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Articolo metodologico

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

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⸱

DOI:

10.3791/57279

⸱

3 aprile 2018

 ,  ,  , 
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Abstract

L'articolo viene illustrato come implementare l'analisi di indice di LD, che è un test sensibile micropiastra per determinare l'accumulo di trigliceridi (tag) in goccioline del lipido (LDs). Indice di LD è ottenuto senza estrazione lipidica. Esso permette di misurare il contenuto di LDs negli esperimenti di alto-rendimento in condizioni diverse, come la crescita in ricchi o media di azoto impoverito. Anche se il metodo è stato descritto per la prima volta di studiare il metabolismo di gocciolina del lipido in Saccharomyces cerevisiae, è stato applicato con successo per il basidiomicete Ustilago maydis. Interessante, e perché LDs sono organelli filogeneticamente conservati nelle cellule eucariotiche, il metodo può essere applicato a una grande varietà di cellule, da lievito per cellule di mammifero. L'indice di LD è basato sull'analisi di recupero liquido di fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 in condizioni di tempra, con l'aggiunta di cellule fissato con formaldeide. Lo iodio potassio è usato come un quencher di fluorescenza. Il rapporto fra la fluorescenza e i pendii di densità ottica è denominato indice di LD. Piste sono calcolate da linee rette ottenute quando BODIPY fluorescenza e densità ottica a 600 nm (OD600) vengono confrontate con aggiunta dei campioni. Qualità ottimale dei dati si riflette dai coefficienti di correlazione pari o sopra 0,9 (r ≥ 0,9). Campioni multipli possono essere letti contemporaneamente, poiché può essere implementata in una micropiastra. Poiché BODIPY 493/503 è un fluorescente lipofilico tingere che partizioni nelle gocce di lipidi, può essere utilizzato in molti tipi di cellule che si accumulano LDs.

Introduzione

Le goccioline del lipido (LDs) sono corpi grassi intracellulari onnipresenti composti da un nucleo di lipidi neutri, principalmente tag ed esteri dello sterolo (SE). Il nucleo è circondato da un monostrato di fosfolipidi che interagisce con le proteine come perilipina ed enzimi coinvolti nella sintesi di lipidi neutri, come il diacilglicerolo acil-transferasi, acetil-CoA carbossilasi e acil-CoA sintasi1. A causa del suo comportamento dinamico, strato monomolecolare del fosfolipide contiene anche triacilglicerolo lipasi che idrolizzano tag e SE2. A seconda del tipo di cellula e l'organismo, stored lipidi neutri possono essere utilizzati per generare energia, o sintetizzano fosfolipidi e molecole di segnalazione. In lieviti e altri funghi, il contenuto di LDs cambia in risposta a variazioni nel rapporto carbonio/azoto in terreni di coltura, che indica che la disponibilità di azoto in diminuzione potrebbe essere la chiave per aumentare la produzione di lipidi neutri3,4 ,5. La produzione di elevate quantità di tag in lievito ha un potenziale impiego in biotecnologia come fonte di biocarburanti e nell'industria alimentare. Alcuni lipidi stored contengono proporzioni elevate degli acidi grassi polinsaturi, come omega 3 e omega 6, con dietetica e nutrizionale 6,7,8,9,10 , 11. LDs di cellule di mammiferi, tra cui le cellule umane, anche contenere tag ed esteri del colesterolo. Il monostrato di fosfolipide interagisce con i mammiferi omologo delle proteine descritto nel lievito LDs e con una proteina supplementare, Perilipina, che è assente in S. cerevisiae12. Una proposta di ruolo per il monostrato di fosfolipidi e le proteine associate è per stabilizzare la struttura LDs e consentire l'interazione di LDs con organelli come mitocondri, reticolo endoplasmatico, peroxisomes e vacuoli, principalmente per lo scambio dei lipidi 13,14. È interessante notare che, negli esseri umani, LDs sembrano essere coinvolti in patologie come il diabete di tipo 2, aterosclerosi, steatoepatite e malattia coronarica, in cui vi è un aumento nel loro numero di 15,16,17 . Alcuni tipi di virus utilizzano LDs come piattaforme per assemblare i virioni 2,18,19.

Dovuto le implicazioni della SSL in patologie umane e loro potenziale utilizzo biotecnologica, l'esatta determinazione sperimentale della formazione di LDs è un compito importante. Questo articolo descrive un'analisi affidabile basata sul recupero della fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), per ottenere un valore relativo del contenuto di lipidi neutri in cellule. Con questa analisi, è possibile seguire le dinamiche dell'accumulo di lipidi neutri in funghi come U. maydis e S. cerevisiaee anche in cellule di mammifero, senza la necessità di lipidi estrazione 20. Il metodo è stato applicato per la prima volta in S. cerevisiae per identificare le proteine fosfatasi e chinasi coinvolte nella regolazione del metabolismo dei lipidi. Ciò era possibile senza estrazione dei lipidi o proteine purificazione21,22. LFR è stato utilizzato anche per stabilire le dinamiche di formazione di LDs in macrofagi peritoneali23. L'uso di BODIPY 493/503 ha alcuni vantaggi rispetto ad altri coloranti di lipidi neutri come Nilo rosso. BODIPY 493/503 è altamente specifico per lipidi neutri e con uno spettro di emissione stretto, facilitando la rilevazione simultanea di segnali da coloranti come proteina fluorescente rossa o Mito-Tracking, quando i campioni sono analizzati mediante microscopia confocale. Purtroppo, BODIPY 493/503 è sensibile al photobleaching, ma questo processo può essere evitato utilizzando un reagente antiquenching durante l'esposizione a luce24.

Per eseguire il test LFR in cellule di lievito, che vengono allevati nelle condizioni nutrizionali desiderate, e le aliquote siano revocate in momenti diversi. Successivamente, le cellule sono fissate con formaldeide, che preserva l'integrità della LDs per mesi quando le cellule sono conservate a 4 ° C. Altre tecniche di fissaggio dovrebbero essere evitati, soprattutto quelli che utilizzano metanolo o acetone freddo, poiché conducono alla degradazione di LDs nelle cellule24. Per misurare l'indice di LD, formaldeide-fisso cellule sono sospese in acqua per ottenere una concentrazione definita. Quindi, vengono aggiunti a una soluzione che contiene il fluoroforo BODIPY 493/503 bonificato di KI, e quando il fluoroforo entra nella cella e associa il LDs, c'è una ripresa della sua fluorescenza. Concomitante alla misurazione della fluorescenza (485 nm/510 nm), la concentrazione di cellule è quantificata misurando la densità ottica a 600 nm. Ogni campione viene letto quattro volte con l'aggiunta di successivi 5 aliquote µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso per lo stesso bene. Spazii in bianco di fluorescenza e di assorbanza sono acquisite prima dell'aggiunta delle cellule. La qualità della fluorescenza e i dati di assorbanza sono valutati determinando la linearità delle misurazioni: se r < 0,9, i dati vengono eliminati. Il valore di r è importante perché fondamentalmente l'intensità della fluorescenza deve produrre una risposta lineare a concentrazioni crescenti di cella. Se la concentrazione delle cellule è troppo alta, la linearità viene persa. Il dosaggio LFR fornisce un metodo veloce, semplice ed economico per selezionare il fenotipo desiderato di LD in esperimenti di alto-rendimento. Dopo aver selezionato le condizioni desiderate, il contenuto di LD di singole celle possa essere studiato mediante microscopia confocale, utilizzando le stesse cellule di formaldeide-fisso macchiate con BODIPY, fornendo un'immagine di LDs nella cella. Tag e il loro contenuto SE ora può essere ulteriormente analizzati mediante cromatografia su strato sottile.

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Protocollo

1. preparazione del buffer e soluzioni

  1. Per preparare 1 L di fosfato tampone (PBS, pH 7), sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7.0 con HCl e poi aggiungere acqua per un volume finale di 1 L. PBS può essere fatto come una soluzione di riserva di 10x e conservato a temperatura ambiente.
  2. Per preparare 10 mL di soluzione di fissaggio, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% o 9 mL di PBS per raggiungere una concentrazione finale del 3,7%. Preparare la soluzione prima dell'uso.
    Attenzione: Utilizzare guanti per gestire la soluzione di formaldeide.
  3. Per preparare la soluzione di tempra (500 mM), sciogliere 8,3 g di KI in 100 mL di acqua distillata. Preparare questa soluzione prima dell'uso e conservarle a temperatura ambiente.
  4. Per preparare la soluzione di riserva di BODIPY 10 mM, sciogliere 10 mg di BODIPY 493/503 in 3,8 mL di solfossido dimetilico (DMSO). Mantenere le aliquote di 100 µ l al buio a-70 ° C.
  5. Per preparare la soluzione di BODIPY 5 µM-tempra, aggiungere 1 µ l di 10 mM BODIPY 493/503-2 mL di 500 mM tempra di soluzione. Per il dosaggio LFR, una concentrazione finale di 5 µM di BODIPY è richiesta.
  6. Per preparare la soluzione minerale, aggiungere 0,06 g di H3BO3, 0,14 g di MnCl2-4 H2O, 0,4 g di ZnCl2, 0,04 g di Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g di FeCl3-6 H2O e 0,4 g di CuSO 4-5h2O a 1 L di acqua distillata.
  7. Per preparare la soluzione di sale, aggiungere 16 g di KH2PO4, 4 g di Na2modo4, 8 g di KCl, 2 g di MgSO4, 1 g di CaCl2e 8 mL di soluzione minerale a 1 L di acqua distillata.
  8. Per preparare il terreno minimo senza una fonte di azoto per U. maydis FB2 (a2b2), aggiungere 10 g di glucosio e 62,5 mL di soluzione salina a 1 L di acqua distillata, secondo Holliday, et al. 31. aggiustare il pH a 7.0 e quindi versare 100 mL di media in matracci da 250 mL e sterilizzarli. Sterilizzare in autoclave per 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) il ciclo liquido o filtro.
  9. Per preparare il mezzo di lievito peptone destrosio (YPD), aggiungere 5 g di lievito estratto, 2,5 g di peptone, e 5 g di glucosio a 1 L di acqua distillata. Dispensare 100 mL della soluzione in matracci da 250 mL e sterilizzarli. Sterilizzare in autoclave per 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) il ciclo liquido o filtro.

2. cultura condizione e fissazione delle cellule

Nota: Conservare la struttura di LDs fissando le cellule appena possibile. Il fissaggio può essere fatto in microcentrifuga. Celle fisse possono essere mantenute a 4 ° C fino ad un mese se la disidratazione è evitata lasciando un sottile strato d'acqua.

  1. U. maydis cellule in condizioni di coltura crescere pertinenti per lo studio. Avviare la cultura con un iniziale OD600 di 0.05 (1,15 × 106 cellule / mL). Incubare le cellule a 28 ° C, 180 giri/min per 24 h. Un OD600 di 1 corrisponde a 2,3 × 107 cellule / mL.
  2. Ai selezionati volte, prelevare un'aliquota delle cellule. Per U. maydis, prelevare 5 mL ogni 2 h durante le prime 8 ore. Dopo 8 ore di crescita, le aliquote di 2 mL sono sufficienti.
  3. Misurare la densità ottica a 600 nm di ciascuna aliquota.
  4. Centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C, utilizzando una centrifuga da tavolo. Scartare il surnatante.
  5. Sospendere il pellet di cellule in 1 mL di PBS-formaldeide 3,7% tampone. Incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente.
  6. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  7. Lavare il pellet di cellule due volte con un simile volume di acqua distillata (1 mL). Centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante dopo ogni fase di lavaggio.
  8. Regolare il pellet cellulare a 5 OD600 (1,15 x 108 cell / mL) con acqua distillata acqua (equazione 1).
    figure-protocol-1    Equazione 1.
  9. Conservare il campione a 4 ° C fino al suo utilizzo.

3. analisi di fluorescenza di liquido recupero (LFR)

  1. Accendere lo spettrofotometro e aprire il software di Skanlt. Fare clic su nuova sessionee scegliere Avvia e quindi Varioskan Lux. Selezionare protocollo dall'albero della sessione, immettere le impostazioni per le lunghezze d'onda di fluorescenza (eccitazione 485 nm/emissione 510 nm; densità ottica 600 nm) e scegliete guadagno automatico fotomoltiplicatore. Per larghezza di banda di eccitazione, selezionare 12 nm. Nell'ottica, seleziona top (eccitazione del campione è dalla parte superiore del pozzo).
  2. Immettere una delicata e continua agitazione (300 giri/min). Selezionare RUN piastra OUTe Pausa fino a quando l'azione dell'utente (tempo impiegato per l'aggiunta del campione nei pozzetti). Ripetere il protocollo cinque volte. Fare clic su Salva e scrivere un nome per la sessione sul Campo nome sessione. Il protocollo è ora pronto per l'analisi di campioni.
  3. Aggiungere 200 µ l della BODIPY 5 µM - estiguuto soluzione in ciascun pozzetto di una piastra 96 ben nero-chiaro inferiore.
  4. Posizionare la piastra all'interno della camera di spettrofotometro e incubare per 5 minuti a 30 ° C. Da questo punto, proteggere la piastra dalla luce quanto più possibile.
  5. Fare clic sul pulsante START e leggere la fluorescenza (eccitazione 485/emissione 510) e il OD600 corrispondente per gli spazii in bianco.
  6. Aggiungere 5 µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso ai pozzetti durante la pausa. Mescolare accuratamente i campioni con la pipetta. Mettere la piastra all'interno dello spettrofotometro e fare clic su continua. Quindi, i campioni saranno trattati secondo il protocollo progettato sopra.
  7. Ripetere tre aggiunte successive di 5 µ l di sospensione cellulare. Assicurarsi che le celle non precipitare. (Figura 1).

4. calcolo dell'indice LD

  1. Per ciascun campione in micropiastra, tracciare un grafico della fluorescenza e assorbanza contro il volume di ogni successiva aggiunta (5 punti tra cui il vuoto). In questo studio, è necessario utilizzare software Microsoft Excel per i calcoli. Per tracciare i dati, immettere il volume, fluorescenza e dati di assorbanza nella prima, seconda e terza colonna del foglio dati, rispettivamente. Quindi, selezionare tutti i dati con il cursore, fare clic su Inserisci e selezionare a dispersione (XY).
  2. Selezionare i punti per ogni linea nel grafico e inserire la rispettiva Linea di tendenza con la casella Visualizza equazione selezionata. Annotare i valori delle piste delle due linee rette, secondo l'equazione 2:
    figure-protocol-2    Equazione 2
    Dove y = fluorescenza o densità ottica, x = volume del campione (0, 5, 10, 15, 20 µ l), m = pendenza della fluorescenza o linea di densità ottica e b = intercetta.
  3. Dividere la pendenza della retta di fluorescenza dalla pendenza della linea densità ottica per ottenere l'indice di LD, equazione 3.
    figure-protocol-3    Equazione 3
    L'indice di LD corrisponde al quoziente della fluorescenza e piste di densità ottica.

5. analisi dei dati qualità

  1. Calcolare il coefficiente di correlazione di ogni linea retta: fare clic su Creazione guidata funzione (fx) e scegliete la correlazione. Se r < 0,9, scartare i dati e ripetere le letture. Se r ≥ 0.9, letture sono affidabili.

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Risultati

LFR, con BODIPY 493/503 come la sonda fluorescente è un metodo semplice e affidabile per studiare l'accumulo dinamico di LDs in U. maydis, a prescindere le condizioni di crescita. Quando le cellule sono state coltivate nel terreno di YPD, c'era un aumento nell'indice LD durante la fase esponenziale, seguito da un declino in fase stazionaria (Figura 2A). Al contrario, in cellule coltivate in fame di azoto, c'era un costante aumento nell'indice di LD i...

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Discussione

LFR è un nuovo metodo che è stato applicato per la prima volta studiare il metabolismo dei lipidi in S. cerevisiae e versioni successive è stato correttamente implementato in U. maydis20,21. Anche se l'indice di LD non dà valore assoluto dei tag accumulati nelle cellule, esso fornisce una rapida idea del contenuto lipidico delle cellule, e l'interpretazione dei dati è semplice, quando vengono confrontati con indice di LD da due o più condizioni ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a divulgazione

Ringraziamenti

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y integrados (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM) e il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo un Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-scienziati do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Abbiamo grazie QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo per la descrizione schematica. Ringraziamo il dottor Miguel Tapia Rodríguez per l'aiuto prezioso nella microscopia confocal di LDs. Desideriamo ringraziare il Dr. Bruno Bozaquel Morais per il suo lavoro pionieristico nello sviluppo della tecnica in S. cerevisiae che abbiamo adattato per U. maydis.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
SpettrofotometroVarioskan Lux lettura micropiastra multimodaleD5879Filtro 493/503 o rivelatore monocromatore
Piastra costarCorning Inc.361596 pozzetti parete nera/fondo trasparente
costarCorning Inc359896 pozzetti piastra per coltura cellulare costar
BODIPY 493/503Invitrogen/ ThermofisherD39224,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Soluzione di formaldeideSigma Aldrich252549reagente ACS, 37% in peso di H2O, contiene il 10-15% di metanolo per prevenire la polimerizzazione
Ioduro di potassioSigma Aldrich60399BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydisATCC201384Basidiomicete-Lievito
Cloruro di sodioSigma Aldrich746398reagente ACS, sale inorganico
Fosfato di potassio monobasicoSigma AldrichP0662reagente ACS
Seleziona estratto di lievitoSigma AldrichY100Miscela di aminiacidi, peptidi, idrosolubili, vitamine e carboidrati per terreni di coltura
Valigetta N-Z piùSigma aldrichN4642Idrolizzato enzimatico di caseina da latte bovino
GlucosioSigma AldrichG-8270D (+) glucosio
Pallone di SkakerPirexCLS4450250-6EAAgitatore in vetro borosiicato
SEV Mé xicoINO650V-7Agitatore orbitale
Tavolo da centrifugaEppendorf5415CMicroprovette per centrifuga
Sigma AldrichZ606340Eppendorf
Punte per pipetteAxygen scientificT-200-YPuntali universali per pipette con estremità smussata, 200 microlitri, non sterile
pipetta mLineBiohit7251308 canali, gamma di volume 5-100 uL

Riferimenti

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