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Articolo metodologico

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

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DOI:

10.3791/57283

⸱

7 maggio 2018

 ,  ,  , 
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per esporre chirurgicamente e di stabilizzare la ghiandola salivare sottomandibolare murina per videomicroscopia imaging utilizzando la microscopia intravital in posizione verticale. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre ghiandole esocrine della testa e collo regione dei topi e altri piccoli roditori.

Abstract

Ghiandola salivare sottomandibolare (SMG) è uno dei tre ghiandole salivari maggiori ed è di interesse per molti diversi campi della ricerca biologica, tra cui immunologia, oncologia, odontoiatria e biologia cellulare. La SMG è una ghiandola esocrina composto da cellule epiteliali secretive, miofibroblasti, cellule endoteliali, nervi e matrice extracellulare. Processi dinamici cellulari nel ratto e topo SMG precedentemente sono stato ripreso, principalmente utilizzando invertito sistemi multi-fotone microscopio. Qui, descriviamo un semplice protocollo per la preparazione chirurgica e la stabilizzazione di SMG murino in topi anestetizzati per in vivo imaging con sistemi di microscopio verticale multi-fotone. Presentiamo insiemi di immagine videomicroscopia rappresentativa di endogeno e trasferiti passivamente cellule fluorescenti, tra cui l'etichettatura dei vasi sanguigni o condotti salivari e generazione di seconda armonica di visualizzare collagene fibrillare. In somma, il nostro protocollo consente preparazione chirurgica delle ghiandole salivari del mouse nei sistemi di microscopia in posizione verticale, che sono comunemente usati per l'imaging intravital nel campo dell'immunologia.

Introduzione

Saliva è secreta dalle ghiandole esocrine per lubrificare il cibo, proteggere le superfici mucose del tratto orale e per fornire gli enzimi digestivi, nonché sostanze antimicrobiche1,2. Oltre alle ghiandole salivari minori sparpagliate nel submucosa orale, ci sono tre insiemi bilaterale delle ghiandole importanti identificate come parotidea, sublingual e sottomandibolare, in base alla loro posizione1,2. Cellule epiteliali a forma di piramide, organizzati in boccetta-a forma di sacs (acini) o demilunes che sono circondati dalle cellule myoepithelial e una membrana dello scantinato, secernono i componenti sierose e mucose di saliva1. Il luminal spazio stretto degli scarichi dei acini nei dotti intercalate, che uniscono nei condotti striati, fino a quando finalmente si uniscono in un unico dotto escretore1. Il dotto escretore principale della SMG è chiamato dotto di Wharton (WD) e si apre nella caruncola sublingual3,4. Il vano epiteliale SMG rappresenta pertanto una struttura altamente arborized con collettore terminale endpoint, simile ad un fascio di uva1,5,6. L'interstizio SMG è composto da vasi sanguigni e linfatici, incorporati nel tessuto connettivo7 contenente nervi parasimpatici8 e matrice extracellulare5. Ghiandole salivari normali umani e roditori contengono anche cellule T, macrofagi e cellule dendritiche9, così come le cellule di plasma che secernono immunoglobuline A (IgA) in saliva9,10. Grazie alle sue molteplici funzioni nella salute e nella malattia, il SMG è un argomento di interesse per molti campi della ricerca biologica, tra cui odontoiatria4, immunologia11, oncologia12,8di fisiologia e biologia cellulare 3.

Imaging dei processi cellulari dinamici e interazioni è un potente strumento nella ricerca biologica13,14. Lo sviluppo del tessuto profondo imaging e innovazioni inmicroscopes basato su ottica non lineare (NLO), che si basano su scattering o assorbimento di fotoni più dal campione, ha permesso di esaminare direttamente i processi cellulari in tessuti complessi13 ,15. Assorbimento di fotoni più implica la distribuzione dell'energia di eccitazione totale dai fotoni di bassa energia, quali eccitazione fluoroforo confini per il piano focale e permette così la più profonda penetrazione del tessuto con ridotta photodamage e rumore da fuori fuoco eccitazione13,15. Questo principio è impiegato da microscopia del due-fotone (14) e consente per l'imaging di fluorescenza esemplari nelle profondità di fino a 1 mm15,16. Mentre commercialmente disponibili 14 configurazioni sono diventati facile da usare e affidabile, la grande sfida per l'imaging di videomicroscopia è attentamente esporre e stabilizzare l'organo bersaglio dei topi anestetizzati, soprattutto per l'imaging delle serie di lasso di tempo. Diversi metodi per la correzione digitale deriva dopo acquisizione dati sono stati pubblicati17,18 e recentemente abbiamo sviluppato "VivoFollow", un sistema di correzione automatica, che contrasta il tessuto lento deriva in tempo reale utilizzando un computerizzato fase19. Tuttavia, è ancora fondamentale per alta qualità delle immagini per ridurre al minimo movimento del tessuto, particolarmente veloci movimenti provocati dal respiro o battito cardiaco19. Procedure di preparazione e di stabilizzazione sono state pubblicate per gli organi multipli, compreso il midollo spinale20, fegato21, pelle22, polmone23e linfonodo24. Inoltre, modelli per l'imaging della ghiandola salivaria del ratto sono stati sviluppati3,25 e ulteriormente raffinato per l'imaging videomicroscopia ad alta risoluzione di murino che SMG su misura per un microscopio invertito installazione26, 27 , 28.

Qui, presentiamo un protocollo pratico ed adattabile per videomicroscopia imaging di SMG murino usando la microscopia non lineare verticale, che è comunemente usata per l'imaging intravital nel campo dell'immunologia. A tal fine, abbiamo modificato una fase di immobilizzazione ampiamente autonomo utilizzata per preparazioni popliteal di linfonodo.

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Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato approvato dal Comitato cantonale per la sperimentazione animale e condotto secondo le linee guida federali.

1. anestetizzare il Mouse

  1. Indossare indumenti protettivi, camice e guanti.
  2. Mescolare la ketamina, xilazina e soluzione fisiologica per una lavoro di concentrazione di 20 mg/mL e 1 mg/mL, rispettivamente. Iniettare lo stock di lavoro intraperitonealmente (i.p.) a 8-10 µ l/g del mouse. Posizionare il mouse indietro nella gabbia.
    Nota: Questo protocollo è stato testato per topi maschi e femmine di 40-week-old 6 con uno sfondo di C57BL/6.
  3. Preparare la soluzione di acepromazina a 2,5 mg/mL e iniettare 30 µ l i.p., 15 min dopo l'iniezione di ketamina-xilazina (75 µ g/topo).
  4. Dopo 5-15 minuti, controllare un'adeguata anestesia e analgesia controllando per i riflessi, ad es., riflesso di ritiro della zampa o riflesso corneale.
  5. Controllo per riflessi circa ogni 30 minuti durante tutta la durata dell'esperimento. Iniettare per via sottocutanea chetamina/xilazina a 1,5 µ l/g di mouse, ogni 60 min o versioni precedenti se i riflessi sono positivi.
    Nota: Anestesia inalazione come isoflurano non può essere utilizzato con questo protocollo, a causa della fissazione del mouse.

2. rimuovere il pelo dall'Area di lavoro

  1. Utilizzare un rasoio elettrico per radere una zona che si espande all'incirca da 5 mm caudale della bocca verso le zampe anteriori, che si estende oltre le ganasce verso entrambe le orecchie.
  2. Applicare crema depilatoria sulla zona rasata con un batuffolo di cotone. Attentamente e accuratamente rimuovere dopo 3 min., per esempio, strofinando con tessuti bagnati.

3. Fissare il Mouse sul palco

Nota: Questo protocollo utilizza un palco su misura (Figura 1) dotato di due supporti regolabili per vetrini coprioggetto (uno fissato sul palco con una vite, l'altro fissato in modo permanente su di esso); bar regolabile orecchio stereotassica; una stringa che può essere serrata con una vite; un metallo liberamente regolabile riscaldamento anello; e una zona rialzata designato per posizionare il torso del mouse. Questa fase viene modificata da una fase di popliteal di linfonodo, con un titolare di stereotactic aggiunto e un supporto per lo slittamento di copertura inferiore che tiene il SMG esteriorizzato. Piani dettagliati o citazioni dello stage sono disponibili su richiesta.

  1. Preparare la fase rimuovendo i titolari per l'anello di riscaldamento e il titolare di slittamento del coperchio rimovibile. Allentare le viti dei titolari del bar dell'orecchio e del titolare fisso vetrini coprioggetto. Nastro un pezzo di garza al centro dell'area del palco, che serve come lettiera per il mouse.
  2. Utilizzare colla (Vedi Tabella materiali) per fissare un vetro di copertura del diametro di 20 mm verso l'alto di un supporto metallico cilindrico (questo sarà il vetro di copertura inferiore). Incollare un vetro di copertura di 25 mm sul fondo del piatto di metallo titolare (questo sarà il vetro di copertura superiore). Assicurarsi che i vetri di copertura si sovrappongono circa 2-3 mm con supporti in metallo e che il resto del vetro rimane privo di grasso e colla.
  3. Posizionare il mouse sulla relativa parte posteriore sulla garza, perpendicolare alla stringa allungata, con la testa centrata tra le barre dell'orecchio.
  4. Fissare l'estremità superiore del mouse sul palco con nastro chirurgico.
  5. Successivamente, collegare la stringa in incisivi anteriori e serrare la mascella fino a una posizione orizzontale. Utilizzare un forcipe curvo angolato leggermente tirare fuori la lingua dalla bocca, che facilita la respirazione.
  6. Strettamente, ma non con forza, tirare la coda e con nastro adesivo sul palco.
  7. Allineare le barre di orecchio per raggiungere un angolo di circa 30° tra il bar e il bordo del palco. Per garantire questo angolo, utilizzare un righello di triangolo per tracciare un angolo di 30° destra e sinistra su un foglio di carta e posizionare la fase trasparente sulla carta per allineare i possessori di conseguenza.
  8. Difficoltà la mascella tra le barre di orecchio spostando contemporaneamente la barra destra e sinistra verso l'interno fino a quando la mascella è immotile e serrare le viti. Osservare il movimento del torace prima, durante e dopo la correzione della mascella. Ridotto o assente respirazione indica che le barre siano fissate al collo, non l'osso della mascella; in questo caso, ripetere la procedura di fissaggio immediatamente.
  9. Fornire il riscaldamento al mouse, ad esempio, inserendo una lampada di riscaldamento nelle vicinanze e/o un rilievo di riscaldamento sotto il palco.

4. esposizione chirurgica della ghiandola salivaria utilizzando un microscopio stereoscopico

Nota: Le operazioni seguenti richiedono l'uso di un stereomicroscopio, una pinzetta e forbici chirurgiche. Poiché la procedura è terminale, non è necessario mantenere le condizioni di esercizio sterile. Strumenti puliti di etanolo è sufficiente.

  1. Individuare la posizione approssimativa del lobo SMG destra cercando un lieve rigonfiamento della pelle circa 15 mm caudale della bocca e mediale di 5 mm della linea della mascella. Sollevare una piega di pelle piccolo nel centro del rigonfiamento e tagliare per creare e apertura di circa 5 mm di lunghezza.
  2. Applicare immediatamente un anello 4 mm-alta di grasso per vuoto sulla pelle che circonda il taglio. (Utilizzare una siringa riempita di grasso vuoto con ago ipodermico 25g smussata).
  3. Riempire l'anello di grasso con soluzione fisiologica per garantire che il tessuto rimane umido durante l'operazione.
  4. Sotto lo stereomicroscopio, distruggere il tessuto connettivo utilizzando la seguente procedura: utilizzare un forcipe fine per tenere saldamente un pezzo di tessuto connettivo direttamente collegato a SMG e utilizzare una pinza seconda per tirare il tessuto connettivo distale fino a quando non si rompe. Garantire che alcuni tessuto connettivo rimangono collegata con il SMG; Questo è auspicabile poiché permette la gestione. Non toccare la ghiandola stessa con il forcipe, dal momento che questo causerà lo spurgo.
  5. Ripetere questo movimento di interrompere prima del tessuto connettivo in cima la ghiandola, quindi sul lato mediale (tra il lobo destro e sinistro del SMG). Non separare la sublinguale dalla ghiandola sottomandibolare.
  6. Continuare a rimuovere il tessuto connettivo laterale in senso antiorario attorno la SMG (mediale alla caudale, a distale, rostrale).
  7. Assicurare che il rifornimento di sangue, vasi linfatici efferenti e del dotto salivare, che sono tutti situati in un pacco presso il sito cranico della ghiandola, non sono rotti.
  8. Una volta che il tessuto connettivo laterale è interrotto, è possibile utilizzare pinze per tirare il tessuto connettivo attaccato all'estremità caudale della SMG verso l'alto per sollevare l'estremità caudale del SMG. Distruggere il tessuto connettivo sotto il lobo SMG, a partire dalla caudale e lo spostamento verso la fine rostrale.
  9. Continuare finché non viene rimosso il tessuto connettivo a tutti i siti di SMG (escluso il sito rostrale con alimentazione/scarico principali vasi sanguigni e il WD).

5. fissaggio della ghiandola

  1. Confermare che l'anello di grasso che tiene la soluzione salina è di almeno 4 mm in alto e non perdendo (Vedi punto 4.2).
  2. Installare il coperchio inferiore in vetro (Vedi punto 3.2) collegando la barra di metallo al suo supporto regolabile in altezza. Assicurarsi che il titolare di vetrini coprioggetto è regolato nella posizione massima e non toccare l'anello di grasso quando collegato alla fase. Posizionare il titolare dalla direzione caudale ad un angolo di circa 60° per il mouse, con il vetrino coprioggetto che copre circa due terzi (parti caudale e distale) del lobo esposto. Abbassare il vetro di copertura fino a quando entra in contatto con la ghiandola.
  3. Completare l'anello di grasso sopra il vetro di copertura per formare un nuovo serbatoio di soluzione fisiologica.
  4. Estrarre con cautela il lobo SMG in cima il coprioggetto con il forcipe, solo toccando il tessuto connettivo collegato ad esso (l'organo possa essere capovolte con il sito di fondo rivolto verso l'alto).
  5. Assicurarsi che l'anello di grasso ha un'altezza anche di almeno 4 mm e non ci siano perdite. Se necessario, ricarica il serbatoio salino utilizzando un 30 G siringa riempita con soluzione fisiologica.
  6. Garantire che il titolare di vetro di copertura per il vetro di copertura superiore è nella sua posizione massima. Utilizzare la vite per fissare il supporto metallico con il vetro di copertura superiore di 25 mm al titolare. Utilizzare le viti regolabili del titolare per posizionare il vetro di copertura, in modo che il SMG è centrato in pieno.
  7. Utilizzare le viti del supporto regolabile per abbassare il vetro di copertura superiore fino a quando si mette direttamente in contatto il SMG. Osservare la forma e la colorazione della ghiandola durante questo passaggio. Se l'area della superficie della ghiandola appare più grande, o la colorazione cambia (per esempio dal rosa al bianco), immediatamente mettere il vetro di copertura per una posizione più alta per alleviare la pressione sul SMG.
  8. Controllare il serbatoio soluzione fisiologica per perdite cercando di bolle d'aria e/o gocce di soluzione fisiologica all'esterno del serbatoio. Se viene rilevata una bolla di aria o di perdita, rimuovere vetrini coprioggetto sia tutto grasso e ricominciare dal punto 2.
  9. Vite chiuse tutte le viti di fissaggio.

6. Fissare l'anello di riscaldamento e la sonda di temperatura

  1. Inserire una sonda di temperatura nel serbatoio e posizionarlo vicino alla ghiandola, quindi il filo della sonda alla fase del nastro.
  2. Applicare un anello di grasso per lo slittamento di copertura superiore con la SMG nel centro (il diametro dell'anello grasso deve corrispondere al diametro dell'anello di riscaldamento). Posizionare l'anello di riscaldamento sopra il vetrino coprioggetto e sigillare con del grasso. Il tubo di anello di riscaldamento alla fase del nastro.

7. imaging

Nota: Utilizziamo un sistema di microscopio a due fotoni verticale dotato di un Laser sintonizzabile in Ti:Sa e un microscopio a fluorescenza con obiettivi di acqua-immersione X 20 o 25 X. Correzione in tempo reale di tessuto deriva durante l'acquisizione può essere implementato utilizzando una fase automatizzata e VivoFollow19. Questo migliora la stabilità dell'acquisizione delle immagini, ma non è obbligatorio.

  1. Accendere il sistema di microscopia in posizione verticale, utilizzando un apposito software fornito dal produttore del microscopio. Sintonizzare il Laser Ti:Sa a una lunghezza d'onda di eccitazione 780-900 nm.
  2. Collegare il tubo di riscaldamento sul ring di riscaldamento. Una pompa peristaltica acqua circola acqua calda (riscaldata immergendo la parte del tubo in un bagno di acqua di 80° C) attraverso l'anello per scaldare il SMG.
  3. Collegare la sonda di temperatura ad un termometro digitale. Regolare la velocità della pompa peristaltica, se la temperatura è non tra 35-39 ° C. Più velocemente la pompa funziona, caldo ottiene l'oggetto e viceversa.
  4. Prima di iniziare l'acquisizione di immagini, eseguire un controllo visivo della velocità di flusso di sangue. Controllare attentamente il passaggio dei leucociti attraverso i capillari sottili o tramite l'iniezione di destrano fluorescente.
    Nota: Per via endovenosa iniettato destrano fluorescente si riempirà immediatamente fuori l'intero sistema vascolare SMG quando il flusso sanguigno è fisiologico. Questo è praticamente sempre il caso in questa procedura.
  5. Per seguire le cellule immuni, profondità imaging è in genere tra 20-150 µm sotto la superficie del SMG identificato dal segnale di generazione di armoniche 2nd . Pile di registrare immagini di 150-300 µm di campo con risoluzione pixel di circa 512 x 512 o superiore e z-profondità di 20-60 µm con spaziatura di 2-4 µm tra immagini. Ripetere ogni 20-30 secondi acquisizione dello stack per una durata complessiva di 20-60 min.
  6. Utilizzare il termometro digitale per controllare i livelli di temperatura minima e massima dopo acquisizione di sequenza di una sola immagine. Scartare la sequenza di immagini, se il valore minimo o massimo non è nella gamma di 37 ± 2 ° C. Riempire l'acqua per immersione dell'obiettivo tra sequenze di immagini.
  7. Alla fine della sessione di imaging, eutanasia i topi di CO2 asfissia nell'ambito dell'anestesia.
    Nota: Questo è in accordo con le linee guida federali svizzere della sperimentazione animale; altre linee guida per l'eutanasia potrebbe applicare altrove.

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Risultati

Questo protocollo permette la formazione immagine di quasi l'intero lato dorsale o ventrale del SMG. Il campo visivo in genere include anche ghiandola salivaria sublingual, che differisce leggermente da SMG in composizione cellulare4. Entrambe le ghiandole sono incapsulate dal collagene fibrillare e suddiviso in lobi. La maggior parte delle 14 sistemi possono produrre un'immagine privo di etichetta collagene fibrillare misurando il segnale armonico 2nd ,...

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Discussione

Questo protocollo offre un approccio diretto per l'imaging in vivo di murine ghiandole salivarie sottomandibolari e sublinguale usando la microscopia non lineare verticale spesso utilizzata nel campo dell'immunologia. Il metodo può essere adattato per l'imaging di altre ghiandole esocrine della regione del collo e della testa. Per esempio, il nostro laboratorio ha eseguito imaging della ghiandola lacrimale in modo analogo (non mostrato).

Rimuovendo il tessuto connettivo intorno la SMG...

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Dichiarazioni

Conflitti di interesse non dichiarati.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale svizzero (SNF) progetto grant 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (a JVS) e Leopoldina nell'Unione fraterna LPDS 2011-16 (BS). Questo lavoro ha avvantaggiato da configurazioni ottiche del "Microscopia Imaging Center" (MIC) dell'Università di Berna.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Narketan 10 %  (Ketamina) 20ml (100 mg/ml)Vetoquinol3605877535982
Rompun 2% (Xilazina) 25 ml (20 mg/ml)Bayer680538150144
soluzione salina NaCl 0,9%B. Braun3535789
Prequillan 1% (Acepromazina) 10 ml (10 mg/ml)Fatro6805671900029
Rasoio elettricoWahl9818Lo simile
Epilazione cremaVeet4002448090656
Durapore Nastro chirurgico (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-1
Durapore Nastro chirurgico (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-0
Super colla Ultra gel, colla istantaneaPattex, Henkel4015000415040
Vetrini di copertura per microscopio 20 mm e 22 mmMenzel-Glä ser631-1343/ 631-1344
Grasso per laboratori 60 g glisseal NBorer (fornitore VWR)DECO514215.00-CA15
Forbici chirurgicheFine Science Tools (F.S.T)14090-09o simili
Pinze finiFine Science Tools (F.S.T)11252-20o simili
Cotton fiocMigros617027988254o simili
Garza Gazin 5 x 5 cmLohmann e Rauscher18500o simile
StereomicroscopioLeicaMZ16o simile
Texas Red destrano 70kDa  Sonde molecolariD1864
Cascade Destrano blu 10kDainvitrogenD1976
Sistema a due fotoniLaVision BiotecTrimScope I e II osimile
XLUMPLANFL 20x/0,95 W obiettivoOlympusn/ao altro obiettivo ad immersione in acqua 
Termometro digitaleFluke95969077651

Riferimenti

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