Qui, presentiamo un protocollo per illustrare i processi di fabbricazione e gli esperimenti di verifica di un semi-three-dimensional (semi-3D) flusso di messa a fuoco chip microfluidico per formazione di goccioline.
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Articolo metodologico
Generazione di dimensione controllata poli (glicol etilenico) diacrilato goccioline tramite dispositivi microfluidici concentrandosi flusso Semi-3-dimensionale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Goccioline di uniforme e controllabile dalla dimensione poli (glicol etilenico) diacrilato (PEGDA) potrebbero essere prodotta tramite il flusso di processo in un dispositivo microfluidico di messa a fuoco. Questo libro propone un chip microfluidico di flusso-messa a fuoco (semi-3D) semi-three-dimensional per la formazione di goccioline. Il chip di polidimetilsilossano (PDMS) è stato fabbricato utilizzando il metodo di litografia soft multi-strato. Esadecano contenente surfattante è stato usato come la fase continua, e PEGDA con l'ultravioletto (UV) foto-iniziatore era la fase dispersa. Tensioattivi ha permesso la tensione superficiale locale a goccia e formano una punta più a cuspide che promosso a rompersi in piccoli micro-gocce. Come la pressione della fase dispersa era costante, la dimensione delle goccioline è diventato più piccola con l'aumento della pressione di fase continua prima fase dispersa flusso è stato interrotto. Di conseguenza, le goccioline con variazione della dimensione da 1 µm a 80 µm di diametro potrebbero essere realizzate in modo selettivo modificando il rapporto di pressione a due canali di ingresso, e il coefficiente medio di variazione è stato stimato per essere inferiore al 7%. Inoltre, le goccioline potrebbero trasformarsi in microsfere di esposizione ai raggi UV per foto-polimerizzazione. Coniugazione biomolecole su tale superficie di microsfere hanno molte potenziali applicazioni nei campi della biologia e della chimica.
Introduzione
Sistemi microfluidici basati su goccia hanno la capacità di produrre altamente monodispersi goccioline da nanometri a micrometro diametro gamma1 e tenere il grande potenziale in high throughput drug discovery2, sintesi di biomolecole3 ,4e la diagnostica test5. Dovuto i vantaggi unici di goccioline più piccole, come la maggiore area superficiale a rapporto volume e le applicazioni su larga scala con il consumo di pochi microlitri di campione, la tecnologia ha attirato l'interesse di vasta in una vasta gamma di campi. L'emulsificazione dei due liquidi immiscibili è uno dei più tipici metodi per generare delle gocce. Nei rapporti precedenti nel campo, i ricercatori hanno sviluppato una varietà di differenti gocciolina formazione geometrie, tra cui incrocio a t, flusso di messa a fuoco e co-che scorre geometrie. Nella geometria incrocio a t, la fase dispersa è espresso attraverso un canale perpendicolare nel canale principale, in cui la fase continua scorre6,7. Nella tipica bidimensionale (2D) flusso di messa a fuoco8,9 geometria, il flusso di fase dispersa è Tosato da laterale; e per il co-fluente geometria10,11, d'altra parte, un capillare introducendo il flusso di fase dispersa è posto co-assiale all'interno di un capillare più grande per la geometria co-fluente, affinché il flusso di fase dispersa è Tosato da tutte le direzioni.
La dimensione delle gocce è controllata regolando il rapporto della velocità di flusso e la dimensione del canale, e la dimensione minima prodotta da co-che scorre o incrocio a t è limitata a decine di micrometri. Per flusso di messa a fuoco sistema per la formazione di gocce, tre modalità di scioglimento delle gocce formano regolando il rapporto di pressione di due fasi e la concentrazione di tensioattivo, tra cui il gocciolamento regime, il regime di trivellazione a getto e punta-streaming15. Modalità di flusso punta è anche chiamato thread formazione e l'aspetto di un sottile filo disegno fuori dalla punta del cono fase dispersa sarà osservato. Precedenti studi hanno dimostrato le goccioline a meno di pochi micrometri possono essere generati anche se punta-streaming processo in 2D o semi-3D dispositivo di messa a fuoco di flusso8,12. Tuttavia, come una soluzione acquosa contenente una concentrazione molto bassa di PEGDA è stata usata come fase dispersa, il rapporto di restringimento di particelle PEGDA era circa il 60% delle goccioline di diametro originale dopo foto-polimerizzazione, mentre PEGDA senza diluizione come il fase dispersa ha condotto a instabile punta-streaming modalità12. Tensione interfacciale è un parametro importante del processo di emulsione e si riduce a causa dell'aggiunta del tensioattivo nel liquido fase continua, che porta alla diminuzione della dimensione delle gocce, per la frequenza di generazione superiore13, punta molto curva, e prevenire l'instabilità14. Inoltre, quando la concentrazione di tensioattivo di massa è molto superiore la concentrazione micellare critica, la tensione interfacciale è circa invariabile nel saturo stato13 e la modalità di flusso punta può verificarsi15.
Basato su osservazioni di cui sopra, in questa carta, abbiamo sviluppato un approccio facile per la generazione di goccioline PEGDA utilizzando un dispositivo di microfluidica di flusso-messa a fuoco semi-3D, fabbricato dal metodo litografia soft multi-strato. Diverso dal dispositivo di messa a fuoco flusso 2D tipico, il dispositivo di flusso-messa a fuoco semi-3D ha un canale superficiale fase dispersa e una fase di profonda continua, affinché la fase dispersa può essere tosata da su e giù al lato laterale. Questo fornisce più grande gamma di regolazione per la modalità di messa a fuoco flusso riducendo l'energia e la pressione necessaria per rottura della gocciolina. Diversa dalla precedente relazione12, la fase dispersa è puro PEGDAcontaining foto-iniziatore, assicurandosi che il rapporto di restringimento delle particelle PEGDA è inferiore al 10%16; e la fase continua è la miscela di esadecano dissoluzione con una concentrazione di alta massa del tensioattivo non ionico a base di silicone. Goccioline di dimensione-controllabile ed uniforme sono state prodotte modificando il rapporto di pressione di due fasi. Il diametro delle gocce cambia da 80 µm a 1 µm come il disfacimento della gocciolina elabora le modifiche dalla modalità di trivellazione a getto alla modalità di suggerimento-streaming. Inoltre, la particella PEGDA è stata sintetizzata attraverso il processo di foto-polimerizzazione sotto esposizione ai raggi UV. Il sistema di microfluidica di generazione gocciolina con facilità di fabbricazione fornirà più possibilità per applicazioni biologiche.
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Protocollo
1. stampo fabbricazione
- Progettare due maschere fotografiche utilizzando un software di disegno. Descrivono il contorno della struttura microchannel e utilizza due strati separati per maschera 1 e 2 nello stesso file di disegno, così verificare tutte le connessioni tra i diversi canali. Stampare diversi strati in modo indipendente per cromo piastra sul vetro di un fornitore con risoluzione di 1 µm. Garantire che le fotomaschere sono scure con strutture progettate trasparente, come una polarità negativa.
Nota: La maschera 1 contiene il canale di ingresso di fase dispersa e un orifizio. La maschera 2 contiene il canale di ingresso di fase continua, il filtro e la presa. - Nel laboratorio di fotolitografia designato, pulire un wafer di silicio del diametro di 3 pollici. Posizionare la cialda su una macchina a rotazione, applicare il vuoto di apporre la cialda sul mandrino di rotazione. Spin-cappotto 2-3 mL di SU-8 2025 photoresist negativo su wafer per 10 s a 1.000 giri/min, quindi 30 s a 3.000 giri/min, fornendo lo spessore di strato primo di 20 µm.
- Morbido cuocere su una piastra di 95 ° C per 6 min. Dopo il wafer rivestito si raffredda a temperatura ambiente (TA), esporlo tramite la maschera 1 sotto una luce collimata 15 mW/cm2, 365 nm di UV per 18 s. post-esposizione, cuocere su una piastra di 95 ° C per 6 minuti, poi lasciare la cialda raffreddare a RT.
- Ripetere il processo di rivestimento per rotazione. Applicare 2-3 mL di SU-8 2100 photoresist negativo su wafer per 10 s a 1.000 giri/min, quindi 30 s a 2.000 giri/min, fornendo il secondo spessore di strato di 130 µm. Dopo morbido cuocere su una piastra di 95 ° C per 35 min, sistemare la maschera 2 sul secondo photoresist strato per esporre per 30 s, che è stato stato allineato con il livello del canale di fase dispersa da un allineatore UV. Post-esposizione, cuocere su una piastra di 95 ° C per 7 min.
- Sviluppare il wafer mediante immersione in un bagno agitato di 50 mL di acetato di etere di metile glicole propilenico fino a caratteristiche diventano chiare sul wafer, quindi lavano con alcol etilico. Infine, è possibile posizionare la cialda sulla piattaforma termostatica per cuocere per 2 h.
2. semi-3D flusso-messa a fuoco Microfluidic Chip Fabrication
- Monomero di mix PDMS e suo agente indurente in un rapporto di peso leggermente diverso per la parte superiore e gli strati inferiori, in genere 10:1 per lo strato superiore e 8:1 per lo strato inferiore, mediante agitatore automatico unguento per 4 min.
Nota: Le lastre PDMS superiore e inferiore sono preparate in un rapporto leggermente diverso (10:1 e 8:1 rispettivamente) di PDMS base per agente indurente, migliorando la forza di legame. Quando il rapporto 5:1 è scelto per lo strato inferiore, la lastra PDMS inferiore più rigida rende difficile l'allineamento e riduce la forza di incollaggio dovuta alla mancanza di flessibilità. Inoltre, lo spessore della lastra inferiore PDMS è di circa 1 mm per adattare la distanza di lavoro del microscopio. Il chip si deforma facilmente sotto alta pressione quando viene scelto il rapporto di 15:1. - Versare il composto nello stampo silicone completato in una capsula di petri di 90 mm e fornire uno spessore di 2 ~ 3 mm. è posto in una camera a vuoto e degassare fino a far scomparire tutte le bolle d'aria. Curare a 80 ° C per 1 h in un forno.
- Consentire il PDMS raffreddare a RT. uso un bisturi per tagliare il dispositivo almeno 3 mm dalla funzionalità e lentamente staccare lo strato PDMS da wafer di silicio. Un pugno l'ingresso di fase dispersa, l'insenatura di fase continua e l'uscita nello strato superiore PDMS usando un punzone di diametro 0,75 mm.
- Pulire il PDMS con nastro adesivo per rimuovere le particelle di polvere. Al plasma trattare sia in alto e in basso strati PDMS contemporaneamente per 2 min in un plasma W 300 pulitore. Posizionare lo strato superiore sulla superficie di livello inferiore e spingere le superfici relativamente finché caratteristiche sono allineati visualizzazione attraverso un microscopio stereo.
- Curare il dispositivo in un forno a 120 ° C per un giorno aumentare la forza e completare incollaggio.
3. reagenti preparazione
- Preparare la soluzione di fase continua: esadecano sciogliendo 18 vol % tensioattivo non ionico a base di silicone.
- Preparare la soluzione della fase dispersa: idrofilo poli (glicol etilenico) diacrilato (PEGDA, 255 MW,) contenente 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (98%, 224 MW) ad una concentrazione di 5 mg/mL come foto-iniziatore e Rodamina B ( 95%, 479.01 MW) ad una concentrazione di 1 mmol/L come le tinture fluorescenti.
- Riempire i serbatoi di 1 mL di regolatore di pressione pneumatico con la fase continua. Riempire la punta di caricamento di gel 200 µ l con la fase dispersa.
4. sistema preparazione
- Posizionare il dispositivo microfluidico semi-3D sul palco di un microscopio ottico invertito, visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.
- Collegare il tubo di gas fluorurati etilene propilene (FEP) per il foro perforato della fase continua inserendo un corto tubo di acciaio inox, quindi inserire l'estremità di una punta di caricamento del gel il foro perforato della fase dispersa. Inserire una lunghezza di 20 cm di Tubo FEP alla presa nel dispositivo e posizionare l'estremità in una provetta da centrifuga 15 mL.
Nota: La configurazione del sistema è illustrata nella Figura 1.
5. formazione di goccioline
- Collocare il dispositivo sul banco di lavoro di un microscopio invertito e assicurarsi che la giunzione dei diversi canali si trova approssimativamente nella posizione della sorgente luminosa del microscopio. Fuoco il microscopio invertito su un'area che contiene l'intersezione di due fasi, la regione dell'orifizio e il canale a valle.
- Impostare pressioni su due fasi utilizzando controller di pressione pneumatica per fornire fluido lentamente per la regione che si intersecano, con 15 mbar per la fase dispersa e 30 mbar per la fase continua. Attendere 3 minuti per la stabilizzazione e l'equilibratura fino stabile flusso del fluido che trasportano senza bolle e residui PDMS.
- I parametri nell'interfaccia utente del software di controllo di input. Impostare la pressione della fase dispersa come la pressione di base a livello del sistema a una costante, ad esempio, mantenerlo a 45 mbar. Aumentare la pressione della fase continua finché non viene modificata la modalità di rottura di emulsione da getto per la modalità di suggerimento-streaming, quindi attendere 5 min per la stabilizzazione.
- Posizionare l'estremità del tubo di FEP collegare il foro di uscita per la provetta da centrifuga per raccogliere le gocce.
6. PEGDA particelle collezione e caratterizzazione
- Fissare il tubo da centrifuga sbieco dello staffaggio. Quando il flusso di fase liquida al tubo per ottenere le particelle PEGDA attraverso la solidificazione rapida esposizione ai raggi UV.
- Quando terminato il processo di raccolta, gustare e osservare le particelle PEGDA attraverso il microscopio a fluorescenza con X 20 o 60 X oggetti rispettivamente.
Nota. Le immagini fluorescenti digitale catturate dalla fotocamera vengono analizzati da una routine di software su misura. L'immagine è primo deconvoluzione basato sul R-L algoritmo17 per eliminare l'effetto sfocatura della luce fuori-di-messa a fuoco e la sfera di oggetti nell'immagine vengono estratti in base al metodo di rilevamento di Canny edge; Infine, il diametro di ciascun oggetto sfera può essere calcolato utilizzando Hough trasformazione18. Di conseguenza, media e deviazione standard dei diametri degli oggetti sfera in ogni immagine può essere stimati.
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Risultati
Il chip microfluidici flusso-messa a fuoco semi-3D è stato fabbricato utilizzando tecniche di litografia soft multistrato come descritto sopra. Il processo di fabbricazione e risultati per stampo master in protocolare illustrato nella Figura 2. Il primo strato, che fornisce un canale largo 65 µm per introdurre la fase dispersa e un 50 µm ampio orifizio (Figura 2a), è di 20 µm di spessore. Uno strato di spessore o...
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Discussione
La generazione di goccioline in modalità flusso-messa a fuoco utilizzando il dispositivo microfluidico semi-3D e 2D in precedenza è stata sviluppata in una varietà di rapporti8,9,15,19,20, 21. In questi sistemi, il liquido acquoso che potrebbe non essere solidificato è stato scelto come fase dispersa, come acqua deionizzata<...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla ricerca fondamentale Shenzhen finanziamenti (Grant No. JCYJ 20150630170146829, JCYJ20160531195439665 e JCYJ20160317152359560). Gli autori vorrei ringraziare la Prof. ssa Y. Chen alla Shenzhen istituti di tecnologia avanzata, Accademia cinese delle scienze per supporti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Wafer di silicio | Huashi Co., Ltd | ||
| SU-8 2025, 2100 | Microchem Co. | ||
| sviluppatore SU-8 | Microchem Co. | ||
| Maschera al cromo | Qingyi Precision Mask Making Co., Ltd | ||
| polidimetilsilossano (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| poli(glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) | Sigma | 26570-48-9 | |
| 2-idrossi-40-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone | TCI | H1361-5G | fotoiniziatore |
| Esadecano | Sigma | 544-76-3 | |
| ABIL EM 90 | CHT | 144243-53-8 | tensioattivi |
| Rodamina B | Aladdin | 81-88-9 | colorante fluorescente |
| Spin Coater | |||
| Macchina per litografia Agitatore | |||
| automatico per unguento | Thinky | ARV-310 | |
| Forno | BluePard | ||
| Microscopio ottico | OLYMPUS | IX71 | |
| Fotocamera ad alta velocità | Hamamatsu, Giappone | ORCA-flash | |
| MAESFLO Sistema di controllo dei fluidi microfluidici | FLUIGENT | MFCS-EZ | |
| Lampada UV | FUTANSI | 365 nm Luce UV, 8000 MW/CM2 |
Riferimenti
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