarlo a mano per 1-2 min a mescolare le fasi, ma non centrifugare il campione. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
8. Si centrifuga per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
9. Rimuovere con cautela la fase superiore, acquosa limpida con una punta di una micropipetta (P1000 o P200) che forma lo strato superiore, senza danneggiarne l'interfase o lo strato di rosso fenolo-cloroformio. Trasferirlo ad un nuovo tubo del microcentrifuge.
10. Mescolare con un volume uguale di etanolo al 100%; mescolare accuratamente capovolgendo la provetta 4 - 5 volte. Il filmato apparirà spesso nuvoloso.
11. Con una punta di micropipetta, trasferire il liquido in una colonna a base di silice commerciale spin, per ulteriormente purificare ed eluire il RNA, seguire istruzioni^{22 del produttore}. Eluire il RNA generato da ~ 50 mg di tessuto in 50-100 µ l di acqua RNAsi-libera.
    Nota: Mentre l'estrazione di reagente fenolo-basato rimuove il DNA nella fase organica, per l'utilizzo a valle del RNA in qRT-PCR e/o RNA-sequenziazione applicazioni, è consigliabile un ulteriore trattamento di campioni di RNA con dnasi.
12. Aliquotare il RNA eluito per separare i tubi per uso in una valutazione di quantificazione e di qualità, per ridurre qualsiasi congelamento-scongelamento del campione di RNA principale. Trasferire le provette a-80 ° C per la conservazione.
13. In caso di linfonodo campioni derivati da animali infettati con agenti patogeni zoonotici, soprattutto a livello di contenimento BSL-3, convalidare il campione di RNA risultante per l'assenza di agenti patogeni se il campione sarà spostato in una zona più bassa del livello di contenimento biosicurezza analisi della qualità, RT-PCR e/o preparazione di RNA-sequenziamento biblioteca.
    Nota: È fondamentale considerare le normative locali, e nel caso gli orientamenti di inattivazione di CDC (Centers for Disease Control and Prevention) per lavoro con selezionati agenti, è necessario convalidare tutte le procedure di inattivazione del ricercatore locale al sito.
    1. Rimuovere il volume di^th di 1/10 di ogni campione di RNA eluiti dal passaggio 4,12 (cioè, 5 µ l da 50 µ l di RNA totale). Usando una tecnica sterile, mescolare il campione con 100 µ l di brodo di crescita batterica in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile. Utilizzando una spatola di plastica sterile, stendere l'impasto di RNA-brodo su tutta la superficie di una piastra di agar.
       Nota: Selezionare una coerente con la crescita dell'agente patogeno con cui gli animali sono stati sfidati per piastra agar e tipo di brodo.
    2. Incubare la piastra di agar sotto condizioni specifiche per la crescita dell'agente patogeno con cui gli animali sono stati sfidati. Verificare l'assenza di batteri recuperati prima di togliere i campioni il contenimento BSL-3.
       Nota: il RNA eluito risultante, dopo test di integrità e quantificazione è adatto per applicazioni a valle, tra cui un RNA-sequenziamento ed analisi di RT-PCR.
14. Valutare il recupero di RNA e purezza utilizzando uno spettrofotometro. Per valutare la qualità di RNA, carico 1-2 µ l di campione, RNA eluito con lo spettrofotometro per un'analisi. Registrare uno spettro del campione nella gamma degli ultravioletti (UV).
    1. Dallo spettro UV, registrare il rapporto di₂₈₀ A₂₆₀/A, il rapporto di₂₃₀ A₂₆₀/A e il valore₂₆₀ per il campione (A = assorbanza).
    2. Come singoli filamenti di RNA ad una concentrazione di 40 µ g/mL ha un'assorbanza di 1.0 a 260 nm, calcolare la concentrazione di RNA (µ g/mL) moltiplicando la A₂₆₀ x 40 per i campioni purificati.
15. Come un metodo rapido di valutazione dell'integrità di RNA, per escludere eventuali campioni degradati da un'ulteriore analisi, mescolare 2 µ l di ciascun campione di RNA con 4 µ l di colorante di 1,5 x formamide caricamento [95% deionizzata formammide, blu di bromofenolo 0.025% (p/v), 0.025% (p/v) xilene cianolo, 5mm EDTA (pH 8.0), 0.025% (p/v) SDS] in 1,5 mL microcentrifuga^23,24.
16. I tubi a 70 ° C per 1 min di calore e quindi trasferire le provette in ghiaccio per 1 min.
17. Caricare i campioni ad un gel di agarosio 1% preparato in 1 x TBE (per una descrizione completa di un elettroforesi del gel dell'agarosi nativo per RNA, vedere Rio, Jr. Ares, Hannon e Nilsen)²⁴. Separare i campioni con i metodi standard del gel di elettroforesi e confermare la presenza di bande di RNA ribosomiale 28S e 18S.
18. Follow-up l'elettroforesi in gel con metodi di analisi quantitativa per la determinazione di integrità di RNA [ad esempio, un'analisi (RNA integrità numero) Bioanalyzer e RIN] come descritto nei Risultati rappresentante e in Mueller, O. et al. ²⁵ e Schroeder, a. et al. ²⁶.

5. metodo di estrazione alternativa da formalina-fisse, paraffina (FFPE) tessuti

Nota: Anche se la conservazione del tessuto FFPE non rappresenta il metodo più affidabile di conservazione di acido nucleico, il protocollo presentato di seguito può essere un modo per studiare alcune modifiche trascrizionali quando non sono disponibili altri tessuti conservati.

1. Preparare i reagenti formalina per la conservazione del tessuto di erogazione formalina in contenitori di plastica. Tessuti dovrebbero essere conservati in formalina con un rapporto di 20:1 formalina: tessuto volume/peso, rispettivamente.
   Attenzione: La formalina è un agente cancerogeno umano conosciuto e anche se non acutamente tossici, l'esposizione cronica (in genere tramite inalazione fumi) può rappresentare un rischio significativo per la salute. Un'adeguata ventilazione e PPE (cioè, l'uso di guanti di nitrile, essere cambiato entro 15 min dopo l'esposizione iniziale) sono necessari per ridurre al minimo i rischi per la salute. Fare riferimento alla formaldeide Standard OSHA (29 CFR 1910.1048) per ulteriori informazioni sull'esposizione di monitoraggio e valutazione dei rischi.
   Nota: Utilizzando troppo poco formalina possa avere un impatto la capacità del tessuto di diventare completamente conservato quando sommerso in conservante.
2. Dopo l'isolamento del tessuto di interesse, tagliandolo accuratamente il tessuto a meno di 5 mm di spessore.
   1. Con attenzione usando il forcipe, immergere il tessuto tagliato in formalina per ridurre al minimo eventuali spruzzi.
      Nota: I tessuti devono essere completamente immersi in formalina per consentire una completa fissazione. È fondamentale che tutte le superfici del tessuto sono completamente coperti con formalina.
3. Una volta che i tessuti sono stati sommersi in formalina, consentono il fissaggio del tessuto si verificano per almeno 24 ore a temperatura ambiente.
   Nota: Formalina penetra i tessuti lentamente, ad un tasso di 1 mm ogni ora da tutte le superfici^27,28. Pertanto, per mantenere lo spessore delle sezioni del tessuto a meno risultati di 5 mm in una rapida fissazione del tessuto intero.
4. Dopo la fissazione, trasferire i tessuti a un reagente appropriato per l'inclusione in paraffina.
   Nota: ad esempio, i tessuti esaminati in questo manoscritto sono stati trasferiti al 70% di etanolo prima l'incorporamento.
5. Incorporare i tessuti in paraffina. ²⁹
6. Sezione del tessuto di 10-80 µm di spessore (uso 10-20 µm se miRNA è desiderato da estrarre)²⁹.
7. Utilizzo di bisturi e pinze, rimuovere un pezzo di tessuto di 40 mg di ogni campione deve essere elaborato e metterlo in una provetta sterile, privo di nucleasi microfuge.
8. Utilizzare un kit commerciale progettato per Sparaffinatura e recupero di acidi nucleici dei campioni di tessuto FFPE per estrarre RNA dai campioni conservati.
   Nota: Il kit a cui fa riferimento la Tabella materiali utilizza xilene ed etanolo lava per rimuovere la paraffina, un passo di trattamento di proteasi e un filtro di fibra di vetro per purificare il RNA.

Risultati

L'uso delle considerazioni presentate in questo articolo (passaggi da 1 a 4 del protocollo) sarà di aiuto nel recupero di RNA da grandi campioni di animali che è adatto per un'analisi a valle in studi di espressione genica di host. La qualità di RNA per applicazioni a valle è valutata di più misure standard. Per spettrofotometria, il rapporto di₂₈₀ A₂₆₀/A fornisce una misura della contaminazione della proteina ed il rapporto di₂₃₀ A₂₆₀/A fornisce un altro mezzo di valutazione d...

Discussione

La maggior parte dei studi di trascrittomica e dei relativi protocolli concentrarsi su campioni umani, mouse, ratto o post mortem. Tuttavia, le indagini in bestiame e animali selvatici forniscono una vasta gamma di opportunità per la caratterizzazione della risposta immune alla malattia, sia come applicabile alla medicina veterinaria e, per quanto riguarda le malattie zoonotiche, per la salute umana. Questo protocollo prevedeva un contorno di considerazioni chiave per l'estrazione di RNA ad alta integrità dai tessuti di ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di conservazione dell'RNA (abbiamo usato RNALater per tutti gli esperimenti)	ThermoFisher	AM7020
Provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 ml o 2 ml.	Fisher Scientific	05-408-129
Bisturi monouso	Daigger Scientific	EF7281
Pinze per tessuti, dente di ratto	Fisher Scientific	12-460-117	Altre pinze per tessuti disponibili, tra cui punta curva, bordo affusolato, ecc., dipende dalle preferenze dell'utente
Aghi per biopsia da 3 mm	Fisher Scientific	NC9949469
Contenitore per oggetti taglienti (piccolo e trasportabile per l'autopsia)	Stericycle	8900SA	1 qt. dimensioni mostrate qui
Taglieri o vassoi usa e getta	Fisher Scientific	09-002-24A	Disponibile in una varietà di dimensioni, dipende dalle preferenze dell'utente
Dispositivi			Varia a seconda dell'agente patogeno (guanti, maschere respiratorie, occhiali, ecc.)
Reagente per l'estrazione dell'RNA a base di fenolo (abbiamo usato il reagente TRIzol per tutti gli esperimenti)	ThermoFisher	15596026
Kit per l'estrazione dell'RNA basato su colonna di silice (abbiamo usato il kit PureLink RNA Mini per tutti gli esperimenti)	ThermoFisher	12183018A	Progettato per un massimo di 100 mg di tessuto
100% etanolo (200 proof per la biologia molecolare)	Sigma-Aldrich	E7023
Omogeneizzatore tissutale con provette di omogeneizzazione chiuse (abbiamo usato il dissociatore gentleMACS per tutti gli esperimenti)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarosio (Generale, per elettroforesi su gel)	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	Può anche fare da zero in laboratorio
Formamide deionizzata	EMD Millipore	S4117
Sodio dodecil solfato	Sigma-Aldrich	L3771
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	114391
Xilene cianolo	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)	Spettrofotometro UV-Vis Sigma-Aldrich	EDS
(abbiamo usato lo spettrofotometro NanoDrop)	ThermoFisher	ND-2000
Dispositivo per la valutazione quantitativa dell'RNA (abbiamo usato il bioanalizzatore, con componenti e protocolli associati)	Agilent	G2939BA
Kit di estrazione dell'RNA FFPE (abbiamo utilizzato il kit di isolamento dell'acido nucleico totale RecoverAll per tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina)	ThermoFisher	AM1975
Spandiconcime in plastica (spandiconcime a forma di L)	Fisher Scientific	14-665-231	Necessario solo per i test di sterilità per campioni di animali infetti
Coltelli per necroscopia	Concetti per il bestiame	WI-0009209