Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare e qualificare ogni specie di sfingomielina utilizzando Monitoraggio multiplo di reazione e la modalità di MS/MS/MS, rispettivamente.

Abstract

Presentiamo un metodo di analisi di sfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente di liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). SM è un comuni sfingolipidi formato da un fosforilcolina e una ceramide come le componenti idrofile e idrofobe, rispettivamente. Un numero di specie di SM è presente in cellule di mammiferi a causa di una varietà della sfingoide lunga catena base (LCB) e un N-frazione di acil nella ceramide. In questo rapporto, indichiamo un metodo per stimare il numero di carbonio e legami doppi in un LCB e un N-frazione di acil basato su loro corrispondenti ioni prodotto negli esperimenti di MS/MS/MS (MS³). Inoltre, presentiamo un metodo di analisi quantitativa per SM usando due isotopicamente etichettato SM specie stabili, che facilita la determinazione l'intervallo utilizzato nella quantificazione di SM. Il presente metodo sarà utile nella caratterizzazione di una varietà di specie di SM in campioni biologici e prodotti industriali come cosmetici.

Introduction

Sfingomielina (SM) è un comuni sfingolipidi in cellule di mammifero. SM è sintetizzato intracellulare¹ e presente come precursore per altri sfingolipidi come un sfingosina-1-fosfato e una ceramide, che hanno un ruolo cruciale nella immunitario cellulare traffico e omeostasi della barriera, rispettivamente^{2, la pelle 3}. Pertanto, l'analisi precisa del metabolismo SM è importante per chiarire i ruoli fisiologici e patologici degli sfingolipidi.

SM è composto di una ceramide e un fosforilcolina che è collegato al 1-idrossi gruppo di ceramide, che ulteriormente ....

Protocol

Consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Indossare guanti per ridurre al minimo la contaminazione del campione di pelle-derivato SM. Il presente protocollo è stato applicato alle cellule HeLa sviluppate in minimo essenziale supplementato dell'Aquila con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1.000 U/L penicillina e streptomicina 100 mg/L.

1. preparazione dei campioni del lipido

Nota: È importante che tutte le Vetrerie artistiche tra cui provette con tappo a vite in Teflon-foderato essere privo di detersivo.

1. Estrazione della frazione lipidica totale da om....

Results

Sintetizzato chimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM in campioni di lipidi estratti da cellule HeLa (Figura 1B) sono stati analizzati da LC-ESI-MS che impiegano³ [M + HCOO]^– e [M-CH₃]^- come ioni precursori di primo e secondo, rispettivamente. Si noti che l'intensità dello spettro di demetilato-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/.......

Discussion

Nel presente metodo qualitativo, abbiamo ottenuto MS³ ioni prodotto di un SPC e un N-frazione di acil. È fondamentale per assegnare correttamente sia un SPC e un N-frazione di acil. A tal fine, si deve osservare che altre molecole contenenti fosforilcolina possono anche essere rilevati come gli ioni prodotto di³ MS. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e del plasmalogeno-PC sono abbondantemente presenti in cellule di mammifero, e loro idrofobicità è simile a quello della SM. Di conseguenza.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	ThermoFisher	10010023
Piatto per coltura tissutale da 100 mm	IWAKI	3020-100
Raschietto cellulare	IWAKI	9000-220
Provetta siliconata da 2,0 mL	Fisher Scientific	02-681-321
Provetta	IWAKI	TST SCR 16-100
Tappo a vite rivestito in teflon	IWAKI	9998CAP415-15
Tubo di vetro monouso	IWAKI	9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µ m 1,5 mm D.I. x 100 mm	Shiseido	92223	La cartuccia di protezione viene inserita nel supporto della cartuccia e collegata alla colonna C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm CARTUCCIA DI PROTEZIONE	Shiseido	12197
Portacartuccia	Shiseido	12415
Acetonitrile	Wako	018-19853
2-propanolo (alcool isopropilico)	Wako	161-09163
Metanolo	Wako	134-14523
Acido formico	Wako	066-00466
28% Ammoniaca acqua	Wako	016-03146
Sonicatore (tipo da bagno)	SHARP	UT-206H
Miscelatore a vortice per provetta in vetro	TAITEC	Mix-EVR
1,4 mL fiala di vetro	Tomsic	500-1982	I campioni sono conservati in una fiala di vetro da 1,4 mL sigillata con tappo a vite e setto da 8 mm a -20 gradi; C
8 mm setto	Tomsic	200-3322	Quando i campioni vengono analizzati, i tappi a vite vengono sostituiti con tappi a vite con setto fessurato
Tappo a vite per fiala di vetro da 1,4 mm	Tomsic	500-2762
Tappo a vite con setto fessurato	Shimadzu	GLC GLCTV-803
PVDF 0,22 &;	Millipore	SLGVR04NL
Spettrometria di massa a triplo quadrupolo e a trappola ionica lineare a quadrupolo	SCIEX	QTRAP4500
Il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati degli spettri ionici del prodotto	SCIEX	Analyst
Il software per l'integrazione dei dati nell'analisi quantitativa	Sistema HPLC SCIEX	MultiQuant
	Shimadzu	Nexera
Bottiglia di vetro	Sansyo	85-0002
d18:1/24:0 sfingomielina	Avanti Polar Lipids	860592P
Sfingosilfosforilcolina	Merck	567735
Siero fetale bovino	ThermoFisher
L-glutammina	ThermoFisher
Penicillina e streptomicina	Sigma	P4333
Eagle' s minimo essenziale medio	Sigma	M4655