Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la preparazione di grandi quantità di protoplasti di soia studiare i complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule vive.
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Articolo metodologico
Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria
In questo articolo
Sommario
Abstract
Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una specie di coltura importante ed è diventato un modello di legumi per gli studi delle vie genetiche e biochimiche. Pertanto, è importante stabilire un sistema di espressione genica transitoria efficiente in soia. Qui, segnaliamo un semplice protocollo per la preparazione dei protoplasti di soia e la sua applicazione per l'analisi funzionale transitorie. Abbiamo trovato che le foglie giovani unifoliate da piantine di soia ha provocato grandi quantità di protoplasti di alta qualità. Grazie all'ottimizzazione di un metodo di trasformazione PEG-calcio-mediata, abbiamo raggiunto l'efficienza di trasformazione alta utilizzando protoplasti unifoliate soia. Questo sistema fornisce un modello efficiente e versatile per l'esame dei complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule di soia dal vivo e può aiutare per meglio comprendere diversi processi cellulari, inerente allo sviluppo e fisiologici dei legumi.
Introduzione
Protoplasti sono cellule vegetali che hanno rimosse le pareti cellulari. Come mantengono la maggior parte delle caratteristiche e attività di cellule vegetali, protoplasti sono un sistema di buon modello di osservare e valutare diversi eventi cellulari e sono strumenti preziosi per studiare ibridazione somatica1 e impianto di rigenerazione2. Protoplasti sono stati anche ampiamente utilizzati per impianto trasformazione3,4,5, poiché le pareti cellulari altrimenti bloccherebbe il passaggio del DNA nella cellula. Protoplasti possie....
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Protocollo
1. la crescita delle piante
- Seminare i semi di soia 5-10 (Williams 82) in un vaso di 13 cm in serra in condizioni di giorno lungo (16 h luce alle 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C sul mix di terreno personalizzato per la soia (1:1:1 rapporto di sabbia del suolo, la perlite e la torpedine).
2. preparazione del DNA del plasmide
- Utilizzando una pipetta sterile o uno stuzzicadenti, scegli una singola Colonia o glicerolo congelati stock di e. coli che trasportano il plasmide contenente il gene di interesse e inoculare esso in 20 mL di terreno liquido di Luria-Bertani (LB) con gli antibiotici ad....
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Risultati
Diversi organi di soia 10 - giorno-vecchio sono stati testati per la preparazione del protoplasto (Figura 1) e i rendimenti sono stati osservati al microscopio (Figura 2). Pareti cellulari da ipocotile ed epicotyl erano appena digeriti, e alcune cellule siamo stati attaccati alla vicenda (Figura 2B, 2C). Nel cotiledone (Figura 2D) e radice (
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Discussione
Questo protocollo per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di studi di espressione transitoria è stato accuratamente testato e funziona molto bene nel nostro laboratorio. Le procedure sono semplici e facili e richiedono apparecchiature ordinarie e minimo costo. Il nostro protocollo produce grandi quantità di protoplasti di uniforme, di alta qualità rispetto ai metodi precedentemente segnalati34,35,36,<.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca del genoma di pianta dalla National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulasi CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectoliasi Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASI "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitolo | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 Fluka | 81240 | ||
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Piastre per colture tissutali | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Lamette da barba | Fisher | 12-640 | |
| emacitometro | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Kit miniprep plasmidico EZNA | Omega | D6942-01 | |
| Kit miniprep plasmidico GeneJET | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuga 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuga 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Microscopio confocale Zeiss 710 | Zeiss | N/A | |
| Provette per microfuge antiaderenti prive di RNasi, 1,5 mL | Ambion AM12450 | ||
| 15 mL Provette da centrifuga | Denville | C1018-P | |
| Provette da centrifuga da 50 mL | Denville | C1060-P | |
| Siero per vitelli neonati | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sabbia | JKS Ventures | ||
| LB Brodo, Lennox (Polvere) | Fisher | BP1427-500 |
Riferimenti
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. ....
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Ristampe e permessi
