Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca2 +-imaging e degranulazione saggi

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e coltivare mastociti peritoneali murini. Inoltre descriviamo due protocolli per la loro caratterizzazione funzionale: un imaging fluorescente della concentrazione intracellulare di gratuito Ca^{2 +} e un test di degranulazione basata sulla quantificazione colorimetrica della β-esosaminidasi rilasciato.

Abstract

Mastociti (MCs), come parte del sistema immunitario, gioca un ruolo chiave nella difesa ospite contro parecchi agenti patogeni e nell'inizio della risposta immunitaria allergica. L'attivazione di MCs via il cross-linking di superficie IgE associato al recettore ad alta affinità IgE (FcεRI), così come attraverso la stimolazione di parecchi altri ricevitori, avvia l'aumento del libero intracellulare Ca^{2 +} livello ([Ca^{2 +}]_i) che promuove il rilascio di mediatori infiammatori e allergici. L'identificazione dei costituenti molecolari coinvolti in queste vie di segnalazione è fondamentale per la comprensione del regolamento della funzione di MC. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento di tipo murino tessuto connettivo MCs di lavaggio peritoneale e coltivazione di MCs peritoneale (PMC). Culture di MCs da vari modelli di mouse di knockout di questa metodologia rappresentano un approccio utile per l'identificazione delle proteine coinvolte nella MC vie di segnalazione. Inoltre, abbiamo anche descrivere un protocollo per singola cella Fura-2 di imaging, come un'importante tecnica per la quantificazione di Ca^{2 +} segnalazione al MCs. fluorescenza-basata monitoraggio [Ca^{2 +}]_i è un affidabile e comunemente usato approccio alla Studio Ca^{2 +} segnalazione eventi, inclusa l'entrata di calcio store-operati, che è della massima importanza per l'attivazione di MC. Per l'analisi di MC degranulazione, descriviamo un'analisi del rilascio β-esosaminidasi. La quantità di β-esosaminidasi rilasciato nel terreno di coltura è considerata come un indicatore di degranulazione per tutti i tre diversi sottoinsiemi secretivi descritto in MCs. β-esosaminidasi può essere facilmente quantificato dalla sua reazione con un substrato di colorigenic in un analisi colorimetrica del piastra microtiter. Questa tecnica altamente riproducibile è conveniente e non richiede nessuna apparecchiatura specializzata. Nel complesso, il protocollo fornito di seguito viene illustrato un alto rendimento di MCs che esprimono marcatori di superficie tipici di MC, visualizzazione di caratteristiche morfologiche e fenotipiche tipiche di MCs e dimostrando le risposte altamente riproducibili per secretagoghi in Ca^{2 +}- analisi di imaging e degranulazione.

Introduzione

MCs gioca un ruolo di primo piano durante la risposta immunitaria innata ed acquisita. In particolare, MCs partecipare l'uccisione degli agenti patogeni, quali batteri e parassiti e anche degradare peptidi endogeni potenzialmente tossici o componenti dei veleni (per vedere la recensione Galli et al. 2008¹). Il ruolo fisiologico di MCs nell'immunità innata e adattiva è oggetto di acceso dibattito. Pertanto, le numerose discrepanze di dati negli studi effettuati con diversi modelli di mouse MC-carenti richiedono una rivalutazione sistematica delle funzioni immunologiche di MCs oltre allergia². MCs maturo sono principalmente localizzati in tessuti e organi come la pelle, del polmone e intestino e solitamente sono trovati soltanto in piccole quantità nel sangue. MCs derivano da precursori ematopoietici, come progenitori MC e completare la loro differenziazione e maturazione nei microambienti di quasi tutti i tessuti vascolarizzati¹. T-cellula-derivati fattore interleuchina (IL) -3 promuove selettivamente la vitalità, la proliferazione e la differenziazione di una popolazione pluripotenti del mouse MCs da loro progenitori ematopoietici³. Fattore della cellula formativa (SCF) è prodotto dalle cellule strutturali nei tessuti e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo, sopravvivenza, migrazione e funzione⁴MC. Le proprietà di singoli MCs possono differire a seconda della loro capacità di sintetizzare e memorizzare varie proteasi o proteoglicani. Nei topi, il cosiddetto tessuto connettivo-tipo MCs si distinguono dalle mucose MCs secondo la loro localizzazione anatomica, la morfologia e il contenuto di eparina e proteasi⁵.

Nel MCs, un aumento di libero citosolico Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_i) è indispensabile per la produzione degli eicosanoidi e degranulazione, così come per la sintesi di citochine e l'attivazione di fattori trascrizionali in risposta all'antigene e diversi secretagoghi⁶. Un importante obiettivo a valle di questi stimoli è fosfolipasi C, che idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato diacilglicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5-trifosfato. DAG attiva la proteina chinasi C e IP3 rilascia ioni di Ca^{2 +} dal reticolo endoplasmatico. Lo svuotamento di questi negozi attiva afflusso di Ca^{2 +} attraverso la membrana plasmatica Ca^{2 +} canali, portando a memorizzare voce calcio gestito (SOCE). Questo processo è evocato attraverso l'interazione del Ca^{2 +}-sensore, stromal interazione molecola-1 (Stim1), nel reticolo endoplasmatico con Orai1⁷ , nonché attraverso l'attivazione di recettori transitoria potenziali canonico (TRPC) canale proteine (per review Vedi Freichel et al. 2014⁸) nella membrana plasmatica.

Per studiare il ruolo fisiologico di questi canali, molti farmacologici (applicazione di bloccanti dei canali) o approcci genetici sono tipicamente utilizzati. In quest'ultimo caso, soppressione dell'espressione della proteina è realizzata prendendo di mira il mRNA (atterramento) o la modifica di DNA genomico con globale o tessuto-specifici⁹ omissione di un esone codifica un poro che formano unità secondaria di un canale (knockout). La disponibilità di un bloccante con sufficiente specificità per questi canali è limitata. Inoltre, l'approccio atterramento richiede controllo attento della sua efficacia utilizzando, ad es., Western blot analisi ed è ostacolata dalla mancanza di anticorpi specifici per la proteina canale mirato in molti casi. Così, l'utilizzo di modelli murini knockout è ancora considerato come il gold standard per questo tipo di analisi. Un modello preferito in vitro per lo studio delle funzioni MC è la coltivazione di PMC che può essere isolato ex vivo come una popolazione completamente matura (al contrario di differenziazione MCs in vitro da, ad es., cellule del midollo osseo)¹⁰ . Rispetto al midollo osseo derivato MCs (cellule), che vengono anche comunemente utilizzati per studiare la funzione MC in vitro, la stimolazione di FcεRI e beta-esosaminidasi rilascio è aumentato 8 volte e 100 volte in PMCs, rispettivamente. In questo articolo, descriviamo un metodo di isolamento e coltura di PMCs murino, che permette di ottenere dopo 2 settimane di coltura un numero elevato di puro tessuto connettivo tipo MCs, sufficiente per un'ulteriore analisi.

Nonostante i recenti progressi nello sviluppo e applicazione di indicatori di calcio codificato geneticamente, il loro uso è ancora limitata da difficoltà nella consegna dei geni alle cellule bersaglio, in particolare, in cellule altamente specializzate quali primaria MCs coltivate. Inoltre, questo gruppo di indicatori fluorescenti per [Ca^{2 +}]_io misure manca ancora raziometrici coloranti con un'alta gamma dinamica. Per questi motivi, il metodo preferito per raziometrica [Ca^{2 +}]_ho misura è ancora l'uso del colorante fluorescente "Fura-2"¹¹.

Attualmente, il più diffuso approccio per la valutazione dell'attivazione di MC e degranulazione è la misura dell'attività β-esosaminidasi. Β-esosaminidasi, un mediatore allergico, sono uno dei componenti del granello di MC che è co-pubblicato con istamina in proporzione costante da MCs¹². Β-esosaminidasi possono essere misurata facilmente e con precisione attraverso la reazione con un substrato specifico, che produce una quantità misurabile di un prodotto colorigenic che è facilmente rilevabile in un saggio colorimetrico di micropiastre. In questo articolo, un'applicazione di questa tecnica per l'analisi del degranulation di PMC in risposta a vari stimoli è segnalata.

Aggregazione del recettore IgE plasmalemmal ad alta affinità (FcɛRI) attiva nel MCs una versatile via di segnalazione intracellulare, che conduce ad un rilascio del granello secretivo contenuto nello spazio extracellulare circostante. Oltre l'antigene specifico, molti altri stimoli possono attivare MCs per rilasciare una gamma diversificata di mediatori di immunomodulatori, come complemento anafilotossine (ad es., C3a e C5a)¹³, il vasocostrittore del peptide endotelina 1 (ET1)¹⁴ , così come numerose sostanze cationiche e farmaci provocando reazioni pseudoallergiche (ad es., icatibant)¹⁵ legandosi a MRGPRX2¹⁶. Vie di segnalazione intracellulari coinvolti nella degranulazione MCs indotta da MRGPR sono poco caratterizzate rispetto FcɛRI-mediata segnalazione intracellulare; queste vie solo cominciato a essere studiato intensivamente durante l'ultimo pochi anni¹⁷ dopo l' identificazione del recettore¹⁶. In gran parte, i canali ionici di membrana plasmatica coinvolti nella voce calcio seguita da stimolazione MRGPRX2 rimangono per essere capito. Pertanto, il presente articolo si concentra anche su segnalazione del calcio intracellulare e degranulazione di MCs stimolate con gli agonisti MRGPR.

Protocollo

Tutte le procedure degli animali sono state effettuate secondo le direttive della normativa tedesca per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (ufficialmente approvato dal Consiglio regionale di Karlsruhe).

1. PMC isolamento e coltura di lavaggio intraperitoneale

1	Ghiaccio
2	siringhe da 10 mL
3	Aghi 27 G
4	Aghi di 20 G
5	Perni e blocco di polistirolo
6	Tubi di raccolta (50 mL provette in plastica)
7	etanolo al 70%
8	Medium RPMI (Pre refrigerati e tenuta su ghiaccio)
9	PMC Medium: Medium RPMI + 20% FCS (siero fetale di vitello) + 1% soluzione di penicillina streptomicina (penna-Strep)
10	Soluzione tampone fosfato di Dulbecco - DPBS (senza Ca2 + e Mg2 +)
11	Matracci di cultura (25 cm)
12	Soluzioni di riserva di fattori di crescita (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL)
13	Pipette sierologiche (10 mL)
14	Punte di pipette sterili (20-200 µ l)
15	Emocitometro
16	Centrifuga di panca
17	Forbici e pinze
18	Camera di CO2 per topi
19	Cappa sterile aperto
20	Cappa sterile chiusa
21	Incubatrice di cellulare (37 ° C e 5% CO2)
22	Pipette di trasferimento (20-200 µ l)

Tabella 1: Materiali per il passaggio 1.

1. Isolamento di PMC di lavaggio intraperitoneale
   1. Prima l'isolamento delle cellule, preparare i materiali elencati nella tabella 1.
   2. Utilizzare 8 alla 14 settimana-vecchi di topo maschio per l'isolamento di PMC. Eutanasia di un mouse per inalazione di CO₂ e confermare la morte di perdita dei riflessi. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e fissarlo su un blocco di schiuma con perni (lato dorsale verso il basso). Togliere la pelle ventrale del mouse utilizzando le forbici bordo smussato. Evitare di danneggiare la cavità peritoneale.
      Nota: Abbiamo in genere utilizzano questo protocollo per topi con un background genetico del ceppo C57BL/6N.
   3. Iniettare 7 mL di medium RPMI ghiacciato e 5 ml di aria nella cavità peritoneale, utilizzando una siringa da 10 mL con ago 27G. Spingere l'ago nel peritoneo e non perforare qualsiasi altro organo. Utilizzare un posto nella regione del grasso epididimario per ridurre il rischio di una perforazione dell'organo.
   4. Dopo l'iniezione, agitare il mouse per 1 min staccare le cellule peritoneali nel medium RPMI. Non agitare il mouse troppo fortemente, per evitare di danneggiare gli organi interni e la contaminazione della cavità peritoneale con il sangue.
   5. Riutilizzare la siringa 10 mL dotandolo di una nuova cannula 20G. Spostare gli organi interni su un lato inclinando il blocco di schiuma e picchiettando delicatamente sulla panchina per facilitare l'aspirazione medio da altro lato. Inserire un ago di 20 G, in rilievo fino e aspirare il liquido dall'addome delicatamente e lentamente (~0.5 mL/s) per evitare l'intasamento di organi interni. Raccogliere quanto più fluido possibile (in genere 5-6 mL).
   6. Rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire la sospensione cellulare raccolti in una provetta di raccolta sul ghiaccio. Scartare una provetta se c'è contaminazione di sangue visibile.
   7. Centrifugare le provette con una sospensione cellulare a ~ 300 x g per 5 min. Sotto una cappa sterile aspirare il supernatante. Per ogni mouse, combinare i pellet di campione in 4 mL di freddo (4 – 10 ° C) Medium PMC e trasferimento la sospensione cellulare in un matraccio di cultura 25 cm² . Aggiungere i fattori di crescita IL-3 e SCF per le concentrazioni finali 10 ng/mL e 30 ng/mL, rispettivamente. Collocare la beuta contenente le celle in un incubatore (37 ° C e 5% CO₂) ed incubare per ~ 48 h fino a quando la procedura successiva.
2. Cultura PMC
   1. Giorno 2 (~ 48 h dopo l'isolamento): cambiamento medio
      1. Per rimuovere il surnatante e antiaderente cellule (eritrociti e cellule morte), aspirare il mezzo dal pallone posizionando la punta di una pipetta di Pasteur al bordo del pallone e che tiene il pallone quasi orizzontalmente. Aggiungere 4 mL di Medium di PMC pre-riscaldato per topo. Aggiungere i fattori di crescita IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL). Collocare la beuta contenente le celle in un incubatore (37 ° C e 5% CO₂).
   2. Giorno 9: Cella spaccare
      1. Trasferire la sospensione cellulare nel matraccio di cultura delle cellule in un tubo di plastica centrifuga da 50 mL. Lavare il matraccio tre volte con soluzione tampone fosfato di 10 mL pre-riscaldati (37 ° C) Dulbecco (DPBS), raccogliendo la sospensione delle cellule con le cellule indipendenti nella stessa 50 mL in plastica tubo centrifugo. Contare la concentrazione cellulare di un emocitometro e calcolare il numero totale delle cellule.
      2. Centrifugare la sospensione cellulare a ~ 300 x g per 5 min e aspirare il supernatante. Recuperare il pellet in pre-riscaldato PMC Medium (37 ° C) per ottenere la cella concentrazione 1 x 10⁶ cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di cultura di nuovo 25 cm² . Scartare il vecchio pallone con fibroblasti aderendo alla parte inferiore.
      3. Aggiungere i fattori di crescita IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL) e posizionare la beuta contenente le celle in un incubatore (37 ° C e 5% CO₂).
   3. Giorni 12 – 15: misure di cella
      1. Se sono previsti degli esperimenti con stimolazione dei recettori FcɛRI, pretrattare le cellule durante la notte con 300 ng/mL di IgE anti-DNP nel medium di coltura standard. Procedere con il passaggio 2 o 3.

2. misura della concentrazione di calcio libero intracellulare fluorometrica nel PMC

1. Prima le misurazioni, preparare i materiali elencati nella tabella 2. Inoltre, preparare un'installazione di Imaging composto: microscopio invertito a fluorescenza; Obiettivo: 40 X / 1.3 olio; Fura 2 filtro impostato; Telecamera CCD; Sorgente di luce di eccitazione; Programma di acquisizione di immagini; Sistema di applicazione della soluzione di gravità.

1	PMC (12 – 15 giorni) 1 x 106 cellule/mL
2	Concanavalina A
3	Fura-2 AM
4	Soluzione al 20% Pluronic F-127
5	Vetrini coprioggetto occhiali rotondi; ø 25 mm; N ° 1
6	Soluzione di riserva di DNP-HSA (albumina di siero dinitrofenolo-umani)
7	Soluzione di riserva anti-DNP-anticorpo (IgE)
8	Piastra di fondo piatto (12 pozzi)
9	Soluzione madre di composto 48/80
10	Coprire bene Imaging Chambers
11	Emocitometro
12	Pipette di trasferimento (20-200 µ l)

Tabella 2: Materiali per il passaggio 2.

2. Preparazione imaging Fura-2
   1. Eseguire un conteggio delle cellule usando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare di 1 x 10⁶ cellule/mL. Dividere le colonie PMCs pipettando delicatamente (3 – 5 volte) la sospensione cellulare con una pipetta da 1 mL.
   2. Preparare un Ca^{2 +}-contenente HEPES soluzione salina tamponata (Ca^{2 +}- HBSS) composto da 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2mm CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES e 12 millimetri di glucosio. Regolare il pH a 7.4 con 3 M NaOH.
   3. Preparare la concanavalina A vetrini rivestiti di pipettaggio 1 goccia di soluzione di concanavalina A (0,1 mg/mL in H₂O) su ogni 25 mm turno vetro di copertura sotto una cappa sterile. Lasciare le gocce su vetrini coprioggetto per almeno 1 min, quindi rimuovere la maggior parte della soluzione con una pipetta e lasciare asciugare all'aria il coprioggetto per 45 min. Premere delicatamente la concanavalina A trattati vetrini coprioggetto sulla gomma imaging camera (Vedi Tabella materiali) fino a quando esse attribuiscono per ottenere la formazione immagine di alloggiamenti di microscopia.
      Nota: Diapositive di poli-L-lisina rivestito utilizzabile come un'alternativa.
   4. Sciogliere il Ca^{2 +} colorante fluorescente Fura-2 AM (1 mM) in dimetilsolfossido (DMSO). Conservare questa soluzione al riparo dalla luce.
   5. Diluire la Fura-2 soluzione di riserva di AM in Ca^{2 +}- HBSS ad una concentrazione finale di 5 µM al fine di preparare il "tampone di caricamento". Completare con 5 µ l/mL di 20% pluronic F-127 in DMSO.
   6. Mix 500 µ l di "buffer di caricamento" con 500 µ l della sospensione delle cellule PMC. Pipettare la miscela nella camera di imaging e incubare le cellule per 20 – 30 min a temperatura ambiente al buio.
   7. Impostare il sistema di applicazione con diverse soluzioni secondo il protocollo di stimolazione di gravità. Supplemento siringa 1 con 40 mL di soluzione di Ca^{2 +}- HBSS, siringa 2 con 40 mL di Ca^{2 +}- HBSS soluzione contenente 100 ng/mL DNP, siringa 3 con 40 mL di Ca^{2 +}- HBSS soluzione contenente 50 µ g/mL composto 48/80, siringa 4 con 40 mL di dimensioni nominali Ca^{2 +}-gratis-soluzione HBSS e la siringa 5 con 40 mL di dimensioni nominali Ca^{2 +}-gratis-soluzione HBSS contenente 2 µM Thapsigargin.
   8. Preparare un obiettivo a immersione in olio alto-apertura X 40 inserendo una piccola goccia di olio per immersione su di esso.
   9. Montare il sistema di applicazione sul palco del microscopio invertito. Mettere la camera imaging con le cellule caricate nel sistema di applicazione e fissarlo per evitare qualsiasi movimento durante la registrazione. Accendere la luce trasmessa e concentrare le cellule.
   10. Sciacquare le cellule tre volte con Ca^{2 +}- HBSS buffer utilizzando il sistema di applicazione di gravità.
   11. Incubare le cellule in Ca^{2 +}- HBSS per 5 min per Fura-2 de-esterificazione AM.
   12. Sciacquare le cellule ancora una volta prima di iniziare l'imaging, per rimuovere eventuali potenzialmente trapelate tintura fluorescente.
3. Formazione immagine della cella
   1. Avviare il programma di acquisizione immagini in modalità acquisizione fisiologica. Aprire la finestra di installazione e regolare la messa a fuoco e il tempo di acquisizione ottimale (che dovrebbe essere lo stesso per l'eccitazione con 340 nm e 380 nm e in genere varia tra 50 e 150 ms).
      Nota: Ridurre al minimo l'esposizione del Fura-2 cella caricata da qualsiasi luce per evitare photobleaching della tintura.
   2. Un quadro di riferimento di immagine e contrassegnare le celle come regioni di interesse (ROI). Contrassegnare l'ultimo ROI in un'area dove le celle non sono presenti e definiscono come sfondo.
   3. Completare l'installazione e avviare la misurazione con una frequenza di acquisizione s 5.
      Nota: Le cellule si illumina alternativamente con la luce di eccitazione di 340 nm e 380 nm e la fluorescenza emessa (> 510 nm) saranno raccolte mediante la telecamera CCD. Le immagini di fluorescenza segnali F340 nm e F380 nm come pure il rapporto (F340 nm/F380 nm) verranno visualizzate in tre finestre. I grafici del corso di tempo dell'intensità di fluorescenza ROIs individuali significano valori verranno visualizzati anche continuamente.
   4. Aggiungere soluzioni al numero corretto ciclo secondo il disegno dell'esperimento:
      1. A misura dell'antigene-indotta l'elevazione del [Ca^{2 +}]_i, come illustrato nella Figura 2A, 2B, applicare la soluzione di siringa 2 dopo ciclo 20 e interrompere la registrazione dopo ciclo 150.
      2. Per misurare l'elevazione indotta da composto 48/80 [Ca^{2 +}]_i,come illustrato in Figura 2C, applicare la soluzione di siringa 3 dopo ciclo 20 e interrompere la registrazione dopo ciclo 150.
      3. Per misurare l'elevazione della [Ca^{2 +}]_ho evocato da SOCE, come illustrato nella Figura 2D, applicare la soluzione di siringa 4 dopo ciclo 10, applicare la soluzione di siringa 5 dopo ciclo 70, applicare la soluzione di siringa 4 dopo ciclo 120, applicare la soluzione di siringa 1 dopo ciclo 150 e interrompere la registrazione dopo ciclo 220.
   5. Dopo aver terminato la misurazione, è necessario convertire i risultati in una tabella di rapporto contenente le intensità misurate per lunghezze d'onda di eccitazione con e senza correzione del fondo, nonché i valori di rapporto con e senza correzione di fondo per ogni ROI e ogni punto del tempo di misurazione. Nel programma di acquisizione, premere i pulsanti: "inizio fresa", "Seleziona tutti", "Converti tutti", "misure di fisiologia", "Ok,"Ok". Salvare i file come tabelle e serie di immagini per l'analisi off-line.

3. beta-esosaminidasi rilascio misura in PMC

1	PMC (12 – 15 giorni) 1 x 106 cellule/mL
2	Soluzione di riserva anti-DNP-anticorpo (IgE)
3	Soluzione di riserva di DNP-HSA
4	Soluzione madre di composto 48/80
5	Ionomicina
6	Piastra a 96 pozzetti, fondo a v
7	Piastre da 96 pozzetti, fondo piatto
8	Provette in plastica (15 mL)
9	Pipette sierologiche
10	Incubatrice di cellulare (37 ° C e 5% CO2)
11	Centrifuga di panca
12	Lettore di micropiastre per misure di densità ottica
13	Pipetta multicanale (20 – 200 μL)
14	Emocitometro

Tabella 3: Materiali per il passaggio 3.

1. Prima le misurazioni, preparare i materiali elencati nella tabella 3.
   Nota: β-esosaminidasi rilasciato da MCs dopo loro stimolazione idrolizza p-nitrofenil-acetil-D-glucosamina (pNAG) p-nitrofenolo e N-acetil-D-glucosamina. La quantità di β-esosaminidasi nel campione è proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si formerà. In un ambiente a pH elevato di "Soluzione", p-nitrofenolo esiste come completamente deprotonato p-nitrophenolat e può essere rilevato dalla sua luce assorbanza a 405 nm.
2. Preparare la soluzione di Tyrode contenente 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl₂, 1mm MgCl₂, 10 mM HEPES, 5,6 millimetri di glucosio e BSA 0.1%. Regolare il pH a 7.4 con 3 M NaOH.
3. Preparare la soluzione di lisi aggiungendo un 1% del volume di Triton X-100 soluzione di Tyrode.
4. Preparare la soluzione di stop composta da glicina di 200 mM e regolare il pH a 10,7 con NaOH.
5. Preparare la soluzione di pNAG (2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside 4-nitrofenil) sciogliendo pNAG in acido citrico 0,4 M a una concentrazione finale di 4 mM.
6. Calcolare la quantità di cellule necessarie per il dosaggio (eseguire il dosaggio in duplicato). Utilizzare 200.000 PMC per pozzetto. Utilizzare 2 pozzi come controlli negativi (soluzione di Tyrode senza qualsiasi secretagogues come DNP o composto 48/80) e 2 pozzi come controlli positivi (soluzione di Tyrode con 10 µM ionomicina) per ogni genotipo.
7. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga plastica 15 mL, regolare il volume a 15 mL con soluzione di Tyrode e centrifugare a 200 x g per 4 minuti rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur e risospendere le cellule in soluzione di Tyrode a 2 x 10⁶ cellule / ml.
8. Trasferire 100 µ l della sospensione delle cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo V bene. Aggiungere 25 µ l di soluzione di controllo o di stimolazione ad ogni pozzetto (secondo lo schema di pipettaggio illustrato in Figura 3A). Incubare le cellule per 45 min a 37 ° C e 5% CO₂.
9. Fermare la reazione inserendo la piastra a 96 pozzetti in ghiaccio per 5 min. Poi, centrifugare la piastra a 4 ° C per 4 min a 120 x g. Trasferire 120 µ l del surnatante con una pipetta multicanale per una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto e posizionarlo sul ghiaccio. Evitare accuratamente di toccare il pellet di cellule, ma completamente aspirare il supernatante.
10. Aggiungere 125 µ l di tampone di lisi per il pellet cellulare. Incubare il pellet cellulare per 5 min a temperatura ambiente e risospendere li dopo l'incubazione pipettando ripetute (circa 5 volte).
11. Pipettare 25 µ l della soluzione pNAG (4 mM) nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto nuovo richiesti. Aggiungere 25 µ l da ogni surnatante per la soluzione di preparati pNAG, nonché a 25 µ l di ogni lysate delle cellule.
12. Incubare i batch di reazione per 1h a 37 ° C. Dopo l'incubazione, dispensare 150 µ l di soluzione bloccante in ciascun pozzetto per arrestare la reazione.
13. Analizzare la piastra con un lettore di micropiastre utilizzando un'impostazione di doppio-lunghezza d'onda 405 nm con riferimento 630 nm per la sottrazione di automatico in background. Nel programma di acquisizione, barrare la casella "Reference" e nel menu elemento del programma "Assorbanza", selezionare "630 nm" dall'elenco a discesa. Se la densità ottica dei campioni è troppo alta, preparare una diluizione appropriata della sonda prima rimisurazione.
14. Calcolare la percentuale di rilascio β-esosaminidasi secondo la seguente equazione:
    
    dove rilascio [%] è la percentuale di rilascio specifico beta-esosaminidasi, un [surnatante] è lo sfondo corretto assorbimento del surnatante ed un [lisato] è lo sfondo corretto assorbimento della cella corrispondente lisata.

Risultati

PMC sono stati isolati da topi wild type 3 (C57BL/6N) tramite il lavaggio intraperitoneale e ulteriormente coltivate in medium RPMI completate con FCS 20% e 1% penna-Strep in presenza di fattori di crescita (IL-3 a 10 ng/mL) e SCF a 30 ng/mL sotto sterile umidificati condizioni alle 37 ° C e 5% CO₂. Il mezzo è stato modificato nei giorni 2 e 9 dopo l'isolamento delle cellule. La morfologia delle cellule è stata analizzata mediante trasmissione luce imaging DIC (Vedi

Discussione

Modelli di MC possono essere utilizzati con successo per lo studio MC degranulazione, chemiotassi, adesione, come pure di delucidare le vie di trasduzione del segnale intracellulare coinvolte nell'attivazione di MC. Alcuni ricercatori uso umano MCs modelli, ad esempio linee immortalizzate (LAD2 e HMC1) o MCs umano derivati dal cordone sanguigno cellule progenitrici (cellule CD133 +) e cellule progenitrici del sangue periferico (CD34 +). Altri preferiscono roditore modelli MC, come immortalati (leucemia basophilic ratto l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI	Medium Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R& D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anticorpo anti-DNP	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Composto 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrofenil 2-acetamido-2-deossi-β-D-glucopiranoside	Sigma-Aldrich	N9376
Camera di imaging CoverWell	Sigma-Aldrich	GBL635051
Piastra a 96 pozzetti, fondo a forma di V	Corning	3896
Piastre a 96 pozzetti, fondo piatto	Greiner Bio-One	655180
Lettore di piastre per microtitolazione con software "i-control"	Tecan	Nano Quant, infinito M200 Pro
Piastra a fondo piatto	Greiner Bio-One	655180
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Provette da centrifuga in plastica	Sarstedt	62.547.254
Palloni di coltura (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Vetrini coprioggetto rotondi; ø 25 mm; N. 1	Menzel	CB00250RA1
	VWR	631-0696
Microscopio invertito	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
Telecamera CCD	Zeiss	AxioCam MRm
Sorgente luminosa monocromatica	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Programma di acquisizione immagini	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Sistema di applicazione della soluzione alimentata a gravità		4 canali
	Sarstedt	62.554.502
Centrifuga da banco	Heraeus	Megafuge 1.0R