Articolo metodologico

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

DOI:

10.3791/57202

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30 aprile 2018

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1Molecular, Cellular, and Developmental Biology Program, The Ohio State University, 2Department of Biological Chemistry and Pharmacology, The Ohio State University, 3Biogen

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un approccio fluido pressurizzato, fisiologicamente rilevante per induzione rapida e reversibile di varicosità in neuroni.

Abstract

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Varicosities axonal sono allargate strutture lungo i fasci di assoni con un elevato grado di eterogeneità. Sono presenti non solo nei cervelli con malattie neurodegenerative o lesioni, ma anche nel cervello normale. Qui, descriviamo un sistema di nuova costituzione micromeccanici per in modo rapido, affidabile ed reversibilmente indurre varicosities axonal, permettendoci di comprendere i meccanismi che regolano la formazione del varicosity e la proteina eterogenea composizione. Questo sistema rappresenta un mezzo romanzo per valutare gli effetti dello sforzo di compressione e taglio su diversi compartimenti cellulari dei neuroni, diversi da altri sistemi in vitro che si concentrano principalmente sull'effetto di stretching. Cosa importante, a causa delle caratteristiche uniche del nostro sistema, abbiamo recentemente effettuato una scoperta di nuovi risultati che l'applicazione del fluido pressurizzato può indurre rapidamente e reversibilmente varicosities axonal attraverso l'attivazione di un canale potenziale transitorio del ricevitore. Il nostro sistema biomeccanico può essere utilizzato comodamente in combinazione con aspersione di droga, live cell imaging, imaging del calcio e registrazione di patch clamp. Pertanto, questo metodo può essere adottato per lo studio di canali ionici meccanosensibili, regolamento di trasporto assonale, dinamica del citoscheletro assonale, segnalazione calcio e cambiamenti morfologici correlati a traumatico cranico.

Introduzione

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Formazione del varicosity, o gonfiore/bordatura, lungo gli assoni, è una caratteristica prominente di neurodegenerazione osservata in molti disturbi o lesioni del sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e traumatica brain injury1,2. Nonostante gli impatti fisiologici significativi dei varicosities axonal sulla propagazione del potenziale d'azione e trasmissione sinaptica3, come vengono generati i varicosities rimane sconosciuto. Recentemente, usando un'analisi di nuova costituzione microbiomechanical su colture di neuroni ippocampal....

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Ohio State University.

1. preparazione vetrino coprioggetto

  1. Inserire una o più caselle di lamelle di 12 mm o 25 mm in un becher di vetro contenente acido nitrico al 70% e incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per una notte.
    Nota: Non lavare i coprioggetti 25mm nel becher stesso come le lamelle di 12 mm. Si consiglia di lavarli separatamente.
  2. Trasferire tutti i vetrini coprioggetti in un becher di 4L riempito con 2,5 L di ddH2O e scuotere il becher contenente i coprioggetti pe....

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Risultati

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Prima sbuffando, assoni normalmente mostrano poca formazione di varici. Seguente sbuffando con la nostra pressione standard (190 mmH2O altezza), l'inizio di assoni di sviluppare molti tallone-come varicosità. La formazione di varicosità è parzialmente reversibile, come mostrato dalle regioni dell'assone tornando al loro stato pre-soffiato in seguito a un periodo di recupero di 10 min (Figura 2A-B). Dopo un periodo di recupero più l.......

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Discussione

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La procedura di questo test di microbiomechanical è dritto in avanti. Esso produrrà risultati affidabili, se tutti i suoi passaggi sono eseguiti con attenzione. Ci sono diversi passaggi chiave che, se correttamente eseguita, ostacolerà la raccolta dei dati di successo. I passaggi critici cominciano a monte dell'effettiva applicazione dello stimolo puffing. La dissezione attenta, coltura e cura della cultura primaria del neurone sono di primaria importanza. Se i neuroni coltivati non sono sani, non reagiranno in modo coer.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con gli istituti nazionali di salute animale uso orientamenti. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) a C. Gu.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetrini coprioggetti da 12 mm Strumenti Warner 64-0702per piastra a 24 pozzetti 
Vetrini coprioggetti da 25 mm Fisher Scientific 12-545-102 per piastra a 6 pozzetti 
Acido aceticoFisher ScientificA38-212
Poli-D-lisinaSigma P6407
Collagene coda di ratto Roche 11 179 179 001 
10X PBS Diagnostica nazionale CL-253
Na2SO4Fisher Scientific S373-500
K2SO4Fisher Scientific P304-500
HEPES Fisher Scientific BP410-500
D-glucosio Fisher Scientific D16-500
MgCl2Fisher Scientific BP214-500
NaOHFisher Scientific SS255-1
Enzima proteasiSigma P4032
FBS Gibco 26140
Piruvato di sodio Gibco 11360-070
L-glutammina Gibco 
Penicillina/Streptomicina 100x (P/S)Gibco 
MEM I sali di EarleGibco 11090
Supplemento B27Gibco 17504-044
NeurobasaleGibco 21103-049
Arabinosilcitosina (Ara-C)Sigma 147-94-4
Supporti Opti-MEM Gibco 31985-070
Lipofectamina 2000Invitrogen 1854313reagente di trasfezione 
Barre in borosilicato World Precision Instruments Inc.PG52151-4per pipetta a soffio 
tubi di gomma Fisher Scientific 14-169-1A
Siringa e stantuffo in plastica da 10 ccBecton Dickinson
micromanipolatore Strumenti Sutter 
NaCl Fisher Scientific S640-3
KCl Fisher Scientific BP366-500
CaCl2Fisher Scientific C70-500
Piatto per colture cellulari (35 mm x 10 mm)Corning 3294
Fluo-4 AMSonde molecolariF14201per imaging del calcio 
Costrutto Mito-YFP Takara Bio Inc.per trasfezione cellulare 
Costrutto YFP-N1Takara Bio Inc.per trasfezione cellulare 
Modello P-1000 Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone Strumenti Sutter 
Mcroscopio Eclipse TE2000-U Obiettivo Nikon
Plan Fluor ELWD 20x   Nikon062933obiettivo 
Lente ad olio Apo TIRF 100x/1.49NikonMRD01991obiettivo 
2503008115140122

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
  2. Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration....

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Axonal VaricositiesPressurized Fluid SystemMechanical StressNeuron AxonsMicromanipulator TechniqueCalcium ImagingPatch Clamp RecordingTraumatic Brain InjuryMechanosensitive Ion ChannelsAxonal Cytoskeleton

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