Epatectomia parziale lobulare: Un modello chirurgico per rigenerazione epatica morfologica

Sommario

Qui, presentiamo un nuovo metodo per la resezione parziale del lobo epatico di sinistra in topi neonatali (giorno 0). Questo nuovo protocollo è adatto per lo studio delle lesioni epatiche acute e risposta di lesione in ambito neonatale.

Abstract

Rigenerazione dell'organo morfologico dopo perdita acuta del tessuto è comune tra i vertebrati inferiori, ma è osservata raramente nella vita postnatale dei mammiferi. Adulto rigenerazione del fegato dopo epatectomia parziale 70% provoca l'ipertrofia degli epatociti con qualche replica nei restanti lobi con ripristino di attività metabolica, ma con perdita permanente della morfologia e della architettura di lobo ferito. Qui, abbiamo dettaglio un nuovo metodo chirurgico nel neonato che lascia un ambiente fisiologico favorevole alla rigenerazione. Questo modello comporta amputazione di all'apice del lobo di sinistra e di un regime di successiva amministrazione conservatrice e manca la necessità per la legatura dei vasi principali del fegato o ferita chimica, lasciando un ambiente fisiologico in cui può verificarsi la rigenerazione. Estendiamo questo protocollo per amputazioni su topi giovani (P7-14), durante il quale il fegato danneggiato passa da rigenerazione dell'organo a crescita compensatoria di ipertrofia. Il protocollo presentato, breve 30 min fornisce un framework per lo studio dei meccanismi di rigenerazione, il suo declino età-collegato nei mammiferi e la caratterizzazione dei presunti staminali epatiche o progenitori.

Introduzione

La capacità di rigenerare un organo, o per ripristinare la forma e funzione, è stata pensata per essere per lo più perso nel tempo evolutivo. La capacità rigenerativa del fegato dei mammiferi adulto dopo lesione acuta chimico o fisico è stato trovato per coinvolgere la mobilitazione di tutti gli epatociti rimanenti conseguente onde dell'ipertrofia e alcuni cicli di divisione cellulare, risultante in un funzionale ma architettonicamente differenti dell'organo^1,2,3,4,5. Recentemente, gli studi hanno cominciato a caratterizzare la risposta rigenerativa degli organi dei mammiferi neonatale alla ferita entro la prima settimana di vita^6,7,8. Questi studi hanno dimostrato che quando ferito durante lo sviluppo neonatale, determinati organi mammiferi rispondano con rigenerazione morfologica invece compensativo crescita o fibrosi di^7,8.

Recenti studi hanno dimostrato che la rigenerazione della struttura globale e la funzione si verifica durante l'iniziale periodo neonatale^6,7,8. Protocolli stabiliti al fegato coinvolgere ferita chimica o la somministrazione di etanolo^9,10,11, acetaminofene^12,13,14,15 , tetracloruro di carbonio^16,17,18,19, 70% hepatectomy parziale^4,20,21o la rimozione di sinistra e lobi mediani. Chimica amministrazione conduce alla morte delle cellule dell'epatocita, ma spesso lascia micro - e macro-strutture intatte. Rigenerazione morfologica non può essere facilmente studiati in questo contesto, come l'architettura epatica nel complesso non è stato cancellato. L'epatectomia parziale 70% comporta la legatura sutura dei vasi principali, che è necessaria per fermare l'emorragia, ma lascia un ambiente non-fisiologica con rottura permanente del sistema vascolare. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato solo sui roditori adulti, e la sua applicazione ai neonati tecnicamente è estremamente difficile. Con questo in mente, abbiamo sviluppato un metodo in cui 20-30% dell'apice del lobo di sinistra è stata rimossa in un neonato mouse P0 (Figura 1A-1B). Questo metodo è chirurgicamente conservatore, minimamente invasiva, non tecnicamente impegnativi e conduce al lordo di perdita della morfologia senza legatura della vascolarizzazione, lasciando spazio per la rigenerazione si verifichi. Il risultante protocollo passo dopo passo, descritto di seguito, consente qualsiasi ricercatore eseguire un hepatectomy parziale lobular su topi neonatali per lo studio dei mammiferi rigenerazione neonatale nelle prime fasi di vita post-natale. Questo metodo ha anche applicazioni chiare agli studi comparativi in medicina rigenerativa e biologia delle cellule staminali, come può essere utilizzato nel fegato durante le fasi successive della vita.

Gli studi di lesioni epatiche acute più comuni sono danni indotti chimicamente, l'amputazione del fegato adulto o hepatectomy parziale 70%. Danni chimici spesso prevede la somministrazione per via endovenosa, orale o intraperitoneale di paracetamolo, tetracloruro di carbonio o etanolo ed sono un modello relativamente semplice e non invasiva di lesioni. Come precedentemente discusso, danni chimici risultati nella morte cellulare dell'epatocita, ma spesso foglie dello stroma e parenchima strutture intatte, rendendo difficile fare affermazioni circa morfologiche rigenerazione. Danni chimici spesso è incentrata su vasi epatici, che lo rende una tecnica utile per studiare il sito e ferita cellula-specifico, ma rende anche difficile interrogare, a livello di intero organo, altre popolazioni che possono essere situati più lontano di vasi e che possono contribuire alla rigenerazione. Nonostante queste limitazioni, danni chimici rimangono ancora un modello utile e altamente fisiologicamente rilevante pregiudizio.

Adulti 70% hepatectomy parziale comporta la rimozione dei lobi sinistro e mediani dopo la legatura del sistema vascolare epatica. La risposta all'epatectomia è stata caratterizzata bene: il fegato amputato 14 giorni post 70% hepatectomy parziale si sviluppa un'architettura grossolanamente diversa da quello del lobo originale intatto, come gli epatociti di lobi di destra e Caudati rimanenti sottoposti a ipertrofia e un paio di giri di divisione cellulare^4,5. Questo rende perso massa e funzione, ma non riesce a rigenerare i due lobi amputati e pertanto non sostituisce lordo morfologia. Di conseguenza, la risposta di lesione all'epatectomia parziale 70% è utile per lo studio dei meccanismi di crescita compensatoria con rigenerazione limitata.

Qui, descriviamo completamente un protocollo per un neonatale hepatectomy parziale lobulare. La procedura prevede la selezione di animali appropriati e preparazione, preparazione del campo chirurgico, chirurgia e recupero. Ottimizzazione e adattamento di ognuno di questi passaggi possono essere necessari per le diverse applicazioni del protocollo.

Abbiamo ampiamente eseguita e ottimizzato questo protocollo su cuccioli di tipo selvatico C57BL/6J (JAX 000664), tuttavia, per studiare i meccanismi di rigenerazione e di diverse popolazioni cellulari, abbiamo anche usato vari animali transgenici, compreso i topi che harboring Cre vari e CreERT2 transgeni e/o knock-in (JAXAxin2^CreERT2 018867, e JAX Sox9^CreERT2 018829) in combinazione con reporter fluorescenti, come i sistemi di Rainbow e mTmG (R26^VT2/GK3, R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. abbiamo non trovato nessuna necessità di cambiare questa metodologia per ceppi di topi diversi, come sono state osservate differenze nella sopravvivenza o potenziale rigenerativo.

Oltre all'utilizzo di diversi ceppi di animali, abbiamo anche effettuato parziale hepatectomies lobular su neonatali topi trattati con piccole molecole, quali 4-idrossi-tamoxifen e 5-Etinil-2 '-deoxyuridine (EdU). Solfossido dimetilico (DMSO) e l'etanolo sono stati utilizzati come solventi, come è stato trovato che l'olio di mais era una causa significativa della morbosità. Abbiamo trovato altrimenti che la somministrazione intraperitoneale di piccole molecole non ha colpito esiti rigenerative o sopravvivenza. Prevediamo che questo protocollo sarà adattato per l'uso con altre piccole molecole per interrogare i vari aspetti della rigenerazione.

Interventi chirurgici del mouse neonatale possono essere tecnicamente impegnativi e possono richiedere particolari competenze nella gestione degli animali e dissezione microscopica. Agricoltura animale ed è necessaria per evitare cannibalismo materna dopo l'intervento e durante il periodo di recupero immediato.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in stretta conformità con le linee guida stabilite dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International (AAALAC) e dell'Università di Stanford pannello amministrativo su animali di laboratorio Cura (APLAC), (numero di protocollo #10266) e negli Stati Uniti, o l'europeo Animal Welfare Act, direttiva 2010/63/UE. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di animale esperimenti del governo della Baviera, Germania e ha ricevuto il permesso No: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. animale preparazione

1. Preparare una gabbia vuota con biancheria da letto appropriato su un rilievo di riscaldamento.
2. Prima di toccare gli animali con i guanti, strofinare assestamento della madre sui guanti.
3. Rimuovere tutti i cuccioli dalla loro madre e posto nella gabbia vuota. Rimuovere alcuni di biancheria da letto della madre e metterlo nella gabbia vuota con i cuccioli.
4. Posto la madre in una gabbia separata, pulita e asciutta, lontano dal campo chirurgico.
5. Don nuovi guanti sterili puliti prima della preparazione del campo chirurgico.

2. preparazione del campo chirurgica

1. Utilizzando una pipetta 10 mL, aggiungere 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) per un piatto di Petri di 10 cm.
2. Pipettare 2 mL di soluzione di betadine o equivalente anti-settico in di Petri di 10cm.
3. Posto un ambito dissezione sul campo operatorio. Accendere la lampada di ambito di dissezione e regolare il livello di luce al comfort del chirurgo. Un cucciolo è collocabile nel campo chirurgico sotto la lampada di ambito per dissezione. Luce adeguata può essere confermata dall'assenza di ombre sulla superficie ventrale del cucciolo.
4. Preparare la camera di anestesia di isoflurane (Vedi Tabella materiali) con un cono di naso. La camera deve essere pulita senza prova di urina o feci. Inserire il cono di naso e tubi associato nell'ambito di dissezione nel campo chirurgico. Deviare il flusso di ossigeno e isoflurano unicamente per il cono di naso.
5. Preparare un'area di recupero post-operatorio con un rilievo di riscaldamento impostato a circa 37 ° C. Il recupero post-operatorio deve essere composto da 4 pezzi di garza posizionato sopra il dissipatore di calore. Se possibile, strofinare garze in biancheria, feci e urina per conservarne il profumo della madre della madre.
   Nota: È mal consigliato di utilizzare una lampada di calore, come questo rende più difficile controllare la temperatura. Temperature elevate provocherà la morte di topi neonatali.
6. Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con un'autoclave. Gli strumenti necessari sono: forbici micro-dissezione, micro-dissezione forcipe, garza, pinza emostatica e qualsiasi sutura non assorbibile monofilamento di 6-0. Strumenti chirurgici possono essere resterilzed con qualsiasi sterilizzatore di perlina di vetro.

3. lobulare epatectomia

1. Anestetizzare il pup inserendola tra l'ogiva sulla sua taping indietro e delicatamente i piedi e le mani a posto. Il cucciolo dovrebbe ricevere 5% isoflurane in ossigeno.
   1. Consentire il pup di sedersi per 5 minuti o fino a quando non adeguatamente anestetizzato, che può essere verificato con una prova di pizzico di punta.
   2. Iniettare 5 mg/kg di carprofen per via sottocutanea prima dell'incisione.
      Nota: L'intera operazione dovrebbe prendere non più di 30 minuti i risultati più difficili possono essere osservati in neonati che sono sotto anestesia generale per oltre 30 min. Prendere precauzioni per ridurre al minimo la lunghezza della chirurgia attraverso una preparazione approfondita e bagnatura della pelle prima della chiusura per ridurre al minimo suturare lacerazioni della pelle indotto.
2. Pulire delicatamente la parete addominale posteriore con una piccola garza bagnata con betadine. Consentire il betadine asciugare per 1 min.
3. Fare un'incisione di cm 0,5 emiclavicolare sinistra immediatamente di sotto della gabbia toracica con le micro-dissezione Forbici e pinze. Delicatamente la pelle usando il forcipe di separare e praticare una seconda incisione più profonda nella cavità peritoneale (Vedi Figura 1, sinistra e centro)
4. Applicare una leggera pressione laterale da entrambi i lati dell'addome utilizzando la schiena, le estremità smussate del micro-dissezione Forbici e pinze per forzare l'apice del lobo di sinistra fuori della cavità peritoneale. L'apex di sinistra del lobo sinistro dovrebbe essere facilmente visualizzati (Figura 1, destra).
5. Dall'apice, amputare e pesare la quantità di tessuto da rimuovere.
   1. Usando le forbici micro-dissezione, delicatamente amputare la quantità desiderata di tessuto dall'apice del lobo di sinistra.
   2. Posizionare il tessuto amputato in una provetta da 1,5 mL riempita con PBS. Pesare il tessuto amputato utilizzando una bilancia analitica (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Posizionare un pezzo di garza o carta sulla bilancia e Tara si. Collocare il tessuto amputato sulla garza o carta, quindi misurare la sua massa.
   3. Difficoltà della zona amputata in paraformaldeide al 2% a temperatura ambiente per 1 h e posto in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto sopra ghiaccio secco per analisi sezione congelata. Analizzare le sezioni congelate di sezioni di taglio 7-10 µm utilizzando qualsiasi standard criostato.
6. Utilizzando un pezzo arrotolato di garza, sostituire delicatamente il lobo di sinistra nella cavità peritoneale. Lasciare la garza nella cavità fino a quando l'emorragia si ferma.
7. Rimuovere la garza e bagnato il sito chirurgico e l'area circostante con una garza imbevuta con PBS.
8. Chiudere il sito chirurgico con il 6-0 monofilamento, suture non assorbibili con una filza. Il peritoneo e la pelle dovrebbe essere chiuso separatamente.
   Nota: Bagnare delicatamente la pelle con una garza imbevuta con PBS può minimizzare la sutura indotto da lacrime.
9. Delicatamente ma accuratamente pulire il cucciolo con una garza imbevuta con PBS e non garantire nessun remains di sangue o betadine. La compressa di garza imbevuta di rotolo e pulire delicatamente sopra il segno della ferita di pulire qualsiasi sangue o betadine.
   Nota: Questo è particolarmente importante in quanto la madre potrebbe cannibalizzare i cuccioli se vengono pulite adeguatamente.
10. Rimuovere il pup dal cono di naso e posizionarlo sulla zona di recupero che include i rilievi di garza esposti alla madre feci e nelle urine. Una volta che il cucciolo recupera, sostituire il cucciolo in gabbia vuota con biancheria da letto della madre.
    Nota: Non utilizzare una lampada di calore. L'uso di una lampada di calore può causare il neonato a surriscaldarsi.
11. Ripetere la procedura sul numero desiderato di cuccioli. Anche se tutti i cuccioli possono essere utilizzati, è generalmente consigliabile lasciare pochi cuccioli non operati per essere sostituito insieme i cuccioli azionati.
12. Sostituire tutti i cuccioli contemporaneamente con biancheria da letto della loro madre nella gabbia della madre.

4. il recupero e l'analisi

1. Follow-up sui topi al giorno.
   1. Controllare che la ferita rimane chiusa e rimuovere qualsiasi cuccioli morti, se presente.
   2. Se la ferita si riapre, preparare l'area chirurgica del sito e recupero come precedentemente descritti e ripetere i passaggi 3.8 a 3.12.
   3. Iniettare 5 mg/kg di carpofen per via sottocutanea 24 e 48 h dopo la procedura.
   4. Seguire i cuccioli per 56 giorni o più.
2. Eutanasia degli animali dopo la quantità desiderata di giorni post-operatori di anidride carbonica (CO₂) esposizione e dislocazione cervicale.
   1. Posizionare il mouse nell'induzione / camera di eutanasia e accendere il CO₂ fino a topi smettere di respirare.
   2. Garantire l'eutanasia di dislocazione cervicale. Spingere verso il basso sul collo dorsale del mouse utilizzando la ribalta-dito e il pollice e con l'altra mano, tirare verso il basso sulla coda.
3. Rimuovere l'intero fegato in blocco e pesarlo.
   1. Attentamente separare ogni lobo e pesare separatamente.
      Nota: Rimuovere il fegato da un'attenta dissezione dei vasi a membrana ed epatico e portale. Separa i lobi da altro dissecando attentamente ogni lobo al suo attaccamento prossimale.
4. Determinare la portata di rigenerazione confrontando la massa del lobo di sinistra amputata alla massa del fegato intero. Un lobo di sinistra illeso è circa il 30% del fegato intero.

Risultati

Figura 1A i dettagli di una tempistica generale di neonatale epatectomia lobulare (schematica in Figura 1B) e della durata prevista di tempo di attesa fino a quando la rigenerazione è osservata. Sottile rigenerazione del lobo sinistro può essere osservato 7-14 giorni dopo l'intervento chirurgico. Rigenerazione completa è stata osservata spesso dopo 56 giorni dopo l'intervento. Topi dovrebbero non mostrano segni di anomalie fisiol...

Discussione

Ferita epatica acuta è stata studiata tradizionalmente usando chimico (paracetamolo, etanolo, tetracloruro di carbonio), o modelli chirurgici (70% epatectomia parziale). La risposta rigenerativa dopo hepatectomy parziale 70% è stata caratterizzata per coinvolgere l'ipertrofia degli epatociti globale e più cicli di divisione cellulare^4,5. Per fermare un'emorragia, tuttavia, questo modello è limitato, come i vasi maggiori devono essere legati lasciando un ambiente ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Animali
Madre con cucciolata del giorno 0 cuccioli neonatali (qualsiasi ceppo)
Madre surrogata e cucciolata surrogata (opzionale)
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Reagenti standard
Siero tamponato con fosfato (PBS)
Providina-iodio o soluzione
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Attrezzature chirurgiche
Microscopio da dissezione	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
Micro forbici a molla diritta da 3 mm	Vannas	72932-01
5SF Pinze	Dumont	11252-00
Pinze Kelly diritte	Grainger	17-050G
Termoforo	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurano	Abbott Labs	0044-5260-05
Sistema di anestesia per roditori	Kent Scientific	1205S
Garza, 10,16 x 10,16 cm	Fisher Scientific	13-761-52
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Dotazione standard
1.5ml provetta per microcentrifuga	Eppendorf	22363204
6-0 suture monocristalline	Ethicon	MCP489G
piastra Petri	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Bilance analitiche	Fisher Scientific	01-912-402
Camera di induzione a basso costo	Kent Scientific	SOMNO-0730