Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

Naoki Yanagisawa; Nagisa Sugimoto; Tetsuya Higashiyama; Yoshikatsu Sato

doi:10.3791/57262

Method Article

Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

DOI:

10.3791/57262

⸱

May 22nd, 2018

Naoki Yanagisawa¹ , Nagisa Sugimoto² , Tetsuya Higashiyama¹^,² , Yoshikatsu Sato²

¹Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, ²Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

Summary

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Descriviamo un metodo per indagare la capacità di crescita punta di cellule vegetali, compresi i tubi di polline, peli radicali e muschio protonemata, allunga attraverso lacune estremamente strette (~ 1 µm) in un dispositivo microfluidico.

Abstract

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In vivo, punta-coltivazione di cellule vegetali hanno bisogno di superare una serie di barriere fisiche; Tuttavia, i ricercatori mancano la metodologia per visualizzare il comportamento cellulare in tali condizioni restrittive. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato camere di crescita per punta-crescita cellule vegetali che contengono una serie di lacune strette, micro-fabbricato (~ 1 µm) in un substrato di poli-dimetilsiloxano (PDMS). Questo materiale trasparente consente all'utente di monitorare i processi di allungamento di punta in singole celle durante la penetrazione di microspazi da formazione immagine di time-lapse. Utilizzando questa piattaforma sperimentale, abbiamo osservato i cambiamenti morfologici in tubetti pollinici come hanno penetrato i microspazi. Abbiamo catturato i cambiamenti dinamici nella forma di un nucleo vegetativo fluorescente contrassegnato e cellule dello sperma in un tubo di polline durante questo processo. Inoltre, abbiamo dimostrato la capacità dei peli radicali e muschio protonemata di penetrare il 1 gap µm. Questa piattaforma in vitro può essere usata per studiare come singole cellule rispondono agli spazi fisicamente vincolati e può fornire le comprensioni nei meccanismi di crescita di punta.

Introduction

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Dopo i grani di polline germinano a uno stigma, ogni grano produce un singolo tubo di polline che trasporta spermatozoi verso la cellula uovo e la cella centrale nell'ovulo per doppia fertilizzazione. Tubetti pollinici allungare attraverso lo stile e alla fine raggiungere l'ovulo rilevando più segnali di guida lungo la loro strada¹. Durante l'allungamento, tubetti pollinici incontrano una serie di barriere fisiche; la pista trasmettente è pieno di cellule e tubetti pollinici deve immettere l'apertura micropylar minuto dell'ovulo per raggiungere il loro obiettivo (Figura 1A)². Di conseguenza,....

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Protocol

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1. fabbricazione del PDMS Microdevice per esaminare tubetti pollinici in crescita e muschio Protonemata

Nota: Abbiamo usato uno strumento di quelle fotolitografia per preparare stampi PDMS su wafer di silicio. I dettagli riguardanti il funzionamento del sistema sono omessi in questo manoscritto. Una tecnica di fotolitografia standard⁹ utilizzando un photomask può anche essere utilizzato per creare gli stampi PDMS descritti in questo manoscritto.

Versare 11 g di miscela di pre-polimero PDMS (elastomero base: indurimento agente a un rapporto di 10:1) in ogni stampo di 4 pollici.
Degassare la muffa p....

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Results

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Come illustrato nella Figura 1, punta-coltivazione di cellule vegetali incontrano una serie di barriere fisiche lungo i loro percorsi di crescita in vivo. Microfluidica in vitro delle cellule cultura piattaforme presentate in questo studio abilitato l'esame la punta crescente processo in tre tipi di cellule vegetali (tubetti pollinici, peli radicali e muschio protonemata) attraverso le lacune artificiale di 1 µm (Figura .......

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Discussion

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Diversi passaggi critici nel protocollo devono essere seguite con precisione per ottenere i risultati presentati qui sopra. In primo luogo, le superfici PDMS piatto fondo di vetro e strato devono entrambi essere trattate con il plasma per un sufficiente lasso di tempo prima dell'incollaggio. In caso contrario, lo strato PDMS localmente può staccare dalla superficie del vetro mentre punta crescita cellule sono attraversando il microgaps. Un altro passo cruciale nel protocollo di protonemata dei capelli di radice e muschio.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

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Ringraziamo H. Tsutsui e D. Kurihara per averci fornito con piante transgeniche, tra cui la linea di T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato e la linea di a. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , rispettivamente. Questo lavoro è stato supportato da Istituto di Transformative Bio-molecole di Nagoya University e il Giappone Advanced Plant Science Network. Sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito da sovvenzioni dal Japan Science and Technology Agency (progetto ERATO concedere no. JPMJER1004 per T.H.), una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Nos. JP16H06465 e JP16H06464 per T.H.) e la società giapponese per la promozione della....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Saccarosio	Wako Pure Chemical	196-00015
Piatto con fondo in vetro da 50 mm	Matsunami Glass	D210402
Piatto con fondo in vetro da 35 mm	Iwaki	3971-035
Lama chirurgica	Feather	No.11
punzoni per biopsia	Harris		Uni-Core
Gel punte di caricamento	Bio-Bik	124-R-204
Microscopio invertito	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		Nessun numero di catalogo è disponibile per questo microscopio personalizzato
Software di imaging MetaMorph	Molecular Devices

References

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Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).....

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