Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Sommario

Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.

Abstract

I pazienti con la sindrome di Sjögren, una malattia autoimmune che interessa le ghiandole esocrine, sviluppano l'infiammazione della ghiandola salivaria e hanno ridotto la produzione di saliva. Analogamente, la produzione di saliva è gravemente compromesso in pazienti che ricevono radioterapia per i tumori testa e collo. Modelli del roditore, sviluppati per simulare queste condizioni cliniche, facilitano la comprensione della patogenesi della malattia e consentono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Pertanto, la capacità di accurata, riproducibile e ripetutamente misurare la funzione della ghiandola salivaria in modelli animali è fondamentale. Sulla base di procedure precedentemente descritte in letteratura, è stato sviluppato un metodo che soddisfa questi criteri ed è stato usato per valutare la funzione della ghiandola salivaria in topi. Un ulteriore vantaggio di questo nuovo metodo è che è facilmente imparato e ha poca variazione inter-operatore. Funzione della ghiandola salivaria è valutata come la quantità (peso o volume) o velocità (mL/min) di saliva prodotta in risposta alla stimolazione di pilocarpina. La saliva raccolta è una buona fonte per le analisi del contenuto proteico, le concentrazioni nell'immunoglobulina e altre biomolecole.

Introduzione

Le ghiandole salivari producono la saliva in risposta ad una varietà di stimoli neurologici e meccaniche¹. Gli stimoli sono trasportati attraverso il sistema nervoso simpatico e parasimpatico ai recettori adrenergici e colinergici nella ghiandola. Pilocarpina è un agente colinergico, para-simpaticomimetici che agisce prevalentemente sui recettori muscarinici. Nella ghiandola salivaria, induce la produzione di saliva, agendo sui recettori muscarinici M3¹. Produzione di saliva dopo somministrazione di Pilocarpina è un indicatore della capacità di rispondere alla stimolazione delle ghiandole salivarie ed è comunemente usata....

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale e segue gli orientamenti etici stabiliti dal National Institutes of Health. Tutti i dati presentati in questo rapporto sono stati generati utilizzando topi femminili che erano 10-12 settimane di età. Sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topi: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Tutti i topi sono stati alloggiati in gabbie di barriera (5 animali per gabbia) in condizioni da organismi patogeni specifiche e forniti di mangime e acqua ad libitum.

1. preparazione

1. Per preparare una soluzione di cloridrato di pilocarpin....

Risultati

Nei sistemi modello sperimentale del topo, la capacità di produrre saliva in risposta alla stimolazione di Pilocarpina è usata come un indicatore della funzione della ghiandola salivaria. La produzione di saliva è stata misurata in 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 il metodo tampone. In Figura 1A, i risultati sono espressi come la quantità di saliva (mg) raccolta seguendo le dosi aumentanti di pilocarpina. Alla dose di 1 mg/kg di peso corporeo, alcun.......

Discussione

La produzione di saliva è un processo complesso ed è influenzata da molti fattori. Di conseguenza, la funzione della ghiandola salivaria in animali da laboratorio di misura può essere una sfida. Un'ulteriore sfida è che le misurazioni ripetute della funzione della ghiandola salivaria nello stesso animale sono necessari per stabilire l'inizio della malattia o per dimostrare il recupero dopo il trattamento.

Il metodo tampone descritto in questo rapporto è tecnicamente semplice da eseguire con di.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sostanze chimiche per la raccolta della saliva
Pilocarpina cloridrato	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	B21410	Diluire in soluzione salina isotonica sterile. Conservare le aliquote monouso di 100X a -80oC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Mix solution			Mix 1 mL di ketamina cloridrato + 0,5 mL di xilazina + 8,5 mL di soluzione salina isotonica sterile in una fiala sterile. Può essere utilizzato per 3 mesi.
Zetamina (ketamina cloridrato)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	Stock è 100 mg/mL
Anased (xilazina)	Med-Vet International, Mettawa, IL,	USA RXANASED-20	Stock è 20 mg/mL
Soluzione salina isotonica sterile	Vet One, Boise, Idaho, USA	501032	Usato come diluente
Lacrime artificiali (lubrificante unguento oftalmico)	Henry Schien, Dublino, OH, USA	48272	Utilizzato per prevenire la secchezza degli occhi durante la procedura
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Materiali per la raccolta della saliva
SalivaBio Tampone per bambini	Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA	N/A	Tamponi confezionati singolarmente Provette
in polipropilene da 50 mL	VWR, Radnor, PA, USA	89004-364	Tagliare il fondo di 1 cm della provetta. Assicurarsi che il bordo tagliato sia liscio.
Provette per microcentrifuga 0,6 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-290	Praticare dei fori sul fondo della provetta con aghi riscaldati da 18 gauge
Provette per microcentrifuga 2 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-298
Siringhe per insulina con aghi fissati in modo permanente	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	324702
aghi smussati regolari calibro 18	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	305195
Lama per bisturi sterile #11	Integra York Inc PA, USA	4-311
Pinze per microdissezione	Roboz, Gaithersburg, MD, USA	RS-5139	Punta angolare seghettata da 0,8 mm, lunghezza 4"
Nastro per etichette	Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA	sc-224487
Timer a 3	canali Amazon.com, Seattle, WA, USA	B06W2KCYVN
Bilancia analitica	Mettler Toledo, Columbus OH, USA
strong>Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Sostanze chimiche/ reagenti per indurre disfunzione salivare
LPS	Invivogen, San Deigo, CA, USA	tlrl-b5lps	Sciogliere in acqua priva di endotossine e conservare la soluzione madre a 5 mg/mL . diluire in HBSS sterile 100 ug/mL - iniettare 100 uL/ moue ip
Imject Alum adiuvante	Thermo Scientific	77161	Diluire 1:1 in soluzione fisiologica sterile. Iniettare per via intraperitoneale 0,1 mL/topo
Antisiero anti-Ro52 di coniglio	Generato in laboratorio		Immunizzazione di conigli con topo ricombinante Ro52
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Chemicals/ Kit per analisi della saliva
Stima del lisozima salivare
EnzChek Lysozyme Assay	Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA	E-22013	Utilizzato secondo le istruzioni del produttore
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Stima delle IgA salivari mediante ELISA a sandwich
IgA di topo	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	0106-01	Standard per ELISA a sandwich - intervallo da 30 ng/mL a 0,5 ng/mL IgA
anti-topo di capra non marcato	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-01	Rivestimento a 1 ug/mL in tampone di bicarbonato
IgA anti-topo di capra HRP	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-05	Anticorpo di rilevamento utilizzato a diluizione 1:4000
Substrato TMB	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	555214	Utilizzato secondo le istruzioni del produttore
Immulon 4HBX Microtiter 96 piastre a pozzetti	Thermo Scientific, Rochester, NY, USA	3855<
strong>Nome	Azienda	Numero catalogo	Comments
Stima delle proteine salivari
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad	, Hercules, CA, USA	5000006	Per la stima delle proteine secondo le istruzioni del produttore

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