Descriviamo un protocollo per esporre chirurgicamente e di stabilizzare la ghiandola salivare sottomandibolare murina per videomicroscopia imaging utilizzando la microscopia intravital in posizione verticale. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre ghiandole esocrine della testa e collo regione dei topi e altri piccoli roditori.
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Articolo metodologico
Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ghiandola salivare sottomandibolare (SMG) è uno dei tre ghiandole salivari maggiori ed è di interesse per molti diversi campi della ricerca biologica, tra cui immunologia, oncologia, odontoiatria e biologia cellulare. La SMG è una ghiandola esocrina composto da cellule epiteliali secretive, miofibroblasti, cellule endoteliali, nervi e matrice extracellulare. Processi dinamici cellulari nel ratto e topo SMG precedentemente sono stato ripreso, principalmente utilizzando invertito sistemi multi-fotone microscopio. Qui, descriviamo un semplice protocollo per la preparazione chirurgica e la stabilizzazione di SMG murino in topi anestetizzati per in vivo imaging con sistemi di microscopio verticale multi-fotone. Presentiamo insiemi di immagine videomicroscopia rappresentativa di endogeno e trasferiti passivamente cellule fluorescenti, tra cui l'etichettatura dei vasi sanguigni o condotti salivari e generazione di seconda armonica di visualizzare collagene fibrillare. In somma, il nostro protocollo consente preparazione chirurgica delle ghiandole salivari del mouse nei sistemi di microscopia in posizione verticale, che sono comunemente usati per l'imaging intravital nel campo dell'immunologia.
Introduzione
Saliva è secreta dalle ghiandole esocrine per lubrificare il cibo, proteggere le superfici mucose del tratto orale e per fornire gli enzimi digestivi, nonché sostanze antimicrobiche1,2. Oltre alle ghiandole salivari minori sparpagliate nel submucosa orale, ci sono tre insiemi bilaterale delle ghiandole importanti identificate come parotidea, sublingual e sottomandibolare, in base alla loro posizione1,2. Cellule epiteliali a forma di piramide, organizzati in boccetta-a forma di sacs (acini) o demilunes che sono circondati dalle cellule myoepithelial e u....
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Protocollo
Tutto il lavoro animale è stato approvato dal Comitato cantonale per la sperimentazione animale e condotto secondo le linee guida federali.
1. anestetizzare il Mouse
- Indossare indumenti protettivi, camice e guanti.
- Mescolare la ketamina, xilazina e soluzione fisiologica per una lavoro di concentrazione di 20 mg/mL e 1 mg/mL, rispettivamente. Iniettare lo stock di lavoro intraperitonealmente (i.p.) a 8-10 µ l/g del mouse. Posizionare il mouse indietro nella gabbia.
Nota: Questo protocollo è stato testato per topi maschi e femmine di 40-week-old 6 con uno sfondo di C57BL/6. - Preparare la soluzione di acepromazi....
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Risultati
Questo protocollo permette la formazione immagine di quasi l'intero lato dorsale o ventrale del SMG. Il campo visivo in genere include anche ghiandola salivaria sublingual, che differisce leggermente da SMG in composizione cellulare4. Entrambe le ghiandole sono incapsulate dal collagene fibrillare e suddiviso in lobi. La maggior parte delle 14 sistemi possono produrre un'immagine privo di etichetta collagene fibrillare misurando il segnale armonico 2nd ,.......
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Discussione
Questo protocollo offre un approccio diretto per l'imaging in vivo di murine ghiandole salivarie sottomandibolari e sublinguale usando la microscopia non lineare verticale spesso utilizzata nel campo dell'immunologia. Il metodo può essere adattato per l'imaging di altre ghiandole esocrine della regione del collo e della testa. Per esempio, il nostro laboratorio ha eseguito imaging della ghiandola lacrimale in modo analogo (non mostrato).
Rimuovendo il tessuto connettivo intorno la SMG.......
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Dichiarazioni
Conflitti di interesse non dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale svizzero (SNF) progetto grant 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (a JVS) e Leopoldina nell'Unione fraterna LPDS 2011-16 (BS). Questo lavoro ha avvantaggiato da configurazioni ottiche del "Microscopia Imaging Center" (MIC) dell'Università di Berna.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Narketan 10 % (Ketamina) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xilazina) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| soluzione salina NaCl 0,9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazina) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Rasoio elettrico | Wahl | 9818L | o simile |
| Epilazione crema | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Nastro chirurgico (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Nastro chirurgico (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super colla Ultra gel, colla istantanea | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Vetrini di copertura per microscopio 20 mm e 22 mm | Menzel-Glä ser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grasso per laboratori 60 g glisseal N | Borer (fornitore VWR) | DECO514215.00-CA15 | |
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools (F.S.T | )14090-09 | o simili |
| Pinze fini | Fine Science Tools (F.S.T | )11252-20 | o simili |
| Cotton fioc | Migros | 617027988254 | o simili |
| Garza Gazin 5 x 5 cm | Lohmann e Rauscher | 18500 | o simile |
| Stereomicroscopio | Leica | MZ16 | o simile |
| Texas Red destrano 70kDa | Sonde molecolari | D1864 | |
| Cascade Destrano blu 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Sistema a due fotoni | LaVision Biotec | TrimScope I e II o | simile |
| XLUMPLANFL 20x/0,95 W obiettivo | Olympus | n/a | o altro obiettivo ad immersione in acqua |
| Termometro digitale | Fluke | 95969077651 |
Riferimenti
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R.
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Ristampe e permessi
