Strategie di campionamento e trattamento dei campioni di tessuto Biobank Porcine modelli biomedicale

Sommario

Le applicazioni pratiche e le prestazioni dei metodi per la generazione di campioni di tessuto rappresentativo di porcini modelli animali per un ampio spettro di analisi a valle nella biobanca progetti sono dimostrati, tra cui volumetria, campionamento casuale sistematico, e trattamento differenziale dei campioni di tessuto per i tipi di analisi qualitative e quantitative morfologiche e molecolari.

Abstract

Nella ricerca medica traslazionale, porcini modelli costantemente sono diventati più popolari. Considerando l'alto valore dei singoli animali, specialmente di maiale geneticamente modelli e il numero spesso limitata di animali disponibili di questi modelli, creazione di raccolte di (biobanca) dei campioni di tessuto adeguatamente elaborato adatto per un ampio spettro di metodi di analisi successive, incluse le analisi non specificati nel punto del tempo di campionamento, rappresentano significativi approcci per sfruttare appieno il valore traslazionale del modello. Per quanto riguarda le peculiarità dell'anatomia suina, le linee guida complete recentemente sono state stabilite per generazione standardizzato di rappresentante, campioni di alta qualità da suini diversi organi e tessuti. Queste linee guida sono prerequisiti essenziali per la riproducibilità dei risultati e la loro comparabilità tra diversi studi e gli investigatori. La registrazione dei dati di base, come pesi dell'organo e volumi, la determinazione di punti di campionamento e il numero di campioni di tessuto da generare, come pure loro orientamento, dimensione, elaborazione e indicazioni di rifilatura, sono fattori rilevanti determinazione della generalizzabilità e usabilità del campione per analisi morfologiche molecolari, qualitative e quantitative. Qui, una dimostrazione illustrativa, pratica e dettagliata delle tecniche più importanti per la generazione del rappresentante, multi-purpose biobanca esemplare da tessuti di origine suine è presentato. I metodi descritti qui includono la determinazione dei volumi di organi/tessuti e densità, l'applicazione di una procedura di campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume per organi parenchimali di punto-conteggio, determinare l'entità del restringimento del tessuto legate alla inclusione istologici di campioni e generazione di campioni orientati casualmente per analisi stereologiche quantitative, come le sezioni di casuale uniforme isotropici (IUR) generate dai metodi "Orientatore" e "Isector" e uniforme verticale sezioni (RVU) casuale.

Introduzione

In medicina traslazionale, maiali sono sempre più comuni per uso come animale di grandi dimensioni modelli^1,2,3,4,5, a causa di parecchie somiglianze vantaggiose tra il porcino e anatomia umana e fisiologia e la disponibilità di metodi biologici molecolari stabiliti permettendo per generazione di su misura, geneticamente modelli di maiale per una vasta gamma di condizioni di malattia^1,4.

Tuttavia, rispetto ai modelli del roditore, il numero di animali di un modello di rispettivi maiale che possono essere fornite per gli esperimenti in qualsiasi momento è limitato. Ciò è dovuto l'intervallo di generazione porcino di circa un anno e gli sforzi finanziari e richiedono molto tempo richiesti per la generazione di modelli porcine e zootecnia. Pertanto, singoli animali di un modello porcino, come pure i campioni che possono essere generati da questi suini, sono molto utili, specialmente se geneticamente porcine modelli e/o a lungo termine problemi sperimentali (ad esempio, le complicazioni ritardate di malattie croniche) sono esaminate in individui invecchiati^2,6,7.

Nel corso di qualsiasi studio, prestazioni di analisi aggiuntive che non era stata prevista nel progetto sperimentale iniziale dello studio più tardi potrebbero rivelarsi per essere rilevante, per esempio, all'indirizzo distinte domande derivanti da precedentemente scoperto risultati inattesi. Se non sono disponibili campioni idonei per tali ulteriori esperimenti, sproporzionatamente elevato costo e dispendiose spese potrebbero essere necessarie generare ulteriori maiali e campioni di tessuto. Per essere preparati per tali eventualità, generazione delle collezioni Biobanca di campioni di backup conservati di diversi organi, tessuti o bio-liquidi, quantitativamente e qualitativamente adatti per una vasta gamma di analisi successive, è considerato un importante approccio^2,6,7. I benefici ottimali la derivazione da un modello animale porcino, la disponibilità di campioni adeguati biobanca offre anche la possibilità unica per eseguire un'ampia gamma di metodi differenti di analisi sui materiali campione identico a livello multi-organo nella stessa singoli animali, per esempio, di distribuzione dei campioni agli scienziati di diversi gruppi di lavoro organizzati in una rete di ricerca^2,6,7. Inoltre, la strategia di campionamento ' lungimirante ' in biobanking contribuisce anche ad una riduzione del numero di animali necessari in uno studio. I vantaggi del modello porcino biobanking recentemente sono stati dimostrati in un multi-organo, multiomics studio, esaminante organo cross-talk in un modello porcino geneticamente di mellito di diabete a lungo termine, usando gli esemplari da Monaco di Baviera MIDY maiale biobanca ².

Ci sono alcuni requisiti obbligatori biobanca campioni generalmente devono rispettare per stabilire l'affidabilità e l'interpretabilità dei risultati delle analisi eseguite successivamente. I campioni devono essere generati in modo riproducibile, e devono essere adeguatamente rappresentante, cioè, che riflette le caratteristiche morfologiche e molecolari interessate dell'organo/tessuto sono stati prelevati i campioni da⁷. Per essere adatto per una vasta gamma di tipi di analisi a valle, i campioni devono essere presi in quantità sufficiente e trattati secondo le richieste (comprese le condizioni di tempo e temperatura) dei metodi analitici diversi, tra cui descrittivo analisi istopatologiche, come cryohistology, paraffina e plastica istologia, immunoistochimica, ibridazione in situ , analisi al microscopio elettronico ultrastrutturali e analisi diagnostiche di laboratorio clinico, anche come molecolare analisi del DNA, RNA, proteine e metaboliti.

Per consentire la valutazione di una vasta gamma di parametri morfologici quantitativi distinti quali numeri, volumi, lunghezze o superfici di strutture di tessuto distinti dalle analisi stereologiche quantitative, sezione randomizzato gli aerei della campioni istologici dei rispettivi organi/tessuti devono essere preparati^7,8,9,10,11. In studi morfologici quantitativi, la determinazione precisa del volume totale del tessuto, organo o vano di organo, i campioni sono stati prelevati da (cioè, lo spazio di riferimento) è fondamentalmente importante^{7,9 , 12} per calcolare le quantità assolute dei parametri interessati entro il rispettivo organo, tessuto o organismo. Alla fine, l'effetto di restringimento di incorporamento-relative del tessuto durante la preparazione delle sezioni istologiche deve essere determinato e presi in considerazione¹³. Pertanto, analisi quantitative stereologiche, soprattutto di campioni archiviati (fissata i campioni di tessuto, tessuto incorporato blocchi, sezioni istologiche, ecc.) da studi precedenti sono a volte severamente limitata o addirittura impossibile¹², specialmente se volumetria dei rispettivi organi/tessuti non è stata eseguita, se non disegni di campionamento adeguato sono stati applicati per mandato campioni rappresentativi, se i numeri e le quantità di campioni singoli disponibili non sono sufficienti, o se l'elaborazione della campioni è incompatibile con la valutazione dei parametri morfologici quantitativi di interesse di. A causa di molteplici fattori d'influenzano possibili, l'idoneità dei materiali di archivio-campione per l'analisi dei parametri morfologici quantitativi distinti non può essere risolta in modo inequivocabile, ma dipende la valutazione attenta di ogni singolo caso.

Così, come la posizione, dimensioni, numero, elaborazione, direzione di taglio e orientamento dei campioni potenzialmente influenzerà i risultati delle analisi successive, questi fattori sono di grande importanza e devono essere considerati nel disegno sperimentale di qualsiasi studio. Per quanto riguarda questi aspetti e le caratteristiche speciali dell'anatomia suina, linee guida di campionamento completo, dettagliato, su larga scala modelli animali adattati a suina recentemente sono stati stabiliti, fornendo un robusto riferimento standardizzato, riproducibile e generazione efficiente di campioni ridondanti, adeguatamente elaborati, di alta qualità da più di 50 diverse specie suina organi e tessuti^6,7.

Le descrizioni metodologiche e il video tutorial illustrato nel presente articolo forniscono dettagliate, illustrativi, comprensibile, passo a passo le istruzioni per esecuzione pratica di una varietà di tecniche per volumetria, campionamento dei tessuti suine e organi e trattamento dei campioni di tessuto per metodi differenti di analisi a valle. Le tecniche consigliate includono metodi per la determinazione dei volumi di organi/tessuti e densità sulla base dei principi di Archimede e Cavalieri⁹, compresa la determinazione delle dimensioni del restringimento tridimensionale del tessuto relativo alla incorporamento in diversi incorporamento media¹⁴ durante l'elaborazione per esame istologico, applicazione del campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume praticabile si avvicina, elaborazione di campioni di tessuto campionata per diverse successive analisi^7,8,9,15e generazione di opportunamente orientato ed elaborati campioni per potenziali analisi quantitative stereologiche^{7,8, 9,10,11}. Accanto a loro applicazione nei progetti di porcino biobanca, i metodi hanno dimostrati sono generalmente adatti per tutti gli studi che esaminano proprietà quantitativa histo-morfologiche di organi/tessuti. Inoltre, disegni di campionamento casuale sistematico sono particolarmente utili per la generazione di campioni rappresentativi in esperimenti utilizzando metodi di analisi molecolare per rilevare alterazioni di abbondanza di, per esempio, RNA, proteine o metaboliti in vari organi e tessuti.

I prossimi paragrafi forniscono una breve introduzione a questi metodi, mentre loro prestazioni funzionali sono descritto nella sezione protocollo.

Determinazione dei volumi di organi/tessuti
Determinazione dei volumi e pesi dell'organo è importante in diverse impostazioni sperimentali, come questi fattori potrebbero indicare cambiamenti, potenzialmente correlati al sperimentalmente esaminati fattori di interesse. Il volume totale di un organo/tessuto è anche comunemente richiesto per il calcolo di parametri quantitativi assoluti, (ad esempio, il numero totale delle cellule), dalle densità numerica stereologically stima del volume (cioè, il numero di celle per unità di volume del tessuto)^7,12. Oltre alle tecniche utilizzando attrezzature tecniche complesse, quali tomografia del calcolatore, ci sono fondamentalmente tre metodi pratici comunemente utilizzate per determinare il volume assoluto di un organo o tessuto. Il volume di un organo può essere determinato da "diretto misura volumetrica" secondo il principio di Archimede, cioè, misurazione del volume di acqua o soluzione salina spostato dalla struttura quando completamente sommerso. Tuttavia, per in modo paragonabile grandi organi porcini, questi approcci sono poco pratico e incline a imprecisione, poiché richiedono molto grande/misurazione volumetrica boccette. Più convenientemente, il volume di un organo/tessuto può essere calcolato dal suo peso e densità^7,12,16, che può essere determinato in modo efficiente utilizzando il "metodo di immersione"^{7,12 ,16} (passaggio di protocollo 1.1.). Volumi di organo/tessuto possono inoltre essere stimate utilizzando la volumetria approcci basati sul "principio di Cavalieri" (1598-1647). In termini semplici, afferma il principio di Cavalieri, che, se due oggetti sono sezionati in piani paralleli ad un piano terra, e i profili delle sezioni tagliano attraverso i due oggetti alle corrispondenti distanze dal piano di terra hanno le stesse aree, i due oggetti hanno lo stesso volume. Quindi, il volume degli oggetti di forma arbitraria può essere valutato come il prodotto delle loro zone di profilo di sezione in sezione parallela, altrettanto lontani gli aerei e la distanza tra i piani di sezione. Questo è comprensibile con la seguente analogia: considera due stack composto lo stesso numero di monete identiche sono collocati fianco a fianco, uno stack con l'inserviente di monete impilata una sopra l'altra producendo una forma cilindrica dello stack delle monete e l'altro pila di monete con fuori centro posizionato monete (Figura 3A). Anche se le forme di entrambi gli stack di moneta sono diverse, i volumi sono gli stessi, poiché le zone delle monete a livelli corrispondenti di entrambi gli stack (vale a dire, le aree di profili di sezioni parallele tagliano attraverso entrambi gli stack di moneta a distanze uguali dalla terra) sono identici. Stima dei volumi di porcini organi e tessuti utilizzando il principio di Cavalieri^7,12,15 è descritto al punto 1.2.

Determinazione del grado di restringimento del tessuto legata alla inclusione di istologico
Nelle analisi di diversi parametri morfologici quantitativi misurati nelle sezioni istologiche del tessuto, l'effetto di restringimento di incorporamento-relative del tessuto che si verificano durante la lavorazione per l'istologia del tessuto deve essere determinato e presi in considerazione. L'entità del restringimento di incorporamento-relative del tessuto può essere variabile e dipende sia il tessuto, l'elaborazione e l'incasso medio^{8,13,17,18,19}. Generalmente, cambiamenti relativi all'incorporamento del volume di un campione di tessuto (cioè, per lo più restringimento) si verificano in tutte le tre dimensioni dello spazio e, di conseguenza, influisce su tutti i parametri dimensionali stimati dalle analisi stereologiche quantitative⁸ . In sostanza, il grado di restringimento di incorporamento-relative del tessuto, espresso come il fattore di ritiro lineare tessuto (f_S), può essere stimato come indicato al punto 1.3. e usate per la correzione di parametri morfologici quantitativi (restringimento sensibile)¹⁴.

Campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume di organi/tessuti
Istituzione di una raccolta di Biobanca di campioni dell'organo/tessuto suino, approcci sistematici di campionamento casuale-ponderato sul volume come descritti nel passaggio 2 hanno dimostrato di essere pratiche, risparmio di tempo ed efficienti tecniche per la generazione del rappresentante, tessuto multi-purpose campioni^7,8,9,15.

Generazione di sezioni isotropica uniforme casuale e casuale uniforme verticale per analisi quantitative stereologiche
Biobanca di campioni di tessuto devono essere adatto per una vasta gamma di metodi differenti di analisi stereologiche quantitativa per la stima di un massimo di parametri che non potrebbe essere determinato senza un esemplare adeguatamente preparato. Quasi tutti i parametri quantitativi stereologiche possono essere determinati, utilizzando "isotropo (indipendente) casuale (IUR) sezioni uniformi"^8,9. Nelle sezioni IUR, l'orientamento tridimensionale del piano di sezione del campione di tessuto è casuale. Ciò può essere ottenuto dalla randomizzazione della posizione del campione di tessuto rispetto alla posizione del piano di sezione, come applicato nei "Isector" metodo¹¹ (punto 3.1 del protocollo), o da casualizzazione dell'orientamento del piano di sezione relativi alla campione di tessuto, come il metodo di "Orientatore"¹⁰ (passo 3.2 del protocollo). Nei campioni di tessuto, come la pelle o la mucosa esemplare Mostra un asse verticale naturalmente presente, o definito e correttamente identificabile, preparazione di "verticale uniforme casuale (RVU) sezioni" (fase di protocollo 3.3.) sezionato rigorosamente all'interno del piano di loro asse verticale è vantaggioso^8,20. Per un discorso completo dei fondamenti teorici del campionamento IUR/VUR e una discussione esaustiva delle potenziali a valle analisi quantitativi stereologiche, si rimanda il lettore interessato ai libri di testo di stereology quantitativa nella vita Scienze^8,9.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui utilizzano campioni di tessuto derivati da animali morti e rispondono pienamente le norme di legge tedesche del benessere degli animali.

1. volumetria

1. Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo (Figura 1 e Figura 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Preparare i materiali: bisturi lame, asciugamani di carta, una pinzetta, bilance da laboratorio standard, vetro o bicchieri di plastica, soluzione fisiologica allo 0,9% e portacampioni auto-costruito (Figura 2A).
   2. Asportare un pezzo di tessuto (dimensione massima: 2 x 2 x 2 cm³) dal organo/tessuto, in particolare dal vano dell'organo di interesse. Piccoli organi, ad esempio l'ipofisi o ghiandola pineale, sono misurati in toto.
      Attenzione: Assicurarsi che la dimensione del campione è considerevolmente più piccola rispetto al diametro interno del becher (passo 1.1.5 e segg.) e il suo livello di riempimento per consentire la completa immersione del campione senza contatto con le pareti interne del bicchiere nel passaggio 1.1.7.
   3. Tampone con cura il campione con un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso di sangue/tessuto.
   4. Pesare il campione su una scala di precisione e registrare il peso del campione (m_S). Determinare il peso di piccoli campioni di tessuto con l'approssimazione di mg (Figura 1A).
   5. Posizionare un bicchiere riempito con soluzione fisiologica 0,9% temperatura sulla scala. Non riempire completamente il becher, per consentire un'immersione del campione del tessuto nel passaggio successivo senza fuoriuscirne.
      Attenzione: Usare una dimensione di Becher appropriata per le dimensioni e peso del tessuto il campione da misurare e la gamma di misurazione effettiva della scala. Per i più grandi campioni fino a 2 x 2 x 2 cm³, una dimensione di Becher di 50 – 100 mL è appropriata in combinazione con una scala di misura da circa 100 mg a 500 g, mentre per i piccoli campioni, utilizzare bicchieri di 5 – 10 mL di volume in combinazione con bilance di precisione con campi di misura tra circa 0,1 mg e 20 g.
   6. Immergere il portacampioni (cioè, un ciclo sufficientemente rigido di filo sottile o qualcosa di simile, Figura 2A) in saline a una posizione contrassegnata (frecce in Figura 1B, Figura 2Be Figura 2). Quindi, reimpostare (Tara) la visualizzazione della scala a zero.
   7. Fissare con attenzione il campione di tessuto per il portacampioni e immergere completamente il campione in saline fino a raggiungere la posizione segnata sul supporto del campione (frecce in Figura 1B, Figura 2Be Figura 2).
      Attenzione: Il campione sommerso e il supporto del campione non deve avere contatto con le pareti interne o il fondo del bicchiere o la superficie delle saline.
   8. Tenendo il supporto del campione e il campione sommerso in quella posizione, registra il peso visualizzato sulla scala (m._L), facendo riferimento al peso di salino spostata dal campione di tessuto (Figura 1 C, Figura 2B, e Figura 2).
   9. Calcolare il volume del campione (V_S) da m._Le la densità della soluzione fisiologica a temperatura ambiente (20 ° C) (ρ_Salina = 1,0048 g/cm ³) come V_S = m_L/ Ρ_Salina [g/g/cm ³] (Figura 1).
   10. Calcolare la densità del campione tessuto (ρ_campione) da (cioè, massa) il peso del campione (m_S) e il suo volume (V_S): _campione ρ = m_S /V_S[g/cm ³] (Figura 1).
   11. Per organi misurati in toto, ripetere la misurazione tre volte e calcolare la densità media dell'organo dai valori di misurazione singola. Per i grandi organi/tessuti, eseguire misurazioni ripetute con diversi campioni del compartimento stesso organo/tessuto/organo e calcolare la densità media da singole misurazioni, di conseguenza.
   12. Calcolare il volume totale del vano organo/tessuto/organo dal suo peso e la densità (Figura 1).
2. Applicazione del Cavalieri-metodo per la determinazione dei volumi di organo di suino ⁷
   1. Preparare i materiali: righello, pinza, coltello, forbici, pinze, pennarello, plastica lucidi, scanner, foto fotocamera e croce griglie stampate su plastica lucidi.
   2. Posizionare l'intero organo/tessuto su una superficie piana (base di taglio) e misurare la lunghezza (l) dell'organo lungo il suo asse longitudinale (Figura 3B, Figura 5A).
   3. Tagliare l'organo/tessuto completo a fette paralleli equidistanti ortogonale all'asse longitudinale dell'organo (Figura 3, figura 5B). Scegliere una distanza d tra due sezioni sufficientemente piccoli per ricevere un numero sufficiente di tessuto/organo lastre (cioè, lo spessore di sezione intervallo/sezionamento, solitamente circa 1 cm). Posizionare in modo casuale la prima sezione a distanza tra 0 e l'intervallo di taglio dal margine dell'organo. Mentre affettare, giudicare visivamente la posizione e l'orientamento di ogni piano di sezione, per ottenere lastre di circa parallelo organo/tessuto di spessore uniforme.
      Nota: Il numero necessario di tessuto/organo lastre dipende la forma e la dimensione del organo/tessuto esaminato. Se piccoli organi o campioni devono essere sezionato in lastre sottili di ≤ 5 mm, incorporare i campioni in agar prima del sezionamento (v. punto 1.3.3) e utilizzare un dispositivo tecnico per affettare del campione incorporato agar. Intervalli di sezionamento empiricamente raccomandabili per suini più organi e tessuti, così come esempi per i dispositivi di sezionamento, sono indicati nel materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"⁷.
   4. Posizionare tutte le lastre di organi/tessuti sulla stessa superficie rivolta verso il basso (vale a dire, sempre sulla destra o il piano di sezione a sinistra di ogni lastra di organo, Figura 3D, Figura 5) sulla base di taglio e contare le lastre (n).
   5. Ottenere profili di sezione delle lastre del tessuto da uno dei seguenti approcci:
      1. Posizionare le lastre di tessuto su adeguatamente etichettati plastica lucidi, mantenendo l'orientamento delle loro superfici di sezione superiore e inferiore. Tracciare i contorni delle lastre del tessuto sui lucidi plastica utilizzando un pennarello (3E figura1-2).
      2. Prendere immagini fotografiche delle lastre del tessuto, tenendo la fotocamera in posizione verticale sopra le superfici di sezione (Figura 3F). Per la calibrazione, posizionare un righello di dimensioni accanto le lastre di tessuto.
      3. Scansione delle lastre di tessuto su uno scanner piano mantenendo l'orientamento delle loro superfici di sezione superiore e inferiore (Figura 3). Per la calibrazione, posizionare un righello di dimensioni accanto le lastre di tessuto.
   6. Misurare le aree dei profili (tracciati, fotografati o digitalizzato) sezione di tutte le lastre di tessuto da uno dei seguenti approcci:
      1. Sovrapposizione o sovrapporre i profili di lastra organo tracciata con una griglia di dimensione appropriate, calibrato di ugualmente distanziati croci stampato su una plastica trasparenza e conteggio tutti attraversa colpendo la zona di profilo (Figura 3E3-4; confronta con Figura 5). Calcolare l'area di sezione di profilo di ogni lastra di organo moltiplicando il numero di croci colpendo la zona di profilo nell'area corrispondente a una croce.
         Nota: Per ricevere il volume sufficientemente preciso stima, scegli una griglia incrociata con una distanza sufficientemente piccola tra croci adiacenti, così che una media di almeno 100 attraversa colpirà le superfici di sezione delle lastre di un organo in ogni caso esaminato dello studio . Il materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"⁷sono indicate dimensioni empiricamente raccomandabile griglia trasversale per suini più organi e tessuti.
      2. Misurare le aree delle lastre del tessuto nelle immagini digitali delle foto/scansioni utilizzando appropriato disponibile in commercio o freeware morfometria morbido - e applicazioni hardware (Figura 3 H), ad esempio un'immagine commerciale analisi sistema²¹, o ImageJ²².
         Attenzione: Nota che una lastra di tessuto (il primo o l'ultimo) viene inserito nello scanner che riposa sulla sua superficie naturale, rispettivamente, rivolto verso la videocamera con la superficie naturale. Pertanto, la scansione di immagine, l'immagine della foto di questa lastra, non mostrerà una superficie di sezione. Di conseguenza, nessun profilo di zona di sezione viene misurato nell'immagine immagine/foto digitalizzata di questa lastra di tessuto (Figura 3I). Anche la sovra-proiezione nota presente in immagini digitalizzate e fotografie di lastre di organi/tessuti, cioè, solo misurare le aree dei profili sezione effettiva, ma non del tessuto nell'immagine che si trova dietro la superficie di sezione di solaio (Figura 12 G-H).
   7. Calcolare il volume stimato dell'organo come il prodotto della somma di tutte le aree di sezione di profilo corrispondente di tutte le lastre di tessuto per caso (cioè, sempre di destra o sinistra, rispettivamente, la superficie di sezione superiore o inferiore di ogni organo della lastra e lo spessore medio delle lastre (cioè, il quoziente della lunghezza misurata sull'asse verticale dell'organo (l) e il numero di lastre)¹⁵.
3. Determinazione del grado di restringimento del tessuto tridimensionale incorporamento-correlate durante l'elaborazione dei campioni di tessuto per istologia
   1. Preparare i materiali: microtomo lame, forcipe, agar, stampi di colata del metallo, scanner digitale e dimensioni righello (ad es., carta millimetrata).
   2. Tagliare una superficie di sezione piana fresco, da un campione di tessuto fisso.
      Nota: Se facilmente utilizzando campioni di tessuti (molli) deformabili (tessuto grasso, tessuti gelatinosi), incorporare il campione di tessuto fisso in agar prima del taglio (Figura 4A).
   3. Per incorporare campione in agar:
      1. Mescolare polvere di agar standard come usato per mezzo di coltura di microbiologia con un volume adeguato di acqua (circa 0,5 – 1 g agar/10 mL di acqua) in un becher di vetro. Mescolate il composto e scaldarla nel forno a microonde a 700 W fino a ebollizione per 3 – 5 s. mescolare il composto e far bollire ancora per 3 – 5 s.
      2. Facoltativamente, per aumentare il contrasto dell'agar per il campione di tessuto, tingere l'agar liquido, per esempio, con inchiostro nero (aggiungere 1 mL di inchiostro a 10 mL di agar di liquido caldo e mescolare energicamente).
      3. Versare l'agar caldo in uno stampo di colata (ad esempio, uno stampo di metallo utilizzato per paraffina incorporamento, Figura 10A-D) e immergere il campione di tessuto fisso nell'agar caldo. Lasciate che l'agar raffreddare fino a solidificazione, rimuovere la muffa e tagliare il blocco di agar con il tessuto incorporato utilizzando un microtomo o una lama di rasoio.
         Attenzione: Durante la manipolazione di agar liquido caldo, indossare guanti e occhiali protettivi. Processo tessuto campioni fissati in soluzione di formaldeide sotto uno scarico cappa e indossano occhiali protettivi e guanti da laboratorio.
   4. Posizionare il campione con la sua superficie di sezione rivolto verso il basso su uno scanner piano, insieme a un righello di dimensioni e la superficie di sezione (fig. 4AB) la scansione.
   5. Determinare l'area della superficie di sezione del campione tessuto fisso (una_f) durante la scansione digitale, utilizzando una delle tecniche descritte nel punto 1.2.6 (Figura 4B).
   6. Incorporare il campione in plastica mezzo di inclusione, come la resina epossidica (ad es., Epon) o glycolmethacrylate/metilmetacrilato (GMA/MMA)²³, seguenti protocolli standard^23,24,25 ( Figura 4). Assicurarsi che la superficie di sezione del campione fisso analizzato nel passaggio precedente (1.3.4) viene mantenuta nel campione di plastica incorporato.
      Nota: Per mantenere l'orientamento della superficie sezione del campione durante l'elaborazione del campione, costantemente il campione viene posto con la sua superficie di sezione desiderato rivolto verso il basso verso la cassetta incasso o lo stampo di colata o contrassegnare la sezione desiderata superficie (o dalla parte opposta del campione) con inchiostro.
   7. Tagliare una sezione istologica da plastica blocco corrispondente alla superficie di sezione originale del campione tessuto fisso (passo 1.3.2) usando un microtomo (Figura 4), montare la sezione su un vetrino (Figura 4) e macchiarlo ordinariamente ( ad esempio, ematossilina ed eosina macchia, H & E)^24,25.
      Attenzione: Per ricevere una sezione istologica approssimativamente nello stesso piano della superficie di sezione originale del campione tessuto fisso, regolare con cura la posizione del blocco di plastica sul Monte del microtomo prima di sezionamento.
   8. Porre il vetrino con la sezione macchiata rivolto verso il basso su uno scanner piano con un righello di dimensione e la scansione della sezione (Figura 4E).
   9. Determinare l'area della sezione del campione di tessuto di plastica (A_e) nella scansione digitale, utilizzando una delle tecniche descritte nel passaggio 1.2.6 (Figura 4F).
   10. Calcolare il restringimento del tessuto medio incorporamento-correlati (per i rispettivi tessuti e mezzo di inclusione) dalle aree misurate dei corrispondenti profili di sezione dei campioni di tessuto prima e dopo l'incorporamento in plastica mezzo di inclusione. Il fattore di ritiro lineare f_s viene calcolata come la radice quadrata del quoziente delle zone dei profili sezione dei campioni di tessuto n dopo l'incorporamento in plastica incorporamento medio (A_e) e le zone della profili di sezione corrispondente dei campioni di tessuto stesso prima di incorporare in plastica montante (una_f) (Figura 4)¹⁴.

2. volume-weighted campionamento casuale sistematico di punto di conteggio e l'elaborazione dei sottocampioni di tessuto per diversi tipi di analisi a valle⁷

1. Preparare i materiali: righello, pinza, coltello, forbici, pinze, pennarello, punto/croce griglie stampate su plastica lucidi e tabelle di numero casuale.
   Nota: Modelli di copia per croce griglie (5-60 mm) sono disponibili nel materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"⁷.
2. Posizionare l'organo/tessuto su una superficie piana (base di taglio) e misurare la lunghezza (l) dell'organo lungo il suo asse longitudinale (Figura 5A, Figura 6A).
3. Tagliare l'organo/tessuto completo a fette paralleli equidistanti ortogonale al suo asse longitudinale (figura 5B). Scegliere una distanza d tra due sezioni (cioè, l'intervallo/spessore di sezionamento, solitamente circa 1 cm) abbastanza piccoli per ottenere un numero sufficiente di fette di tessuto/organo. Posizionare in modo casuale la prima sezione a distanza tra 0 e l'intervallo di taglio dal margine dell'organo. Mentre affettare, giudicare visivamente la posizione e l'orientamento di ogni piano di sezione per ottenere lastre di approssimativamente parallelo organo/tessuto di spessore uniforme.
   Nota: Il numero di lastre di tessuto/organo necessario dipende dalle dimensioni dell'organo/tessuto esaminato e il numero delle posizioni dei tessuti campionati. Se piccoli organi o campioni devono essere sezionato in lastre sottili di ≤ 5 mm, incorporare i campioni in agar prima del sezionamento (v. punto 1.3.3) e utilizzare dispositivi tecnici per affettare del campione incorporato agar. Intervalli di sezionamento empiricamente raccomandabili per suini più organi e tessuti, così come esempi per affettare dispositivi sono indicati nel materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"⁷.
4. Posizionare tutte le lastre di organi/tessuti sulla stessa superficie rivolta verso il basso sulla base di taglio (Figura 6B).
5. Sovrapposizione delle lastre di tessuto con una griglia di dimensione appropriate Croce stampate su una trasparenza plastica inserendo più esterno sinistra superiore trasversale della griglia sopra un punto casuale fuori il tessuto (Figura 5-D, Figura 6B).
   Nota: Scegliere una griglia incrociata con una distanza sufficientemente piccola tra croci adiacenti, in modo che in ogni caso esaminato dello studio, almeno due volte come molte croci colpirà le superfici di sezione del vano del tessuto da sottoporre a campionamento, come il numero di campioni che devono da quello scompartimento del tessuto prelevato. Il materiale supplementare del "Tessuto campionamento guide per suini biomedica modelli"⁷sono indicate dimensioni empiricamente raccomandabile griglia trasversale per suini più organi e tessuti.
6. Mark e conteggio di tutte le croci che colpisce il tessuto (rispettivamente, il tessuto sub-vano da campionare). Applicare in modo coerente una modalità uniforme di conteggio e numerazione delle croci colpendo il vano del tessuto da campionare in tutte le lastre di tessuto, per esempio, di numerazione delle rispettive croci in ciascuna riga per riga, da sinistra a destra e da dall'alto in basso, o, per esempio, numerando le croci in lastra di tessuto uno dopo l'altro in senso orario, a partire con la croce più vicina alla posizione 12, come esemplarmente dimostrato in Figura 5E.
7. Dividere il numero di croci colpendo il vano del tessuto/tessuto per essere inclusi nel campione (n) per il numero di campioni deve essere generato per ottenere l'intervallo di campionamento sistematico (i).
8. Determinare la posizione di campionamento prima scegliendo un numero casuale x nell'intervallo compreso tra 1 e io. Per questo, utilizzare una tabella di numeri casuali. Contrassegnare la prima posizione di campionamento (x) e ogni successivo x + i, x + 2ho, x + 3i, ecc., cross colpendo il vano del tessuto/tessuto da sottoporre a campionamento sulla trasparenza in plastica utilizzando un pennarello (Figura 5F).
   Nota: Tabelle numero casuale possono essere comodamente e rapidamente generate utilizzando un generatore di numeri casuali online.
9. Tag il tessuto percorsi corrispondenti per il marcato attraversa sollevando leggermente la trasparenza plastica e posizionando un piccolo pezzo di carta coriandoli pulito, vuoto sulla superficie della lastra del tessuto usando un paio di pinzette (Figura 5, Figura 6E ).
10. Recidere dei campioni di tessuto dai percorsi campionati (Figura 5 H, Figura 6F, figura 7A) e suddividere ulteriormente le loro per diversi tipi di analisi successive (Figura 6, figura 7A-B), come specificato nella Tabella 1.
11. Dopo il campionamento, pulire i lucidi in plastica con acqua tiepida e sapone, asciutto e riutilizzarli.

3. generazione di sezioni casuale uniforme isotropo (IUR) e verticale uniforme casuale (RVU) per analisi Quantitative stereologiche

1. Tecnica di "Isector"
   1. Preparare i materiali: lame di rasoio o microtomo, agar, stampi di colata sferica (ad es., stampi pressofusione di praline, che possono essere ottenuti dai fornitori di dolciumi), foldback morsetti e pinze.
   2. Posizionare un pezzo adeguatamente dimensioni (1 x 1 x 1 cm³) di fisso, sistematicamente in modo casuale a campionamento del tessuto in uno stampo di colata sferica, tenere insieme di foldback morsetti e riempite lo stampo con agar liquido caldo (Figura 8A-E).
   3. Rimuovere la sfera di agar (Figura 8F) dallo stampo colata dopo la solidificazione dell'agar.
   4. Rotolare la sfera di agar con il campione di tessuto incorporato attraverso la tavola, interrompere e nella sezione in una posizione casuale.
      Nota: Il piano di sezione risultante è una sezione IUR (Figura 8F-G).
   5. Procedere per incorporare il campione di tessuto in resina plastica come GMA/MMA, mantenendo l'orientamento della sezione IUR aereo (Vedi 1.3.5).
2. Tecnica di "Orientatore"
   1. Preparare i materiali: lame di rasoio o microtomo, agar, forcipe, / e di numero casuale, stampe dei cerchi equiangoli e ponderati per il coseno.
      Nota: Modelli di copia dei cerchi sono forniti in precedenti pubblicazioni^8,26.
   2. Posizionare il campione di tessuto fisso (o di tessuto fisso agar) su una stampa di un cerchio equiangolo con un bordo parallelo 0-180 ° direzione (Figura 9A, Figura 10E).
   3. Determinare un angolo casuale utilizzando la tabella dei numeri caso. Trovare i segni corrispondenti alla scala del circolo equiangolo, che il campione si basa su. Usando questi segni, tagliare una sezione attraverso il campione (o l'agar che circondano il campione di tessuto incorporato), con il piano di sezione viene orientato parallelamente alla direzione dell'angolo casuale indicata sulla scala del circolo equiangolo e verticale per la superficie del campione (figura 9B-C, Figura 10F) di riposo.
   4. Posizionare il blocco di tessuto con la superficie di sezione generata nel passaggio precedente inconveniente su un cerchio ponderati per il coseno di fronte con il bordo del piano d'appoggio posizionato parallelamente alla direzione di 1-1 (Figura 9, Figura 10 H).
   5. Ripetere il punto 3.2.3 e tagliare una nuova sezione attraverso il campione ad angolo casuale determinato utilizzando la tabella dei numeri caso (Figura 9E-F, Figura 10I-J).
      Nota: Il piano di sezione risultante è una sezione IUR.
   6. Se del caso, determinare l'area del profilo sezione IUR del campione tessuto fisso per la determinazione del restringimento incorporamento-relative del tessuto (Figura 9-J) come descritto al punto 1.3 e procedere per incorporare il campione di tessuto in plastica resina ad esempio GMA/MMA.
3. Generazione delle sezioni verticale uniforme casuale (RVU)
   1. Preparare i materiali: lame di rasoio o microtomo, agar, forcipe, / e di numero casuale e stampe di cerchi equiangoli.
      Nota: Modelli di copia dei cerchi sono forniti in precedenti pubblicazioni^8,26.
   2. Definire un asse verticale all'interno del campione di tessuto fisso che è sempre riconoscibile nelle sezioni/campione durante le fasi successive.
      Nota: In genere, l'asse verticale per la superficie naturale del campione di tessuto viene scelto come l'asse verticale.
   3. Se appropriato, è possibile incorporare il campione in agar (Figura 11B).
      Nota: Prima del VUR - o IUR-sezionamento del campione fisso Agar-incorporamento è generalmente raccomandabile per campioni piccoli, sottili, fragili o morbidi. Anche utilizzare agar-incorporamento di campioni per facilitare il posizionamento del campione VUR sezionato durante l'incorporamento successive del campione nel terreno di resina plastica.
   4. Il campione viene posto su una stampa di un cerchio equiangolo, con l'asse verticale essendo orientato ortogonalmente al piano del tavolo tavolo/carta (Figura 11).
   5. Tagliare il campione ad angolo casuale (determinato utilizzando una tabella di numeri casuale) con il piano di sezione ortogonale al tavolo e parallelo all'asse verticale di ricevere un piano di sezione VUR (Figura 11).
   6. Se del caso, determinare l'area del profilo sezione IUR del campione tessuto fisso per la determinazione della contrazione tessuto incorporamento-correlati come descritto al punto 1.3 (confronta Figura 9-J) e procedere per incorporare il campione di tessuto in resina plastica quali GMA/MMA.

Risultati

Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo

Figura 12A -B Mostra il rappresentanza determinazione della densità e il volume di un rene porcino usando la tecnica di immersione descritta nel passaggio 1.1 (Figura 1, Figura 2). Risultati più rappresentativi delle misurazioni di densità di suini ult...

Discussione

Generazione di biobanca campionari da modelli animali suine richiede tecniche robuste ed i protocolli per la determinazione dei volumi di organi/tessuti, la generazione riproducibile del rappresentante, campioni di tessuto ridondante adatti per una vasta gamma di metodi di analisi diversi e per la randomizzazione dell'orientamento delle sezioni del campione per analisi stereologiche quantitative. I metodi descritti nel presente articolo sono adattati alle dimensioni dei suini organi e tessuti e sono stati sviluppati per ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Carl Roth GmbH, Germania	Agar (polvere), Cat.: 5210.3	Sciogliere circa 1 g di agar in 10 ml di acqua fredda in un becher di vetro o plastica, scaldare in forno a microonde a 700 W, far bollire la soluzione due volte mescolando rigorosamente. Versare nello stampo ancora caldo e lasciare solidificare. Attenzione: Durante la manipolazione con agar liquido caldo, indossare occhiali e guanti protettivi.
Pinza	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germania	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Qualsiasi tipo di pinza (meccanica o elettronica) va bene.
Stampi per colata (metallo)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, Germania	Einbettschä Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Qualsiasi altro tipo di stampo per colata di metallo utilizzato per l'inclusione di paraffina andrà bene.
Copie di modelli di griglie a croce (5mm - 6 cm)	n.a.n.a.Copie		di modelli di griglie a croce (5mm - 6 cm) sono forniti nel file di dati supplementari di Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Modelli di copia di cerchi equiangolari e pesati per il coseno	n.a.n.a.I		modelli di copia di cerchi equiangolari e ponderati per il coseno sono forniti in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek e Rousseaux´ s Manuale di patologia tossicologica. 3a ed., 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Morsetti pieghevoli (clip per raccoglitori YIHAI, 15 mm e 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., Cina	Y10006 e Y10005	Andrà bene anche qualsiasi altro tipo di morsetti pieghevoli standard per ufficio.
Pinza (anatomica)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germania	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Qualsiasi tipo di pinza anatomica va bene.
Soluzione di formaldeide 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germania	Formaldeide 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Diluire al 4% da soluzione concentrata. Tampone a pH neutro. Indossare un'adeguata protezione per occhi, mani e vie respiratorie. Processare campioni di tessuto fissati in soluzione di formaldeide sotto una cappa di aspirazione e indossare occhiali protettivi e guanti da laboratorio.
Carta millimetrata (per calibrazione)	Bü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Germania. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Qualsiasi tipo di carta millimetrata (in scala millimetrica) va bene.
Bicchieri da laboratorio (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germania	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Qualsiasi tipo di bicchiere in vetro o plastica da 5 – 100 ml di volume va bene.
Bilancia da	laboratorioMettler Toledo GmbH, Gieß en, Germania	PM6000	Qualsiasi bilancia da laboratorio standard con intervalli di misurazione compresi tra 0,1 mg e circa 20 g, rispettivamente tra 100 mg e circa 500 g andrà bene
	Sartorius AG, Gö ttingen, Germania	BP61S
	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, Germania	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Qualsiasi tipo di lame per microtomo monouso andrà bene.
Morfometria / software / sistema di planimetria	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Scarica da https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germania	di		analisi delle immagini VideoplanTM
	Nikon	D40	Va bene qualsiasi tipo di fotocamera digitale che può essere montata su un treppiede.
Lucidi in plastica	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germania	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Qualsiasi trasparenza in plastica stampabile (al laser) andrà bene.
	tabelle dei numeri casuali possono essere convenientemente generate (con numeri definiti di numeri casuali ed entro intervalli definiti), utilizzando generatori di numeri casuali, come ad esempio: https://www.random.org/
Lame di rasoio	Plano GmbH, Wetzlar, Germania	T5016	Qualsiasi tipo di lamette da barba andrà bene.
Righello	Bü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Germania. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, trasparente, Cat.: ln30	Va bene anche qualsiasi tipo di righello in scala cm-mm.
Soluzione salina (0,9%)	Carl Roth GmbH, Germania	Cloruro di sorio, >99% Cat.: 0601.1	Per preparare soluzione fisiologica allo 0,9%, sciogliere 9 g di NaCl in 1000 ml di acqua distillata a 20°C.
Lame per bisturi	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germania	Lame chirurgiche BRAUN N° 22	Qualsiasi tipo di lama di bisturi andrà bene.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Qualsiasi tipo di scanner da ufficio standard in grado di scansionare con risoluzioni da 150-600 dpi andrà bene.
Esempi		di dispositivi di affettatura autocostruiti possono essere trovati in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) e nel file di dati supplementari di Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Stampi per colata sferica (ad es. in diametro 25,5 mm)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germania	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25,5 mm	stampi per colata sferica possono anche essere autocostruiti o ottenuti da altri fornitori di dolciumi (per praline). Gli stampi di colata qui indicati sono in realtà l'imballaggio/avvolgimento di impasti di praline cave (prima mangia le praline e poi utilizza la confezione per la generazione di sezioni del settore i)
Filo sottile	Basteln & Hobby Schobes, Straß lontano, Germania. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Qualsiasi altro tipo di filo sottile va bene.
Carta velina	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germania	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Qualsiasi altro tipo di carta velina da laboratorio va bene.
Penna a tenuta stagna	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nü rnberg, Grmany	Lumocolor permanente 313, 0,4 mm, S, nero, Cat.: 313-2	Qualsiasi altro tipo di penna impermeabile va bene.