Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

Compattazione del DNA è un evento drammatico citoplasmatico che è stato individuato in alcuni cianobatteri. Quando Synechococcus elongatus è stato coltivato sotto 12 h ogni ciclo luce/buio, DNA è apparso condensata alla fine del periodo di luce, che era chiaramente diverso dalla sua apparizione nel momento punti¹. È stato suggerito che questo processo è controllato da un orologio circadiano basato sul Kai proteine². Seki et al hanno riferito che il DNA colorato con Hoechst 33342 è stato compattato in cellule di S. elongatus verso la fine del periodo di luce e ha mostrato una rod-forma ondulata sotto un microscopio a fluorescenza. Il DNA compattato, poi separato in due al centro dell'asta come la cellula diviso e infine tornò a una normale distribuzione uniforme in ogni cellula figlia³. Tuttavia, la natura transitoria e grandi dimensioni per microscopia elettronica ostacolato analisi strutturale. Murata et al combinato diversi metodi, tra cui cultura sincrono, microscopia a fluorescenza, congelamento rapido e ad alta tensione cryo-tomografia elettronica (cryo-HVET) ed è riuscito a individuare la struttura di compattazione DNA transitoria, compresa la cinetica di polifosfato corpi (PPBs)⁴. Il manoscritto fornisce spiegazione visiva di un materiale così difficile in dettaglio combinando le procedure sperimentali.

S. elongatus ha una forma di capsula, una lunghezza di 2 a 5 µm, una larghezza di circa 0,5 µm e la perfetta compattazione DNA appare in cellule viventi solo per un tempo molto breve. Di conseguenza, i cambiamenti strutturali che si verificano la compattazione DNA cianobatterica erano sconosciuti in dettaglio. Per studiare queste strutture da microscopia elettronica, è necessario superare due principali problemi tecnici. Uno è l'osservazione di un esemplare di spesso del batterio intero al vicino circostanze natali, e l'altro è il fissaggio rapido di una struttura dinamica. Per quanto riguarda il primo problema, il percorso libero medio (iMFP) anelastico di elettroni dipende la tensione accelerare del microscopio elettronico⁵. In un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di 300 kV, è inferiore a 350 nm. Ad esempio, quando un cianobatterio ghiaccio incorporato (esemplare spessore ≈ 600 nm) è osservato a 200kV TEM (≈ iMFP 250 nm), le strutture all'interno delle cellule sono difficili da osservare. Per contro, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) può dare e immagine della struttura citoplasmatica in tutta la cellula (Figura 1). In questo protocollo, come una parte della soluzione, un microscopio elettronico ad alta tensione (HVEM) a una tensione di accelerazione di 1 MV è stato impiegato. Tuttavia, i servizi che implementano HVEM sono limitati in tutto il mondo. Possibili soluzioni alternative inoltre sono discussi nella sezione discussione. Il secondo problema è stato risolto da cryo-microscopia elettronica (cryo-EM). Si tratta di un potente strumento per la visualizzazione dinamica delle strutture a vicino a circostanze natali, dove il campione è congelare rapidamente in etano liquido utilizzando un dispositivo di congelamento rapido, e il momento congelato è osservato direttamente con un minimo di modifiche⁶. Combinando con tomografia, uno snapshot di strutture tridimensionali (3D) può essere ricostruito dalla inclinazione serie⁷. In questo esperimento, compattazione del DNA è stata riprodotta in s. elongatus utilizzando sincrono cultura ciclo di meno di 12 h ogni luce/buio, e la tempistica del congelamento del campione è stata determinata mediante monitoraggio sotto un microscopio a fluorescenza.

Gli approcci descritti qui sono ampiamente applicabili allo studio delle strutture dinamiche in cellule batteriche, ad esempio la divisione cellulare, segregazione del cromosoma ed infezione dei fagi e hanno un potenziale per aprire nuove vie nella ricerca microbiologica.

1. sincrono cultura di cianobatteri

1. S. elongatus PCC 7942 sterilizzato BG 11 piastra (in un piatto di petri in plastica sterile cm 9) contenente 1,5% (p/v) di agar e 0,3% (p/v) di tiosolfato di sodio⁸della coltura.
2. Posizionare le piastre in una camera di crescita a 23 ° C con un'intensità luminosa di 50 µE/m2/s e soggette a cicli di scuro h luce/12 h 12.
3. Trasferire le cellule su piastre di agar BG11 freschi una volta a settimana.
   Nota: Le culture sull'agar verranno visualizzato come bande verdi di cellule attivamente proliferanti dopo una settimana in questa condizione di cultura.
4. Prendere verde ciuffi di cellule con un cappio di filo sterilizzato di fiamma e striscia le cellule su una piastra di agar BG11 fresca. Eseguire questa operazione su un banco pulito.

2. monitoraggio mediante microscopia a fluorescenza

1. Utilizzare cellule coltivate sulla piastra di agar per 6 giorni per osservare la compattazione del DNA. Raccogliere le cellule dal piatto alla fine del periodo di luce da versare 1 mL di soluzione di saccarosio di 0,2 M sopra le cellule. Ripetere l'operazione versando la soluzione sulle cellule in modo che la maggior parte delle cellule sono raccolti. Trasferire la soluzione sospesa-cellula in una provetta micro per la colorazione del DNA.
2. Aggiungere DNA macchiando soluzione colorante (ad es. Hoechst 33342) a 500 µ l della soluzione di sospensione cellulare in un micro tubo ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL. Quindi, mantenere la provetta al buio per 10 min.
3. Centrifugare per 1 min a 2.000 x g di sedimentare le cellule. Scartare il surnatante e aggiungere 10 µ l di soluzione di saccarosio di 0,2 M per ottenere una sospensione cellulare denso.
4. Trasferire 1 µ l di soluzione contengono cellule marcate per un bicchiere di diapositiva, mettere un vetrino coprioggetto e osservare con un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un filtro UV utilizzando un obiettivo con un ingrandimento di 100x e olio da immersione.
5. Confermare che la compattazione del DNA è osservata a questo punto nella maggior parte delle cellule, quindi preparare il campione per il prossimo passo di congelamento.

3. il campione di congelamento per Cryo-HVET

1. Configurare un dispositivo di tuffo-congelamento. Riempire il serbatoio con azoto liquido e avviare il cryo-camera di raffreddamento dopo il collegamento del serbatoio e la camera con un tubo in Teflon.
2. Riempire etano liquido in una pentola di rame piccolo all'interno della camera dopo il raffreddamento della camera alla temperatura dell'azoto liquido. Indossare occhiali durante il funzionamento, perché etano liquido è esplosivo.
3. Bagliore di scarico carbonio-lato di un holey rivestita di carbonio EM griglia (griglia holey) per 30 s a 50 mA utilizzando un bombarder di ioni al plasma.
4. Applicare 1 µ l di BSA oro marcato (15 nm) alla griglia holey come un marcatore fiduciale.
5. Applica un'aliquota di 2,5 µ l di cellule in fase di compattazione del DNA alla griglia holey. Della macchia fuori la soluzione in eccesso con una carta da filtro. Tuffatevi nella griglia etano liquido utilizzando un pistone nel dispositivo congelamento tuffo immediatamente.
6. Memorizzare le griglie congelate in azoto liquido archiviazione fino a quando sono esaminati.

4. Cryo-HVET

1. Impostare il HVEM ad un'alta tensione di 1 MV.
2. Montare la griglia congelata in un supporto di cryo-campione per HVEM preraffreddata a-150 ° C con azoto liquido all'interno della cryo-workstation e caricarlo il HVEM. Fare attenzione a evitare la contaminazione da ghiaccio.
3. Selezionare un'area di imaging a un ingrandimento minore di 1, 000 X. Regolare l'altezza dell'asse z eucentric.
4. Il tavolino a-60 ° di inclinazione e rimuovere il contraccolpo della rotazione inclinazione.
5. Regolare la messa a fuoco nei pressi della località di destinazione ad un ingrandimento di 10, 000 X. Impostare un sotto fuoco di 6 a 10 µm di deviazione dall'immagine messa a fuoco. Per l'imaging, impostare la dose a 2 e^–å^-2 o meno sul campione in anticipo.
6. Misurare la dose di elettroni per la densità di corrente sullo schermo di immagine in HVEM. Prendere un'immagine su una pellicola di elettroni o dalla fotocamera digitale allo stesso ingrandimento come nel processo di messa a fuoco.
7. Raccogliere immagini di inclinazione manualmente con la stessa procedura come in (4,5) da-60 ° a + 60 ° a un incremento di angolo di inclinazione di 2 ° e 4 °.
   Nota: In molti moderni microscopi elettronici, l'acquisizione di tilt series è automatizzato tramite la combinazione di una fotocamera digitale. In tal caso, seguire il manuale di istruzioni. Per le pellicole negative, sviluppare le pellicole per 12 min a 20° C in un serbatoio di sviluppatore utilizzando uno sviluppatore piena forza e difficoltà in un fissatore per 10 min. digitalizzare i film con una risoluzione di 4.000 dpi (0,635 nm/pixel dell'immagine) utilizzando uno scanner piano. Nel caso di una fotocamera digitale, è necessario sottoporre le immagini raccolte direttamente per la successiva fase di elaborazione di immagine. Se necessario, è possibile ridurre le dimensioni dell'immagine di un filtro mediano utilizzando binning (fattore riduzione dimensionale) ed il software adatto (ad es. ImageJ) da due a quattro.

5. tomografica ricostruzione

1. Rendere un file di immagine dello stack dall'individuo inclinare immagini utilizzando il comando "tif2mrc" o "newstack" in IMOD software⁹.
2. Avviare il software eTomo GUI in IMOD e impostare i parametri di immagine: dimensione dei pixel, diametro fiducial, rotazione immagine, ecc. Quindi creare script.
3. Eseguire programmi individuali secondo il software elencato nelle tabelle dei materiali, dove la serie di inclinazione è allineata con marker fiduciali (con un medio errore residuo inferiore a 0,5). Infine, ricostruire un tomogramma 3D utilizzando l'algoritmo SIRT in IMOD.
4. Estrarre una regione di interesse (ROI) dal tomogramma e denoise utilizzando un filtro di denoise: un filtro anisotropico diffusione in IMOD, un filtro bilaterale in EMAN¹⁰o una morfologia matematica filtro¹¹, ecc., con i parametri appropriati per migliorare il contrasto.

6. segmentazione della caratteristica di interesse

Nota: La procedura descritta di seguito è specifica per il software usato (Vedi Materiali tavolo) ma altri pacchetti software possono essere utilizzati invece. Consultare la Guida utente.

1. Nella finestra del visualizzatore 3D, aprire il file tomogramma Amira software e generare un OrthoSlice.
2. Nella finestra dell'Editor di segmentazione, creare un file di segmentazione selezionando un nuovo "campo di etichetta".
3. Manualmente seguite il bordo della caratteristica di interesse (FOI). Seguire la FOI attraverso tutte le sezioni di tomogramma. Per il secondo FOI, creare un nuovo "materiale" e ripetere la stessa operazione.
4. Generare un rendering superficie selezionando il menu "SurfaceGen". Per visualizzare il volume segmentato, selezionare il menu "SurfaceView". Per spostare, ruotare e ingrandire il volume 3D, è possibile utilizzare gli strumenti nella finestra del visualizzatore 3D.
5. Per la segmentazione automatica, utilizzare lo strumento bacchetta magica. Fare clic su un oggetto e regolate i cursori nel Display e mascheratura per coprire l'intervallo di valori in modo che l'oggetto è completamente selezionato per le sue caratteristiche.

In una cultura sincrona precisa ciclo di meno di 12 h ogni luce/buio, DNA etichettato con Hoechst Mostra una distribuzione uniforme normale in condizioni di buio (Figura 2a). Tuttavia, progressivamente compatta all'interno della cellula durante il periodo di luce e appare come una struttura ondulata di rod-like (Figura 2b) alla fine del periodo di luce. Infine, l'asta si divide al centro (frecce in Figura 2C) e sue due parti sono distribuiti in cellule della figlia (figura 2d). Dopo la divisione cellulare, il DNA compattato scomparirà immediatamente, e il DNA restituisce ad una normale distribuzione uniforme.

Quando un'aliquota di cellule che contengono le cellule nella fase finale di compattazione del DNA sono stati immediatamente trasferiti su una griglia holey e rapida congelati in etano liquido, e la griglia congelata è stata osservata da 1 MV cryo-HVEM, le strutture interne dei cianobatteri compreso DNA, strati di membrana tilacoide, pareti cellulari e PPBs, apparve come un'istantanea al momento del congelamento (Figura 3a). Molte cellule hanno mostrato distinti compattazione del DNA nelle cellule (frecce bianche in Figura 3a) e potrebbero essere facilmente distinguibili dalle cellule normali (bianchi punte di freccia in Figura 3b). Alcuni hanno esibito una costrizione al centro delle cellule come previsto prima divisione cellulare (freccia gialla in Figura 3a).

In 3D tomogrammi, principali organelli della cellula possono essere segmentati; parete cellulare, strati di membrana tilacoide, DNA e PPBs potrebbe essere distinto (Figura 4). In particolare, il DNA compattato era separato da uno spazio distinto nel citoplasma dove il DNA era circondato da materiale di bassa densità e gli strati di membrana tilacoide erano distorti lungo l'asta ondulata del DNA compattato. Recentemente è stato osservato un comportamento dinamico del PPBs: nel DNA compattato cellule, molti piccoli PPBs sono stati veduti ad aderire al DNA, mentre essi sono grandi e meno in cellule normali. Inoltre, la maggior parte del PPBs apparve come coppie, e alcuni DNA è sembrato essere in un processo di separazione dal PPBs. Ciò ha suggerito che PPBs essi stessi sono divisi in due dalla duplicazione del DNA e la funzione come i fornitori di fosfato per la sintesi del DNA.

Figura 1. Immagini di cryo-EM di cianobatteri incorporato ghiaccio normale, S. elongatus PCC 7942 alle diverse tensioni di accelerazione. a) 200kV e b) 1000kV. Barra della scala = 500 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Microscopia di fluorescenza delle cellule di S. elongatus cianobatterio. Dopo coltura sincrona cicli di meno di 12 ore ogni luce/buio, le cellule sono state macchiate con Hoechst 33342. (a) cellule dopo 2 h di insorgenza dello stato scuro mostrano etichettatura uniforme di DNA. Il DNA in molte cellule condensato gradualmente durante il periodo di luce. In ultima analisi, formava un asta di ondulato spessore (b) tipico di compattazione del DNA. Dopo questa fase, le strutture di DNA compattate rapidamente divise loro centri (frecce) durante la divisione cellulare (c) e i due frammenti separati in cellule della figlia (d). Le cellule della figlia restituite al contrassegno nuovamente nel periodo scuro uniforme del DNA. Barra della scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: immagine di Cryo-HVEM di cianobatteri incorporato nel ghiaccio amorfo (a) Mostra un'immagine raw a tilt 0 °. Immagini sono state scattate alla fine del periodo di luce. Alcune cellule mostrano ondulato asta-a forma di DNA corpi simili a cromosomi eucariotici condensati (frecce bianche). In cellule normali, i cianobatteri esibiscono una struttura di DNA percepibile all'interno del citoplasma (frecce bianche). Alcuni presentano una costrizione al centro delle cellule come previsto prima divisione cellulare (freccia gialla). (b) xy, xz, yz-fette di un tomogramma 3D. Linee gialle tratteggiate mostrano intersezioni delle fette. Barra della scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: compattato ultrastruttura delle cellule contenenti DNA. I componenti principali sono segmentati: parete cellulare (giallo brillante), membrane tilacoidali (rosse) ed il DNA (blu). (a) Mostra una z-fetta di un tomogramma 3D. (b) tutti i segmenti. La costrizione che indica separazione cellulare appare al centro della cella (freccia). PPBs sono modellate come sfere gialle o arancioni; ogni sfera arancione rappresenta la controparte della sfera gialla più vicina. Barra della scala = 500 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.