Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.
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Articolo metodologico
Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
I pazienti con la sindrome di Sjögren, una malattia autoimmune che interessa le ghiandole esocrine, sviluppano l'infiammazione della ghiandola salivaria e hanno ridotto la produzione di saliva. Analogamente, la produzione di saliva è gravemente compromesso in pazienti che ricevono radioterapia per i tumori testa e collo. Modelli del roditore, sviluppati per simulare queste condizioni cliniche, facilitano la comprensione della patogenesi della malattia e consentono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Pertanto, la capacità di accurata, riproducibile e ripetutamente misurare la funzione della ghiandola salivaria in modelli animali è fondamentale. Sulla base di procedure precedentemente descritte in letteratura, è stato sviluppato un metodo che soddisfa questi criteri ed è stato usato per valutare la funzione della ghiandola salivaria in topi. Un ulteriore vantaggio di questo nuovo metodo è che è facilmente imparato e ha poca variazione inter-operatore. Funzione della ghiandola salivaria è valutata come la quantità (peso o volume) o velocità (mL/min) di saliva prodotta in risposta alla stimolazione di pilocarpina. La saliva raccolta è una buona fonte per le analisi del contenuto proteico, le concentrazioni nell'immunoglobulina e altre biomolecole.
Introduzione
Le ghiandole salivari producono la saliva in risposta ad una varietà di stimoli neurologici e meccaniche1. Gli stimoli sono trasportati attraverso il sistema nervoso simpatico e parasimpatico ai recettori adrenergici e colinergici nella ghiandola. Pilocarpina è un agente colinergico, para-simpaticomimetici che agisce prevalentemente sui recettori muscarinici. Nella ghiandola salivaria, induce la produzione di saliva, agendo sui recettori muscarinici M31. Produzione di saliva dopo somministrazione di Pilocarpina è un indicatore della capacità di rispondere alla stimolazione delle ghiandole salivarie ed è comunemente usata come misura della funzione della ghiandola salivaria.
Misurazione precisa della produzione di saliva è fondamentale nello studio delle malattie della ghiandola salivare, tra cui la sindrome di Sjögren2 e ferita di radiazione che segue la testa e del collo cancro trattamento3. Diversi metodi sono stati sviluppati per misurare la produzione di saliva nei roditori. Questi includono diretto inserimento di una canula del dotto escretore salivario4, la raccolta di saliva dalla cavità orale sotto vuoto5e insieme utilizzando vetro capillari6 o una micropipetta7,8, 9. dirigere l'incannulamento del dotto salivare fornisce saliva più accurata e pura. Tuttavia, questa è una procedura tecnicamente impegnativa e il potenziale per causare lesioni ductal preclude collezioni ripetitivo saliva dall'animale stesso. Raccolta della saliva sotto vuoto può portare a risultati variabili dovuto essiccamento della saliva dal tubo. Questa perdita è esagerata ulteriormente in topi con ridotta salivazione. Tubi capillari in vetro permettono la raccolta di saliva per analisi successive, tuttavia, cambiamenti nella viscosità della saliva secreta nello stato malato previene efficiente riempimento del capillare. Inoltre, tentativi di spazzare la cavità orale per raccogliere i residui della saliva possono provocare lesioni. Il metodo di dispensare consente per la collezione completa, e per lo stesso operatore, è notevolmente coerente tra esperimenti. Tuttavia, per ragioni sconosciute, questo metodo Mostra una variazione significativa tra operatori diversi. Pertanto, per consentire paragoni adeguati, diventa imperativo che l'operatore stesso esegue tutti gli esperimenti relazionati a un progetto specifico. Chiaramente, questo rappresenta un grande svantaggio per un laboratorio.
Per superare questi problemi, è stata sviluppata una procedura che combina saliva raccolta metodi usati per gli esseri umani e roditori. Il metodo tampone, descritto di seguito per misurare il volume di saliva indotti da pilocarpina è semplice, riproducibile, non influenzato da parte dell'operatore e può essere eseguito più volte nello stesso animale. Inoltre, permette la raccolta di saliva per successive analisi di proteine, immunoglobuline o altre biomolecole.
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Protocollo
Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale e segue gli orientamenti etici stabiliti dal National Institutes of Health. Tutti i dati presentati in questo rapporto sono stati generati utilizzando topi femminili che erano 10-12 settimane di età. Sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topi: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Tutti i topi sono stati alloggiati in gabbie di barriera (5 animali per gabbia) in condizioni da organismi patogeni specifiche e forniti di mangime e acqua ad libitum.
1. preparazione
- Per preparare una soluzione di cloridrato di pilocarpine, pesare 10 mg del composto e dissolverlo in 1,776 mL di soluzione salina isotonica sterile nel Vortex, per dare una soluzione stock di 5,63 mg/mL. Non c'è nessuna necessità di sterilizzare questa soluzione. Ma se lo si desidera, filtrare attraverso un filtro da 0,2 µM. Conservare questa soluzione madre in diverse aliquote in un congelatore-80 oC per fino a 3 mesi. Ogni azione congelate è per uso singolo. Una volta scongelato, non ricongelare la soluzione pilocarpina.
- Prendere 0,6 mL microfuge tubi e attentamente un pugno un piccolo foro nella parte inferiore di ogni tubo con un ago calibro 18 riscaldato. Impostare questi tubi in provette da 2 mL. I tubi non devono essere sterili.
- Utilizzando una lama di rasoio affilata, sterile, taglio cilindrici tamponcini assorbenti in pezzi di circa 2 cm di lunghezza. Tagliare ogni pezzo di 2 cm in diagonale per dare 2 tamponi a forma conici. Inserire un tampone in ciascuna delle provette microfuge 0,6 mL.
- Pesare il tubo di microfuge 0,6 mL contenente il tampone asciutto.
- Trasferire i topi da studiare in una nuova gabbia pulita con bottiglie d'acqua. Tenere i topi senza cibo per almeno 2 h prima dell'inizio della raccolta della saliva per impedire la contaminazione di saliva raccolta le particelle di cibo.
Nota: Non è necessario mantenere 1 mouse per gabbia per questa procedura. Tuttavia, il numero dei topi collocati in ogni gabbia dipende dell'istituzione specifiche norme e regolamenti per uso animale. - Poco prima della fine di 2 h, preparare la soluzione di lavoro pilocarpina (0,0563 mg/mL) diluendo la soluzione di riserva 100 x in soluzione fisiologica sterile. Non è necessario filtrare ulteriormente sterilizzare questa soluzione. Tenere sempre la soluzione di Pilocarpina lavoro sul ghiaccio.
Nota: La tabella 1 fornisce la quantità di Pilocarpina deve essere iniettato per una gamma di pesi corporei del mouse per dare una dose finale di 0,375 mg/kg di peso corporeo.
2. la procedura
- Pesare ogni mouse e determinare la dose di anestetico mix per ogni mouse utilizzando la tabella 1. Iniettare il primo mouse con il volume appropriato della miscela anestetica per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min (la maggior parte dei ceppi murini testati in questo protocollo andare a dormire da 2 min). Assicurarsi che il mouse è adeguatamente anestetizzato dalla mancanza di camminare quando appoggiata su una superficie piana. Se il mouse è ancora a piedi, attendere per ulteriori 2 min prima di procedere al passaggio successivo. Applicare una goccia di lubrificante unguento oftalmico in entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione.
Nota: Nella tabella 1, la dose della miscela anestetica è peso corporeo 0,007 mL/g. La gamma ottimale per questa procedura è 0,006 a 0,008 mL/g di peso corporeo. Tuttavia, dopo 4 min, se il mouse è ancora a piedi o che esibiscono i movimenti a scatti, consultare il veterinario istituzionale per aumentare opportunamente la dose di anestetico. - Determinare la dose di Pilocarpina per il mouse utilizzando la tabella 1 e iniettare la giusta quantità per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min e inserire il tubo di guida 50 mL il mouse fino a quando la testa e le orecchie bastone fuori alla fine taglio. Posizionare il tubo ad un angolo di 45 gradi, con la testa in giù e la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Nastro il tubo alla scheda procedura per impediscono di muoversi.
Nota: La tabella 1 fornisce il dosaggio per topi più di 17 g, come questa procedura non è stata tentata su topi pesatura sotto 17 g. - Alla fine di 2 min, delicatamente inserire un paio di micro forcipe di dissezione in bocca chiusi e sollevare la mascella inferiore verso l'alto per aprire la bocca. Spingere il forcipe 1-2mm ulteriormente nella bocca, assicurandosi che la linguetta è visto che riposa sul braccio superiore della pinza. Con un altro paio di una pinzetta, tenere il tampone asciutto pre-pesato vicino alla sua punta conica.
- Far scorrere delicatamente la punta conica del tampone in bocca. Ritirare il forcipe, lasciando la punta del tampone nella cavità orale.
- Afferrare l'estremità più larga del tampone che si estende di fuori della bocca e ruotarlo per consentire la massima superficie di contatto con la bocca. Tenere il tampone in questa posizione per 15 min.
Nota: Questo assicura che il tampone rimane in bocca per tutta la durata della raccolta. Nota che la punta conica del tampone funge da uno stoppino e la parte più ampia del tampone rimane fuori della bocca. - Alla fine di 15 min, delicatamente ruotare il tampone per raccogliere qualsiasi saliva che non è stata assorbita e inserire il tampone bagnato nel tubo microfuge 0,6 mL. Tappare la provetta e impostarlo nel tubo 2ml posizionato su ghiaccio.
Nota: In questo momento, la mucosa orale apparirà completamente asciutto. Il mouse può ora essere spostato indietro nella sua gabbia per il recupero dall'anestesia. - Trasferire il mouse nella gabbia. Posto inumidito pellet cibo nella gabbia dopo il prelievo della saliva per aiutare più veloce reidratazione.
Nota: I topi si sveglia entro 10 min dopo la fine della raccolta. L'iniezione sottocutanea di 0,2 mL di soluzione salina isotonica pre-riscaldato può anche essere somministrato per accelerare il recupero. - Procedere al prossimo mouse. Tutti i topi devono essere monitorati fino a quando completamente hanno recuperato e sono ambulatoria.
3. misurazioni
- Alla fine di tutte le collezioni, pesare i tubi di 0,6 mL con il tampone bagnato. Calcolare la differenza tra il peso bagnato e il peso a secco per ottenere il peso della saliva prodotta. Posizionare il tubo di 0,6 mL con la saliva nuovamente dentro il tubo di 2 mL.
- Tagliare i tappi delle provette 2 ml. Quindi, centrifugare le provette 2 mL per 2 min a 7500 x g, a 4oC in una centrifuga micro per recuperare la saliva. Misurare il volume di saliva ottenuto utilizzando una micropipetta.
- Esprimere i risultati come saliva peso (mg)10 oltre 15 min o come un rapporto tra peso saliva (mg) / mouse peso corporeo (g).
Nota: Se il volume di saliva estratta fuori il tampone è stato misurato, esprimere i risultati come il volume di saliva recuperato (mL) o il rapporto di saliva volume (mL) / mouse peso corporeo (g).
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Risultati
Nei sistemi modello sperimentale del topo, la capacità di produrre saliva in risposta alla stimolazione di Pilocarpina è usata come un indicatore della funzione della ghiandola salivaria. La produzione di saliva è stata misurata in 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 il metodo tampone. In Figura 1A, i risultati sono espressi come la quantità di saliva (mg) raccolta seguendo le dosi aumentanti di pilocarpina. Alla dose di 1 mg/kg di peso corporeo, alcun...
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Discussione
La produzione di saliva è un processo complesso ed è influenzata da molti fattori. Di conseguenza, la funzione della ghiandola salivaria in animali da laboratorio di misura può essere una sfida. Un'ulteriore sfida è che le misurazioni ripetute della funzione della ghiandola salivaria nello stesso animale sono necessari per stabilire l'inizio della malattia o per dimostrare il recupero dopo il trattamento.
Il metodo tampone descritto in questo rapporto è tecnicamente semplice da eseguire con di...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal National Institutes of Health, National Institute of Dental e Craniofacial Research (DE025030).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche per la raccolta della saliva | |||
| Pilocarpina cloridrato | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Diluire in soluzione salina isotonica sterile. Conservare le aliquote monouso di 100X a -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL di ketamina cloridrato + 0,5 mL di xilazina + 8,5 mL di soluzione salina isotonica sterile in una fiala sterile. Può essere utilizzato per 3 mesi. | ||
| Zetamina (ketamina cloridrato) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock è 100 mg/mL |
| Anased (xilazina) | Med-Vet International, Mettawa, IL, | USA RXANASED-20 | Stock è 20 mg/mL |
| Soluzione salina isotonica sterile | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Usato come diluente |
| Lacrime artificiali (lubrificante unguento oftalmico) | Henry Schien, Dublino, OH, USA | 48272 | Utilizzato per prevenire la secchezza degli occhi durante la procedura |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Materiali per la raccolta della saliva | |||
| SalivaBio Tampone per bambini | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Tamponi confezionati singolarmente Provette |
| in polipropilene da 50 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Tagliare il fondo di 1 cm della provetta. Assicurarsi che il bordo tagliato sia liscio. |
| Provette per microcentrifuga 0,6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Praticare dei fori sul fondo della provetta con aghi riscaldati da 18 gauge |
| Provette per microcentrifuga 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Siringhe per insulina con aghi fissati in modo permanente | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| aghi smussati regolari calibro 18 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Lama per bisturi sterile #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Pinze per microdissezione | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Punta angolare seghettata da 0,8 mm, lunghezza 4" |
| Nastro per etichette | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| Timer a 3 | canali Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Bilancia analitica | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| strong>Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Sostanze chimiche/ reagenti per indurre disfunzione salivare | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Sciogliere in acqua priva di endotossine e conservare la soluzione madre a 5 mg/mL . diluire in HBSS sterile 100 ug/mL - iniettare 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adiuvante | Thermo Scientific | 77161 | Diluire 1:1 in soluzione fisiologica sterile. Iniettare per via intraperitoneale 0,1 mL/topo |
| Antisiero anti-Ro52 di coniglio | Generato in laboratorio | Immunizzazione di conigli con topo ricombinante Ro52 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Chemicals/ Kit per analisi della saliva | |||
| Stima del lisozima salivare | |||
| EnzChek Lysozyme Assay | Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Utilizzato secondo le istruzioni del produttore |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Stima delle IgA salivari mediante ELISA a sandwich | |||
| IgA di topo | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standard per ELISA a sandwich - intervallo da 30 ng/mL a 0,5 ng/mL IgA |
| anti-topo di capra non marcato | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Rivestimento a 1 ug/mL in tampone di bicarbonato |
| IgA anti-topo di capra HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Anticorpo di rilevamento utilizzato a diluizione 1:4000 |
| Substrato TMB | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Utilizzato secondo le istruzioni del produttore |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 piastre a pozzetti | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855< | |
| strong>Nome | Azienda | Numero catalogo | Comments |
| Stima delle proteine salivari | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad | , Hercules, CA, USA | 5000006 | Per la stima delle proteine secondo le istruzioni del produttore |
Riferimenti
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