Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Summary

Metodi per la preparazione di volumi di campione dimensioni nanolitro per microscopia elettronica di trasmissione e uno strumento è presentato. Non macchiare di carta sono necessari passaggi, evitando così le conseguenze pregiudizievoli, che questo può avere per le proteine, significativamente riducendo la perdita del campione e consentendo l'analisi della singola cella lysata per proteomica di visual.

Abstract

A causa di recenti progressi tecnologici, cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) sta rapidamente diventando un metodo standard per l'analisi strutturale dei complessi della proteina a risoluzione atomica. Tuttavia, tecniche di isolamento della proteina e metodi di preparazione del campione per EM rimangono un collo di bottiglia. Un numero relativamente piccolo (100.000 per un paio di milioni) di particelle singole proteine devono essere imaged per l'analisi ad alta risoluzione delle proteine di singola particella approccio EM, rendendo miniaturizzato esempio gestione tecniche e principi di microfluidica fattibile.

Un metodo del preparazione di griglia EM miniaturizzato, carta-macchiare-gratuito per esempio pre-condizionata, adescamento griglia EM e post-elaborazione che consuma solo nanolitro-volumi di campione è presentato. Il metodo utilizza un sistema di erogazione con precisione sub-nanolitro per l'assorbimento di liquido di controllo ed EM griglia innesco, una piattaforma per controllare la temperatura della griglia definendo così l'umidità relativa di sopra della griglia di EM e un pick-e-tuffo-meccanismo per esempio vetrificazione. Per cryo-EM, una griglia di EM è disposto sulla fase a temperatura controllata e il campione viene aspirato in un capillare. La punta capillare è posizionata in prossimità di superficie della griglia, la griglia viene caricata con il campione ed eccesso è ri-aspirato nella microcapillary. Successivamente, il film campione è stabilizzato e leggermente assottigliato per evaporazione controllata acqua regolata dall'offset della temperatura piattaforma rispetto al punto di rugiada. In un dato punto viene attivato il meccanismo di prelievo-e-immersione, trasferire rapidamente la griglia EM innescata in etano liquido per la vitrificazione di campione. In alternativa, sono disponibili per preparare volumi di campione di dimensione nanolitro macchia negativa (NS) EM campione-condizionata metodi.

Le metodologie notevolmente riducono il consumo del campione ed evitare approcci potenzialmente dannosi alle proteine, come la carta da filtro assorbente usato nei metodi convenzionali. Inoltre, la minuscola quantità di campione richiesto consente nuove strategie sperimentali, come campione veloce condizionata, combinazione con cella singola Lisi per "visual proteomics", o "lossless" preparazione del campione totale per analisi quantitativa di campioni complessi.

Introduction

Hardware e software per l'analisi strutturale dei complessi della proteina di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha avanzato in maniera massiccia negli ultimi anni. I miglioramenti apportati hanno aperto la strada a una "rivoluzione di risoluzione"^1,2 e cambiato fondamentalmente ricerca strutturale. La rivoluzione è iniziata con l'avvento di cryo-elettrone microscopia (cryo-EM)^3,4, che permette la preparazione di campioni biologici sotto vicino alle condizioni fisiologiche, diminuendo la sensibilità di radiazione e prevenendo evaporazione di campioni in alto vuoto del microscopio elettronico a trasmissione⁵. Negli anni successivi, il progresso tecnologico incrementale aumentato gradualmente la risoluzione ottenibile. Tra queste innovazioni erano l'applicazione dell'emissione di campo pistole^6,7e, più recentemente, migliorato algoritmi di analisi di dati, ad esempio di massima verosimiglianza metodi^8,9. Diretto di elettroni rivelatore telecamere^10,11,12,13, film-modalità imaging e l'accompagnamento software sviluppi^{14,15, 16 , 17}, fornito la svolta finale richiesta per raggiungere risoluzione atomica per campioni biologici dall'analisi di singola particella (per una recensione Vedi Cheng, Grigorieff, et al. ¹⁸). l'importanza di cryo-EM è stato recentemente riconosciuto dal premio del premio Nobel per la chimica a tre dei pionieri.

Per realizzare l'immagine un campione biologico da TEM, il metodo utilizzato per caricare la griglia EM con il campione (in seguito denominato «preparazione griglia») deve garantire che il livello risultante di campione (i) è abbastanza sottile (< 100 nm) per evitare rumore vasta di anelastica o moltiplicare sparsi gli elettroni, (ii) resiste l'alto vuoto del microscopio elettronico, e (iii) protegge le biomolecole da danno da radiazione. Due metodi principali vengono utilizzati per soddisfare questi prerequisiti: macchia negativa(NS)^19,20 procedure (Figura 1A) adsorbire il campione ad una pellicola di carbonio sottile, incorporare le biomolecole amorfo heavy metal e poi permette il montaggio ad asciugare all'aria. Questo è semplice e veloce, e le griglie di EM caricate (in seguito denominate "griglie campione") sono facili da memorizzare e può essere conservata per lunghi periodi di tempo (in genere anni). In TEM, i preparativi esibiscono contrasto elevato dovuto il NS e tollerano dosi più elettroni che cryo-preparati, ma la risoluzione è limitata a circa 20 procedure Å. Cryo-EM (Figura 1B) impiegare holey carbonio supporta. Una sottile pellicola della soluzione del campione è misurata attraverso i fori e la griglia di EM è immerso in un criogeno, solitamente liquefatto etano, raffreddare rapidamente sotto-150 ° C. Il risultato è un amorfo, vetrificati, da 50 a 100 nm di spessore pellicola della soluzione nei fori di supporto. Questa pellicola sottile amorfa resiste l'alto vuoto nel microscopio elettronico e, nel caso ideale, conserva strutture biologiche nel loro stato nativo. La procedura permette di campioni biologici per l'imaging in alta risoluzione. Tuttavia, la griglia di esempio dovrà essere conservata a temperature sotto-150 ° C in ogni momento per evitare devetrificazione. Può essere imaged utilizzando dosi di elettrone relativamente elevato a causa della bassa temperatura, ma il contrasto e rapporto segnale-rumore è comunque basso. Di conseguenza, vengono impiegate tecniche in media per aumentare il contrasto e, purché il campione è ripreso da diverse angolazioni, una mappa ad alta risoluzione tridimensionale (3D) può essere ricostruita. Il più comunemente usato e metodo altamente efficace per la ricostruzione 3D a partire da ora è l'approccio di singola particella. Per una rassegna recente, vedere Cheng altri.¹⁸.

Macchia negativa TEM (NS-EM) è importante per la selezione ed il controllo di qualità, quando è necessario ad alto contrasto o quando sono disponibili solo limitate quantità di campione (adsorbimento alla pellicola di carbonio generalmente concentrati nell'esempio). Singola particella cryo-EM è il metodo standard di oro se ricostruzioni 3D ad alta definizione della struttura della proteina sono destinate per.

Figura 1: principi di TEM griglia preparazione e confronto tra il classico (pannello A, B) e un approccio di microfluidica (pannello C, D). A) preparazione griglia classica NS-EM: circa 3 µ l di campione sono pipettati a mano su una griglia di EM coperta con una pellicola di carbonio continuo (in seguito denominata una 'griglia NS-EM') (i). Dopo un'incubazione di circa 10 s, carta da filtro viene utilizzato per cancellare via il liquido in eccesso dal lato (ii), lasciando le biomolecole adsorbite in una pellicola sottile d'acqua. Successivamente, la proteina viene incubata in una soluzione di sale di metallo pesante, per esempio, acetato di uranile 2%, per 20 s (iii) e nuovo il liquido viene rimosso dal macchiare dal lato utilizzando carta da filtro (iv). Infine, la EM-griglia viene lasciata per asciugare all'aria. B) preparazione griglia classica cryo-EM: circa 3 µ l di campione sono pipettati da una mano su una pellicola di carbonio holey. Per formare una pellicola sottile del campione, il liquido in eccesso viene rimosso tramite carta-macchiare il faccia-su da uno o entrambi i lati (ii). Infine, la griglia è rapidamente immerso nell'etano liquido per la vitrificazione (iii). C) preparazione griglia NS-EM utilizzando il programma di installazione di cryoWriter: volume A 5 nL viene aspirato dal calcio campione utilizzando un microcapillary (i). Per condizionamento del campione, la punta di microcapillary è immerso nella soluzione condizionata, ad esempio, 2% di acetato di ammonio. Ioni e piccole molecole vengono scambiati tramite diffusione (ii). Si noti che le dimensioni del microcapillary garantiscono che l'intero processo è guidato di diffusione. Le proteine hanno molto inferiore costanti di diffusione degli ioni di sale e non sono significativamente perso²⁴. Infine, il campione è erogato sulla griglia e lasciato asciugare (iii). D) principi di preparazione griglia cryo-EM utilizzando il metodo basato su cryoWriter: An EM griglia coperto con una pellicola di carbonio holey è posizionato sulla superficie di una piattaforma di controllo della temperatura e tenuto da pinzette. La temperatura della piattaforma è un offset dalla temperatura punto di rugiada dell'ambiente griglia. La griglia viene spostata rispetto a microcapillary contenente il campione e la microcapillary si abbassa fino a quando è alcuni micrometri sopra la griglia. Successivamente, pochi nanolitri di campione sono dispensati da esso, mentre la fase viene spostata in un modello a spirale; il liquido in eccesso è ri-aspirato (i). Dopo la griglia di EM di adescamento, il microcapillary è ritirato e la griglia rimane sulla piattaforma controllata di temperatura (successivamente indicati come punto di rugiada (DP) fase) per un breve periodo consentire una quantità controllata di campione di evaporare. Per immersione di congelamento, la griglia è rapidamente ritirata dal palco con le pinzette (ii), girata di 90° in posizione verticale e immerso in un bagno di criogeno (iii) (in seguito denominato 'pick-e-immersione' meccanismo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I metodi di preparazione griglia utilizzati per NS e cryo-EM, purtroppo, non hanno migliorato significativamente da quando sono stati inventati. Svantaggi attuali sono il consumo di campionamento elevate (ca. 3 µ l di proteina di 1 mg/mL) e la grande quantità (> 99%) del campione ha perso (Figura 1A, B). Inoltre, il metodo classico utilizzato per preparare le griglie per cryo-EM è una procedura dura per proteine: in primo luogo, si tratta di un vasto faccia-su carta-blotting passo (Figura 1B, ii), e, in secondo luogo, la proteina è esposto all'interfaccia aria-acqua per una quantità significativa di tempo²¹. Qui, un metodo alternativo per esempio pre-condizionamento, preparazione del campione griglia e post-elaborazione (griglia essiccazione o vitrificazione) per NS-EM (Figura 1,C) o cryo-EM (Figura 1D) è presentato. L'installazione di costruito in-House, chiamato "cryoWriter", utilizza miniaturizzato campione gestione principi di tecnologia e microfluidica per aspirare, condizione e dispensare campione, evitando carta assorbente completamente e fornendo metodi alternativi ai campioni sottili per Cryo-EM. Si significativamente riduce il consumo del campione e migliora il controllo utente sulla preparazione del campione nel suo complesso. Inoltre, il metodo consente applicazioni sperimentali innovative; ad esempio la preparazione di componenti biologici isolati di singole celle in un approccio chiamato "singola cella visual proteomics"^22,23,24,25.

Protocol

Un "cryoWriter" (Figura 2; per informazioni dettagliate vedere precedente lavoro^24,26,27) o strumentazione equivalente è richiesto per i seguenti protocolli. Un elenco dei fornitori per le parti principali e i materiali di consumo è dato nella Tabella materiali.

1. negativo preparazione griglia patacca (NS)

1. Accendere lo strumento e avviare il software. Inizializzare tutti i moduli necessari (controller di pompe siringa, fasi motore, telecamere di sorveglianza e fase di punto di rugiada).
2. Raffreddare il supporto del campione e la fase di rugiada. Se necessario, assicurarsi che la temperatura di rugiada fase è regolata 1-2 ° C sopra il punto di rugiada.
   Nota: La fase è raffreddata da un dispositivo commerciale Peltier con un regolatore di PID.
3. Preparare NS compilando un 100 o 200 µ l PCR tubo con 100-150 µ l di NS (ad es., disponibili in commercio tungstato di metilammina 2%). Posizionare il tubo sul supporto raffreddato ad esempio dello strumento.
4. Collocare l'esempio.
   1. Mettere il campione (0,5 - 1 µM) in una provetta PCR 100 o 200 µ l. Se meno di 50 µ l di campione è disponibile, tagliare il fondo di una provetta PCR con una lama di rasoio e usarlo come un campione bene. Questo farà sì che il microcapillary può raggiungere facilmente il campione.
      Nota: È più facile aspirare campioni da provette per PCR 100 o 200 µ l, perché il microcapillary utilizzato in seguito per aspirare il campione è leggermente inclinato e l'asse z viaggio-altezza è limitata.
   2. Posizionare il tubo/contenitore PCR sul supporto raffreddato campione nello strumento per evitare l'evaporazione. In alternativa, i campioni possono essere aspirati da piastre a pozzetti nell'incubatore microscopio fase superiore a temperatura ambiente; raffreddamento non è implementato per piastre a pozzetti.
5. Definire le posizioni. Utilizzare il joystick di cryoWriter che controlla il tavolino xy motorizzato e pulsanti di controllo del software per il lineari x, y e tavole di z per posizionare il microcapillary. Utilizzare la fotocamera per controllare la posizione del capillare.
   1. Spostare la microcapillary al serbatoio del campione. Immergere il puntale nel liquido del campione e salvare questa posizione come "campione".
   2. Spostare il microcapillary il tubo NS PCR, immergere la punta nella soluzione NS e salvare questa posizione come "macchia".
   3. Posizionare il microcapillary circa 100 µm sopra al centro dello slot dove la griglia di EM sarà posizionato e salvare questa posizione come "grid_save".
6. Aspirare il campione e condizionarla per NS-EM.
   1. Se non è già installato, è possibile montare una siringa 10-µ l (diametro interno 0,46 mm) su una pompa siringa di precisione.
   2. Incollare un'estremità di un microcapillary di silice fusa lunga 30 cm (diametro esterno 360 µm, diametro interno 150 µm) alla presa di siringa.
   3. Collegare le altre microcapillary fine di microcapillary per un breve (5 cm) lungo affusolato tramite connettore di piantaggio. La punta conica del microcapillary breve forma la punta applicatrice.
   4. Riempire la siringa con acqua bidistillata degassato (ddH₂O; sistema liquido) ed evitare la formazione di bolle d'aria.
   5. Dispensare alcune decine di nanolitri di liquido di sistema e rimuovere eventuali gocce da microcapillary con un panno privo di lanugine.
   6. Fare doppio clic sulla posizione salvata campione. Questo posiziona la microcapillary nel campione bene. Mentre il capillare si muove, dispensare 3 x 0,5 nL di liquido di sistema appena prima la punta microcapillary è immerso nel campione per impedire la bolla d'aria intrappolata lì (Vedi nota 2 di seguito).
   7. Aspirato 5 nL del campione.
   8. Fare doppio clic su NS posizione salvata. Il microcapillary è ritirato dal contenitore del campione e spostato automaticamente il serbatoio di NS. Mentre il capillare si muove, manualmente dispensare 3 x 0,5 nL di campione liquido appena prima che la punta è immerso nel serbatoio per assicurarsi che non ci sono nessun aria bolle (Vedi nota 2 di seguito).
      Nota: importante: (1) quando si passa dall'aspirazione a modalità di erogazione o viceversa, c'è una piccola perdita in corsa pistone dovuta a backlash negli ingranaggi della pompa a siringa. Secondo il produttore, il contraccolpo di una nuova unità si trova tra 7 e 12 µm. Per la nostra siringa con un diametro del barilotto di 0.46 mm, questo si traduce in 1-2 nL. Di conseguenza, 1-2 nL può essere "erogata", prima campione è effettivamente erogato. Di solito, una minuscola goccia comincia a uscire la punta microcapillary dopo il terzo 0.5 nL dispensare passo. (2) una bolla d'aria intrappolata sopra/sotto l'esempio sarebbe rendere erogazione meno accurato e prevenire condizionata campione di diffusione.
   9. Lasciare il microcapillary immerso per 3-12 min, a seconda del buffer del campione e la geometria dell'ugello.
      Nota: Maggiore è la sale e/o fosfato concentrazione nel buffer, più il tempo di immersione richiesto. NS (relativamente rapidamente) diffonde nella spina del campione mentre sali tampone (relativamente veloce) e proteine (molto più lento) diffusa fuori. Questo abbassa la concentrazione di Sali tampone del campione impedendo loro di cristallizzazione quando si asciuga la griglia caricata. Ulteriormente, fosfato tende a formare un precipitato in combinazione con il NS.
7. Preparare una griglia e depositare un posto del campione condizionato.
   1. Mentre il campione è essere condizionato, prendere un pezzo di nastro adesivo e un blocco PDMS e pulito il lato superiore di PDMS applicando e rimuovendo il nastro adesivo per garantire che non vi è nessuna polvere. Mettere il blocco PDMS in una capsula di Petri.
      Nota: Nuovi blocchi di PDMS sono presi dalla camera pulita.
   2. Raccogliere con cura una griglia (ad es., Cu, 200 o 400 metallica rivestita con pellicola di Parlodion/C). Fare attenzione a toccare solo il bordo della griglia con le pinzette. Posizionarlo sul blocco PDMS pulito con la pellicola di carbonio rivolto verso l'alto.
   3. Posto il blocco PDMS con la griglia in aria-effluvio e bagliore scaricarla per 20 s con 100 W di potenza a 0,4 mbar. Conservare la griglia in una capsula di Petri chiusa. Tempi più lunghi di scarico bagliore generalmente conducono ad una più grande diffusione del volume campione depositato sulla griglia di partenza. Di conseguenza, diventa più sottile lo strato di macchia (macchia più debole).
   4. 1 min prima che il tempo di immersione è scaduto, afferrare la griglia bagliore-scaricate con le pinzette di cryoWriter. Verificare che l'elettromagnete è acceso; in caso contrario accendere nel software. Montare le pinzette all'elettromagnete e utilizzare la vite di micromanipolatore manuale per allineare la griglia piatta sul palco rugiada, lato pellicola carbonio alto. Assicurarsi che la temperatura di rugiada fase è regolata 1-2 ° C sopra il punto di rugiada per ridurre il tasso di evaporazione dopo il caricamento del campione.
   5. Quando il tempo di immersione è scaduto, fare doppio clic su "grid_save". La punta di microcapillary sarà posta in modo sicuro sopra la superficie di griglia. Portare manualmente la punta microcapillary a contatto con la griglia. Sollevare l'ugello da 10 µm e posizionarlo sopra il centro.
      Attenzione: Alcuni campioni contenenti detergenti tendono a salire lungo la superficie esterna della microcapillary quando il liquido viene erogato a causa della bassa tensione superficiale. È importante essere molto vicino alla superficie di griglia per impedire tali perdite.
   6. Dispensare 5 nL del campione sulla griglia. In un giorno asciutto, rapida evaporazione avviene quando la punta di microcapillary, uno può erogare anche lentamente fino a quando il campione è sulla punta e poi rapidamente dispensare 5 nL.
   7. Ritirare il microcapillary e lasciare il campione condizionato asciugare lentamente sul palco del punto di rugiada (DP-fase).
   8. Una volta che il punto campione è asciutto, togliere la griglia e conservarla a temperatura ambiente in una casella della griglia o piastra di Petri.
   9. Dispensare 500 nL di liquido di sistema dalla microcapillary e rimuoverlo con un panno privo di lanugine. Sciacquare il capillare 5 volte con etanolo, detergente o 1 M NaOH. Questo pulisce la microcapillary per essere utilizzato con un campione diverso.

2. griglia Cryo preparazione

1. Per preparare lo strumento ed il campione, seguire passaggi 1.1 a 1.5 descritti sopra. Se NS non è necessario, omettere i passaggi 1.3 e 1.5.2. Per scambiare la sample buffer o condizionare il campione per cryo-EM di dialisi, per esempio, per ridurre la concentrazione del buffer di sali o per introdurre additivi (ad es., trealosio, detergenti) utilizzano il buffer desiderato anziché NS nei passaggi 1.3 e 1.5.2.
2. Preparare etano liquido in un contenitore standard cryo.
   1. Montare la Coppa di etano, cryo box titolare e ragno e riempire il contenitore criogeno fino all'orlo con azoto liquido; richiede solitamente circa 200 mL. Attendere alcuni minuti fino a quando la Coppa di etano si è raffreddato ed è libera di azoto liquido.
   2. Aprire la bombola del gas etano e lentamente lascia il flusso del gas nella tazza etano. Lasciarlo a riempire con etano liquido fino a quando il livello è 2-3 mm sotto la parte superiore; Questo richiede pochi minuti e richiede circa 5 mL di etano liquido.
   3. Prendere una scatola di cryo e inserirlo in uno slot libero nel contenitore criogeno.
   4. Rimuovere il ragno, adagiarvi il coperchio di polistirolo e posizionare il contenitore criogeno il montaggio nella cryoWriter.
3. Effluvio una griglia di EM.
   1. Prendete un pezzo di nastro adesivo e un blocco di polidimetilsilossano (PDMS) e pulire il lato superiore PDMS applicando e rimuovendo il nastro adesivo (rimuove eventuali residui di polvere). Mettere il blocco PDMS in una capsula di Petri.
   2. Scegliere attentamente una griglia dalla casella griglia. Fare attenzione a toccare solo il bordo della griglia con le pinzette. Posizionarlo su un blocco PDMS pulito con la pellicola di carbonio holey rivolto verso l'alto.
   3. Posto il PDMS bloccare con la griglia in un plasma cleaner e al plasma-pulire la superficie di griglia (ad es. uso 75% Ar/25% H_2, potenza 50 W, pressione 25 mTorr). Posizionare il blocco PDMS con la griglia di Scarica a bagliore in una capsula di Petri.
4. Posizionare la griglia nello strumento
   1. Afferrare la griglia bagliore-scaricate con le pinzette di cryoWriter. Verificare che l'elettromagnete è acceso; in caso contrario accendere nel software. Montare le pinzette sull'elettromagnete e con la vite di micromanipolatore manuale per allineare la griglia piatta sul palco, lato pellicola carbonio fino.
   2. Fare doppio clic su "grid_save". Regolare la posizione di microcapillary in modo che la punta è di circa 10 µm sopra la superficie della griglia. Assicurarsi che il microcapillary possa muoversi liberamente attraverso la rete senza toccarla ovunque, se necessario ritirare la microcapillary pochi micrometri.
   3. Torna al centro della griglia e salvare la nuova posizione come "griglia".
      Attenzione: Denominazione corretta è obbligatorio per lo script di macro funzionare.
5. Scrivere griglia campione e tuffo-freeze.
   1. Sciacquare il microcapillary con poche decine di nanolitri di liquido di sistema e rimuovere eventuali gocce da microcapillary con un panno privo di lanugine.
   2. Avviare script macro. La macro verrà eseguite le seguenti operazioni:
      1. Dispensare 5 nL (per rimuovere eventuali bolle d'aria all'estremità) e passare alla posizione del campione.
      2. Aspirato 65 nL del campione. Infondere 5 nL nuovamente dentro la provetta del campione. Questo account per il sistema di gioco e consentire la scrittura sincronizzato, cioè., per garantire tale erogazione e fase inizio movimento allo stesso tempo.
      3. Spostare nella posizione "griglia".
      4. Avviare 'modello di scrittura', che causerà il microcapillary a muoversi attraverso la griglia, erogazione contemporaneamente 45 nL del campione.
      5. In seguito, spostare indietro il microcapillary al centro della griglia, abbassarlo un altro 10 µm e ritirare il liquido in eccesso campione.
      6. Ritirare il microcapillary e spegnere l'elettromagnete. Questo rilascia il tuffo pinzette ed avvia il congelamento.
6. Afferrare le pinzette e rilasciare con attenzione la scheda magnetica dallo stantuffo. Rapidamente trasferire la griglia dalla tazza etano nel contenitore criogeno contenente la casella di cryo e posizionare la griglia in uno slot libero.

3. preparazione del Lysate single-cell

1. Preparare i microcapillari per elettroporazione.
   Nota: I microcapillari silice fusa conici (laser-tirato e ispezionato) hanno un rivestimento protettivo di polyimide all'esterno, fatta eccezione per la punta, dove il rivestimento è bruciato fuori durante il processo si assottiglia.
   1. Per ricoprire i microcapillari con uno strato conduttivo, montarle con un angolo di 45° su un binario in metallo, con le punte rivolte verso l'alto. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggere l'estremità inferiore (2 cm) delle punte, come non patinata polyimide costituisce il miglior sigillo con i connettori press-fit impiegati più tardi.
   2. Sputter depositare uno strato appiccicoso di 20 nm Ti/W e quindi un 200 nm-spessore strato di Pt.
2. Fare la punta microcapillary idrofobo.
   1. Preparare una soluzione 1 M di 1-dodecanethiol in EtOH.
   2. Effluvio microcapillary in aria per 1 min con 100 W di potenza a 0,4 mbar.
   3. Immergere la punta del microcapillary nella soluzione 1 M di 1-dodecanethiol per poche ore (idealmente durante la notte).
      Nota: Si consiglia di preparare suggerimenti appena un giorno prima dell'uso.
3. Installare un nuovo microcapillary.
   1. Rimuovere il microcapillary dalla soluzione 1-dodecanethiol, risciacquate la parte esterna con etanolo e sciacquare l'interno con etanolo usando una siringa.
      Nota: Se nessun microcapillari funzionalizzati sono disponibili, rapidamente bagliore la punta di un microcapillary di scarico e immergerlo in una goccia di trattamento di finestra auto commerciale, che è una miscela di acido solforico e PDMS. La funzionalizzazione idrofobica risultante non è buono come con 1-dodecanethiol, ma generalmente sufficiente.
   2. Fendere la sua fine non patinata con un cutter capillare.
      Nota: Un taglio netto è importante per una buona tenuta con il connettore press-fit.
   3. Utilizzare uno stuzzicadenti per applicare pasta d'argento per il boarder forte formato tra il vetro e il rivestimento di polyimide quando il rivestimento di polyimide è stato bruciato dal laser durante tirare capillare.
      Nota: Questo rinforzo è necessario in quanto il rivestimento di Pt è molto debole in questa regione, e conduzione elettrica può facilmente abbattere.
   4. Lavare la fine di polyimide di microcapillary con acetone. Alla fine di lasciare una piccola goccia di acetone e inserirla nel foro del connettore press-fit. Applicare una leggera pressione per formare una buona tenuta.
4. Calibrare la posizione di microcapillary.
   1. Accendere lo strumento e avviare il software come descritto al punto 1.1. Inoltre, inizializzare la fotocamera di microscopio e il generatore di funzioni.
   2. Posto un vetrino per microscopio nel porta-diapositive sul microscopio.
   3. Abbassare il microcapillary vicino il vetrino e centrarlo rispetto all'obiettivo del microscopio, finché viene visualizzata nella vista Telecamera microscopio. Utilizzare le fasi lineari x - e y-asse per posizionare la punta della microcapillary al centro dell'immagine. Quindi abbassare lentamente la punta fino a toccare leggermente il vetrino.
      Attenzione: Scegliere passi molto piccoli (5 µm) verso l'approccio finale. In caso contrario, la punta può essere danneggiata.
   4. Premere il tasto "Calibra ugello". Questo si ritrae il microcapillary 40 mm e consente di impostare questa posizione come home posizione.
5. Preparazione di pezzi PDMS timbrato e ITO diapositive
   1. PDMS mix ed induritore in rapporto 10:1, versare in un grande piatto di Petri ad una profondità di circa 2-3 mm. cuocere a 60° C per un paio d'ore in un'incubatrice di ibridazione o un dispositivo simile.
   2. Con un martello e un timbro (12 mm di diametro), tagliare fori nello strato PDMS. In seguito, è possibile utilizzare un bisturi per tagliare 2 cm lungo quadrati o rettangoli compresi i fori per ottenere pezzi stampati che si adattano su un vetrino da microscopio. Di solito, due pezzi stampati sono montati su un vetrino.
   3. Lavare i pezzi PDMS e le diapositive di ITO prima con detergente e poi con etanolo al 70%. Posto loro, bagnato, in una capsula di Petri e lasciare che l'etanolo completamente evaporare in un forno a 60° C.
   4. Bagliore-Scarica le diapositive di ITO per 1 min con 100 W di potenza a 0,4 mbar e quindi applicare 1 mL di soluzione di rivestimento (ad es., poli-L-lisina (PLL)). Incubare per 5 minuti, rimuovere la soluzione con una pipetta e applicare 1 mL di ddH₂O. leggermente agitate per 1 min e quindi rimuovere il ddH₂O con l'ausilio di una pipetta. Asciugare i vetrini a 60° C.
6. Preparare la coltura delle cellule. Seguire il protocollo standard aderente-cellula coltura (ad es., Arnold, et al. ^{24 , 25}). le cellule su ITO del seme durante le esecuzioni di spaccare/passaggio normale.
   1. Prendete una diapositiva appena rivestite con PLL ITO e aggiungere un pezzo PDMS. Applicare un po' di pressione per formare un sigillo a tenuta stagna. Questo produce piccoli pozzi con la diapositiva come loro base.
   2. Aggiungere circa 300 µ l di cellule sospese in mezzo fresco ai pozzetti PDMS. La densità di semina dovrebbe essere circa 75.000 cellule per pozzetto.
   3. Incubare i vetrini di ITO per 1-2 giorni in condizioni standard.
7. Preparare per esperimento di lisi delle cellule:
   1. Pre-riscaldare pochi millilitri di buffer di elettroporazione (ad es., tamponato fosfato salino (PBS)).
   2. Preparare il set-up per la preparazione di griglia NS-EM
      Nota: Dettagli per preparare il set-up sono espresse in punti 1.1-1.5 (per NS) o passaggio 2.1-2.4 (per cryo). Qui descriviamo i passi più importanti per la preparazione di NS.
      1. Preparare NS compilando un 100 o 200 µ l PCR tubo con 100-150 µ l di NS (ad es., disponibili in commercio tungstato di metilammina 2%). Posizionare il tubo sul supporto raffreddato ad esempio dello strumento.
      2. Spostare il microcapillary il tubo NS PCR, immergere la punta nella soluzione NS e salvare questa posizione come "macchia".
   3. Caricare i parametri di lisi standard, ad esempio, la tensione di lisi.
   4. Prendere lo scorrimento ITO dall'incubatrice e montarlo sull'inserto microscopio. Utilizzare due viti per fissare la diapositiva sull'inserto di alluminio e per assicurare il contatto elettrico fra l'ITO rivestimento della slitta e il telaio in alluminio elettricamente a terra.
   5. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare e lavare due volte con 300 µ l di tampone di elettroporazione. Mantenere le cellule nel buffer di elettroporazione.
   6. Collocare l'inserto di alluminio che tiene la diapositiva di ITO in fase di incubatore cellule vive sul setup.
   7. Individuare la coltura delle cellule nella vista microscopio e scegliere una zona con nessuna cellula. La punta si avvicinano alla superficie di ITO e delicatamente toccarlo, poi ritirare la punta 100 µm e salvare la posizione come "celle".
   8. Rapidamente lasciare la coltura delle cellule e lavare la punta microcapillary con poche decine di nanolitri di liquido di sistema quindi messo in coltura delle cellule di nuovo. Erogare alcuni nanolitri durante l'immersione nel pozzo PDMS per non garantire che nessun aria bolle sono intrappolate sulla punta.
   9. Approccio delicatamente la superficie di ITO (inizialmente, è necessario essere in posizione "cellule", vale a dire., 100 µm sopra la superficie). In caso di contatto, ritrarre punta 10 µm.
   10. Selezionare una cella vicina per lisi. Posizionare la punta della microcapillary sopra la cella di destinazione.
8. Avviare lo script di macro per cella singola lisi.
   1. Nome la posizione il microcapillary dovrebbe essere spostato dopo una cella ha stata lisata con successo. Questo sarà il serbatoio di NS (NS-EM), un buffer di dissalazione (cryo-EM) o la griglia di EM (cryo-EM). Evitare errori di ortografia e premere "ok".
   2. La macro viene eseguita senza l'intervento dell'utente:
      1. i) il microscopio fase e cella cultura 100 µm vengono spostati a sinistra, uno snapshot della cella mirato è preso e 50 nL di ddH₂O liquido di sistema sono dispensati dalla microcapillary. Questo si sposta e diluisce il tampone salino elevato e si applica pressione osmotica alla cella.
      2. II) lo stadio viene spostato indietro per posizionare di nuovo la punta sopra la cella di destinazione. La raffica di tensione predefinito viene applicata, e dopo 500 ms il sistema pompa inizia ad aspirare 3 nL del campione ad una portata di 2 µ l/min.
      3. III) lo stadio viene spostato a sinistra ancora una volta, permettendo la cella deve essere controllato. Appare una finestra, che chiede per l'input dell'utente.
   3. Dire se il passaggio di Lisi è stato completato o non.
      1. Se la risposta è no, prendono il sopravvento, la microcapillary a filo e una nuova cella di destinazione.
      2. Se la risposta è sì, viene eseguito uno snapshot della cella (lisato) rimosso, e in seguito il microcapillary viene spostato nella posizione specificata in 3.8.1. Se si tratta di NS o un serbatoio tampone, è possibile utilizzare l'interfaccia utente standard per dispensare 3 x 0,5 nL di liquido mentre il microcapillary si sta muovendo per assicurarsi che non siano senza bolle d'aria. La punta è immersa nel liquido serbatoio dalla macro.
         Nota: È possibile continuare a condizionare il campione e preparare griglie come spiegato nelle sezioni 1.6.9 - 1.7.9 per NS-EM o sezione 2.2-2.6 per cryo-EM. Di seguito sono spiegati i passi necessari per la preparazione di NS-griglia.
   4. Lasciare il microcapillary immerso per 8-12 minuti, a seconda della geometria dell'ugello
      Nota: La concentrazione di fosfato ad alta nel buffer richiede un tempo più lungo di immersione per il condizionamento.
   5. Dispensare 5 nL della cella climatizzata lisata sulla griglia.
   6. Ritirare il microcapillary e lasciate che il campione condizionato asciugare lentamente la fase del punto di rugiada (DP-fase) regolato 1-2° C sopra la temperatura del punto di rugiada.
   7. Togliere la griglia e conservarla a temperatura ambiente in una casella della griglia o piastra di Petri.

Results

Il programma di installazione di "cryoWriter" è stato sviluppato (raffigurato in Figura 2) al fine di testare le procedure di preparazione dei griglia EM miniaturizzate proposte in Figura 1C, D. Figura 2 A Mostra una panoramica dei vari componenti montati ad un microscopio a fluorescenza inversa. Un modulo di coltura delle cellule è installato sul lato sinistro del microscopio; un modulo per la preparazione di griglia EM si trova sulla destra. Il modulo di messa in coltura delle cellule (Figura 2B) permette la crescita delle cellule eucariotiche aderenti e formazione immagine di cellule vive della coltura delle cellule al microscopio ottico. Le singole celle vengono lisate dall'azione combinata di shock osmotico, elettroporazione e aspirazione del contenuto della cella in un microcapillary (Figura 2B, Figura 6A)^24,25. Il campione lisato aspirato quindi può essere utilizzato per preparare griglie per NS - o cryo-EM. In alternativa, una soluzione di riserva della proteina in un tubo PCR può essere l'origine di esempio. Microcapillary (Figura 2B) impiegato è collegato ad un sistema di pompa ad alta precisione che consente volumi di campione essere aspirato e dispensati con precisione sub-nL. Come dettagliato nei protocolli, tutta l'elaborazione del campione viene eseguita all'interno di questo microcapillary o sulla griglia EM stessa senza trasporto campione significativo. Ad esempio, la stessa microcapillary viene utilizzato per lisare cellule eucariotiche individuali, aspirare il lisato, condizionarla e infine dispensare aliquote su griglie di EM. Il modulo di preparazione griglia è costituito da una DP-fase mobile che permette la temperatura della griglia EM collocata su di esso per essere precisamente controllata (Figura 2C). Per NS-TEM, la griglia del campione preparato possa semplicemente essere rimosso dalla fase fredda e lasciata asciugare all'aria a temperatura ambiente. Tuttavia, i cosiddetti effetti di anello di caffè che potrebbero quindi devono essere evitati per quantitativi TEM dove proteina 'particelle' sono contati. A tale scopo, griglie sono asciugati lentamente sulla scena DP utilizzando un gradiente di temperatura gradualmente crescente di rallentare di evaporazione del liquido. Per cryo-EM, la temperatura della griglia è mantenuta vicino al punto di rugiada; viene scelto un offset positivo di circa 8 ° C, permettendo l'evaporazione controllata del campione liquido per stabilizzazione di film sottile e diradamento, che può essere monitorata da un sensore se necessario²⁶. Dopo il tempo di diradamento selezionato, viene attivato un meccanismo di pick-e-immersione e il campione è vetrificato (Figura 2C). Si noti che non è necessario questo meccanismo immergendo per griglie di NS-EM, che sono conservati a temperatura ambiente.

Figura 2: Panoramica dell'installazione cryoWriter. A) Panoramica dell'installazione cryoWriter montato su un luce-microscopio inverso (1). B) inserto di zona indicato sul lato sinistro nel pannello vano di coltura delle cellule di r. (2), con un microcapillary (3) per la lisi delle cellule e la manipolazione del campione posizionato sopra una piastra di coltura cellulare basato su PDMS miniaturizzati (4). C) inserto di zona indicato sul lato destro nel meccanismo di pannello a. 'Pick-e-immersione'. Una griglia di EM di holey carbonio pellicola (5) è montata tra le punte delle pinzette (6) e posizionata orizzontalmente a diretto contatto con la fase di controllo della temperatura (7), di cui come la fase del punto di rugiada (DP-fase) nel testo principale. La temperatura di fase è strettamente controllata tramite un regolatore di PID e un elemento Peltier raffreddato ad acqua, mantenendola presso o vicino la temperatura del punto di rugiada, a seconda del contesto ambientale. DP-fase (7) è montata su un asse xy motorizzato per spostare la griglia rispetto la microcapillary. La microcapillary stessa è montata su una z-fase e può essere abbassato fino a quando non è molto vicino alla superficie della griglia EM e usato per erogare volumi di dimensioni nanolitro sul supporto esempio coprendolo (uno strato di carbonio sottile continuo per NS-EM o una pellicola di carbonio holey per cr yo-EM). Si noti che l'assorbimento di liquido e di erogazione viene eseguita utilizzando un sistema di pompa ad alta precisione (8). Il liquido dosato può essere distribuito da spostando la griglia rispetto la microcapillary in un modello a spirale. Per la preparazione di cryo-EM, il meccanismo di congelamento pick-e-immersione (9) trasferisce rapidamente la griglia campione caricato in etano liquido (10) per raffreddamento rapido e vetrificazione di campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La figura 3 Mostra risultati rappresentativi ottenuti per griglie di NS-EM preparati utilizzando l'installazione di cryoWriter. La punta della microcapillary è stata caricata con 5 nL di campione da una soluzione madre e tuffato in un serbatoio di soluzione di NS (tungstato di 2% metilammina) per alcuni minuti per consentire lo scambio diffusivo di NS e ioni di sale (per una discussione teorica vedere Arnold, et altri ²⁴). in seguito, l'esempio condizionata era erogata sulla pellicola carbonio sottile di una griglia di NS-EM e asciugato. Figura 3 A Mostra l'uso di una griglia di slot nello stesso modo di visualizzare la gocciolina completa, come richiesto per quantitativi TEM. Per evitare l'effetto di anello di caffè, la griglia appena scaricata bagliore era inizialmente tenuta alla temperatura di rugiada (no evaporazione dell'acqua) e poi lentamente riscaldata sulla scena DP. Si noti, che per la maggior parte delle applicazioni (ad es., controllo di qualità del campione o analisi strutturale) non è necessario questo processo lento-essiccamento. Alta qualità NS-preparazioni sono ottenute senza di essa, come mostrato nella Figura 3B, C. Condizionata volte per i fosfati basso sale buffer sono circa 3 min, ad es., con basso contenuto di sale Tris-tampone (20 mM Tris-HCl pH 7.4 con 50 mM NaCl), come mostrato nella Figura 3B utilizzando virus del mosaico del tabacco (TMV) come campione. Figura 3 C presenta uno scenario peggiore come il TMV era in tampone PBS (2.7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7.4). Gli ioni fosfato formano cristalli transitorie con gli ioni di metalli pesanti del NS (Vedi Figura 5C), allungando il tempo di condizionata necessario (7 min). Altri sali di metalli pesanti possono essere utilizzati anche con il modulo di preparazione griglia, ad esempio, 2% metilammina vanadato o Ammonio molibdato (Vedi anche Arnold, et al. ²⁴). Tuttavia, acetato di uranile non è adatto; l'effetto di reticolazione di questa macchia conduce agli aggregati se il campione della proteina è condizionato in soluzione, prima di adsorbimento di un carbonio pellicola (Vedi Figura 5E)²³.

Figura 3: i risultati tipici per griglie di NS preparati utilizzando il programma di installazione di cryoWriter come indicato in Figura 1C. A) immagine panoramica di una goccia di nL 3 erogata su una griglia di slot dopo condizionamento con 2% tungstato di metilammina. B) TMV in tampone TRIS, 20 mM. L'inserto mostra un ingrandimento 3x della regione indicata. Adattato da Arnold, et al.²⁴ (ulteriori autorizzazioni relazionate al materiale tratto devono essere indirizzate per l'ACS). C) virus del mosaico del tabacco (TMV) in tampone PBS. L'inserto mostra un ingrandimento 3x della regione indicata. Adattato da Arnold, et al.²⁴ (ulteriori autorizzazioni relazionate al materiale tratto devono essere indirizzate per l'ACS). Scala bar: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati tipici ottenuti per griglie di cryo-EM preparati utilizzando l'installazione di cryoWriter sono rappresentati in Figura 4. Pannello 4A Mostra un Atlante di griglia dell'area coperta dal campione vetrificato. 4B pannello mostra l'omogeneità del ghiaccio vitreo in uno slot della griglia selezionata. In entrambi i casi, il campione era in 25 millimetri HEPES-KOH pH 7.5, tampone di 50 mM NaCl contenente detersivo Fos 14 0,05%. Sono stati testati molti campioni e buffer e un ghiaccio vitreo di alta qualità paragonabile è stata ottenuta, ma le condizioni necessarie sono buffer dipendente (Vedi anche la discussione di Figura 5). Pannello 4C Mostra apoferritina particelle e un batteriofago in tampone Tris-HCl (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7.4) ripreso a alta defocus per aumentare il contrasto. Pannello 4D Mostra una proteina di membrana di 200 kDa stabilizzata da amphipoles.

Figura 4: risultati tipici per griglie di cryo-EM preparati utilizzando il programma di installazione di cryoWriter come indicato in Figura 1D. I campioni e i buffer di variano negli esempi illustrati. Tutti i campioni sono stati caricati sulle pellicole di carbonio holey. A) Collage di immagini di panoramica ("Atlante di griglia") di un campione contenente una proteina di membrana di 150 kDa, la periferia del ghiaccio vitreo è indicato da frecce bianche. B) allargata alloggiamento griglia da una griglia preparata con lo stesso buffer, mostrando la pellicola di carbonio holey con ghiaccio vitreo. Alcuni fori non sono riempiti con tampone del campione, come indicato dalle frecce bianche. C) foro di carbonio vetrificato campione contenente apoferritina complessi proteici e batteriofagi. Inserto: allargamento di duplice mostrando la coda di un batteriofago. L'asterisco bianco indica la pellicola di carbonio. Si noti che l'immagine è stata registrata con alta defocus per aumentare il contrasto. D) A 200 kDa proteina di membrana ricostituita in amphipols. Inserto: un 2 x ingrandimento della regione indicato indicato con maggiore contrasto. Scala bar: A, 100 µm; B, 10 µm; C e D, 80 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'impostazione di cryoWriter permette sistematica di screening per le condizioni ottimali di preparazione EM-griglia; un esempio è mostrato in Figura 5A (apoferritina in 25 mM HEPES-KOH a pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% Fos 14). In questo esperimento, il ghiaccio vitreo "assottigliamento" temperatura era varia, ma il tempo d'assottigliamento (cioè, il divario di tempo tra l'applicazione di esempio e congelamento di tuffo) è rimasto costante (1 s). A basse temperature offset (ad es., 8K), lo strato di campione era troppo spesso. Alle più alte temperature di offset, il ghiaccio vitreo nei fori era più sottile (10K, 12K), fino a un certo punto (sopra 18 carati), la griglia è diventato completamente a secco (non mostrato). I risultati presentati qui, un offset di 12K conduce ad una grande area omogenea di ghiaccio vitreo come indicato dalle frecce nere. Tali esperimenti di ottimizzazione possono essere eseguite con il buffer del campione mirato utilizzando "testare" le proteine (come apoferritina). Le migliori condizioni presenti vengono quindi applicate al campione di destinazione. Inoltre, griglie con parametri lontano l'optimum spesso possono essere riconosciuti durante la procedura di preparazione e non è necessario essere proiettato nel microscopio elettronico, risparmio di tempo significativo. La figura 5 Mostra anche una galleria di tipico cryo-EM (pannello B) e manufatti di NS-EM (pannelli da C a E) specifico per la configurazione di cryoWriter. La griglia di cryo-EM mostrata nel pannello 5B con TMV in PBS contenente 0,1% decyl-β-D-maltopyranoside (2.7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7.4, 0.1%DM) era eccessivamente assottigliata. Lo sfondo dell'immagine è sgranato perché la concentrazione di sale è diventato troppo alto. In generale, l'aspetto visivo di un campione non sembra essere una funzione lineare della concentrazione salina; grani improvvisamente diventano importanti quando viene raggiunta una concentrazione di soglia durante il processo di diradamento. Si noti che sostanze indesiderate possono essere rimossi da una fase di condizionamento prima della preparazione di griglia, come descritto per il NS-EM nel protocollo sezione 1.6. NS possono causare altri artefatti. Nell'esempio riportato nel pannello 5C, tampone PBS (2.7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7.4) senza campione fu condizionato in tungstato di metilammina 2% per minimo 3 precipitati e cristalli sono evidente ed esercitano forze estese sulla superficie del carbonio che conduce alle crepe. L'unica forma di precipitati in una certa concentrazione di PBS e NS gamma e può essere evitato dal condizionamento del campione per più tempo (confronta Figura 3C). Pannello 5D Mostra la periferia di una goccia di campione NS dispensata esibendo un "anello di caffè". Questo disturberebbe analisi quantitativa, totale del campione e può essere evitato rallentando il processo di essiccazione, cioè, di mantenere la griglia EM alla temperatura punto di rugiada durante l'applicazione di esempio e quindi aumentando gradualmente la temperatura per asciugarla ( vedere Figura 3A). Pannello 5E (apoferritina in 20 mM HEPES, pH 7.0, condizionato 3min) Mostra l'attività di reticolazione di macchia di acetato di uranile 2%, che non può essere utilizzato per campioni proteici condizione prima che essi sono adsorbiti ai supporti pellicola carbonio.

Figura 5: cambiamenti sistematici e artefatti osservata quando il set-up cryoWriter è stato usato per preparare griglie per NS - e cryo-EM. A) variazione di spessore del ghiaccio vitreo sistematico; ottimizzazione della preparazione di griglia per cryo-EM. La temperatura di offset della DP-fase era vario (8 a 12 K) mantenendo il diradamento costante di tempo (1 s). Le frecce indicano la periferia dello strato del campione. B) sale effetti; troppo altamente concentrato, cioè, il diradamento passo era troppo lungo. L'inserto raffigura un ingrandimento 2x della regione indicata. C) precipitati formati da tampone PBS in presenza di sali di metalli pesanti del sale. Campioni contenenti tampone PBS devono essere condizionati più di campioni in altri buffer. Qui, tampone PBS senza campione fu condizionato in tungstato di metilammina 2% per 3 minuti, un tempo tipico per altri buffer di campione. Si noti il crack nel film carbonio molto probabilmente dovuto le forze forti dai precipitati che agisce sul supporto sottile durante il processo di essiccazione. D) effetto 'Caffè anello'. E) apoferritina condizionata in acetato di uranile 2% per gli ioni di uranile 3 min mostrano reticolazione significativa attività e l'apoferritina cluster formare grandi aggregati. Scala bar: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; S, 80 µm; E, 200 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La piccola quantità ed il volume necessario per la preparazione di griglia EM utilizzando il programma di installazione di cryoWriter consente nuovi tipi di esperimenti. Ad esempio, il contenuto totale di una singola cella può essere raccolto e preparato per NS - e cryo-EM. La procedura è indicata in Figura 6A. Una cellula eucariotica, aderente (HEK 293) viene lisata di elettroporazione simultanea e campione aspirazione (pannello 6A)²⁵. Un volume totale di 3 nL è aspirato, che contiene il lysate delle cellule e viene mantenuta in microcapillary per un'ulteriore elaborazione. Per il NS-EM mostrato nel pannello 6B, il mezzo di coltura delle cellule è stato scambiato con il tampone PBS (2.7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7.4) prima della lisi cellulare. Il contenuto della cella sono stato aspirato in 3 nL del buffer e condizionata in un serbatoio di NS come indicato in Figura 1C per 10 min. in seguito, un volume di nL 5 è stato erogato sulla pellicola carbonio continuo di una griglia di NS-EM. Singole proteine, ad esempio, actina filamentosa e patch di membrana con annesso proteine può essere riconosciuta nell'immagine. Per la cryo-EM, mostrata nella Figura6 C, un volume di 3 nL è stato erogato su una griglia di holey carbonio EM senza ri-aspirazione per rimuovere il liquido. Il film relativamente spesso del campione formato era ampiamente assottigliato prima di vetrificazione. Per effettuare questa operazione, la temperatura di DP-fase è stata aumentata gradualmente, a partire dalla temperatura di rugiada. Il processo di diradamento è stato monitorato da un sistema di sensori in tempo reale fino a quando è stata raggiunta una soglia pre-specificata innescare il meccanismo di 'pick-e-immersione' e vetrificazione di campione (per dettagli vedere Arnold, et al. ²⁶). strutture della membrana e proteine possono essere riconosciute nell'immagine.

Figura 6: singola cella visual proteomica utilizzando il set-up cryoWriter. A) lisi di una cellula eucariotica aderente. La cella è coltivata (1, verde) su un funzionalizzati, ITO rivestito (rosso)-lastra di vetro (2) in miniaturizzati di Petri (3)²⁵. Lo strato di ITO è elettricamente a terra. La cella viene avvicinata da microcapillary (4), che è rivestita con platino. Un iniziale shock osmotico (non indicato) è dato per facilitare la lisi, che viene eseguita da una serie di impulsi elettrici e dalle forze di taglio esercitate durante l'aspirazione del lysate delle cellule. Il processo può essere monitorato da microscopia chiara; la lente dell'obiettivo del microscopio è indicato (5). Per informazioni dettagliate, vedere il nostro precedente lavoro^24,25. B) immagine di NS-EM di lisato da una singola cella di HEK 293. Filamentose actina e membrana patch con proteine associate sono visibili. Pannello adattato da Arnold, et al.²⁴ (ulteriori autorizzazioni relazionate al materiale tratto devono essere indirizzate per l'ACS). C) immagine di Cryo-EM di lisato da una singola cella di HEK 293. L'inserto mostra un ingrandimento 2x della regione indicata dove sono visibili strutture tipiche della membrana con proteine associate. Pannello C adattato da Arnold, et al. ²⁶ barre della scala: B, 50 nm; C, 80 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Lo strumento di 'cryoWriter' e i protocolli richiesti per preparare griglie campione per NS - e cryo-EM da volumi di campione totale nL dimensioni e completamente evitare il passaggio di carta-blotting classico sono presentati. Principi di microfluidica e un sistema di micromeccanica sono combinati in cryoWriter per rendere questo possibile.

La nostra esperienza dimostra che quando vengono utilizzati i metodi miniaturizzati presentati in questo manoscritto, lo spazio di parametro per la preparazione di EM-griglia è maggiore per i metodi classici e sotto stretto controllo di utente. D'importanza, la maggiore riproducibilità raggiunta permette di pre-schermo con sistema tampone del campione, completata con una proteina di test prontamente disponibile, per determinare i parametri ottimali, prima di eseguita l'esperimento vero e proprio. Questo mantiene il consumo del campione di interesse all'assoluto minimo ed è altamente raccomandato. Fasi critiche per entrambi preparazione griglia NS - e cryo-EM sono: (i) Priming del sistema pompa; per l'erogazione del volume sub-nanolitro, il liquido (acqua) deve essere degassato e bolla libero. (ii) preciso controllo dell'effluvio o al plasma pulizia passo; le caratteristiche della superficie della griglia EM sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili. (iii) condizionata campione; il tempo richiesto per il condizionamento, per esempio, con NS, dipende dal tipo di buffer, il contenuto di sale e la concentrazione (Figura 3), nonché la geometria dell'ugello del microcapillary²⁴. (iv) tassi di evaporazione per le preparazioni di NS-EM EM quantitativa; l'effetto di anello di caffè può vietare l'analisi quantitativa delle preparazioni di NS-EM e dovrà essere soppresse dai tassi lenta evaporazione controllati dalla DP-fase.

Diversi aspetti dei metodi di preparazione griglia presentati possono essere combinati liberamente permettendo lo sviluppo di protocolli versatile per gli esempi specifici. Esempi tipici sono la rimozione di una sostanza che impedisce EM ad alta risoluzione, ad esempio, glicerolo, da una fase di condizionamento prima della preparazione di griglia per cryo-EM; l'introduzione di molecole di mediatore, come ligandi, di condizionamento prima le griglie sono preparate; o l'esame della singola cella lysata di NS - o cryo-EM (Figura 6).

L'uso della microfluidica e quantità minime nei metodi presentati rimuove completamente la necessità di passaggi carta-blotting. Questo è un grande vantaggio, perché carta assorbente è un duro trattamento per proteine, potenzialmente contaminare il campione con ioni indesiderati e intrinsecamente portando alla perdita massiccia di campione. D'altra parte, gli effetti potenzialmente causati dall'interfaccia aria-acqua del film campione sottile formato quando cryo-EM i campioni sono preparati nel modo classico non sono evitati quando viene utilizzato il cryoWriter. Griglie per cryo-EM possono essere preparate con un tempo di attesa inferiore a 0,2 s tra l'applicazione di esempio e vetrificazione (dati non mostrati). Tuttavia, come proteine viaggiano a pochi decimi di un nanometro in pochi nanosecondi in diffusione, c'è ancora abbastanza tempo per loro entrare in collisione con l'interfaccia acqua-aria di un film di spessore campione nm 100 diverse volte. Tuttavia, la quantità di proteine che attacca all'interfaccia aria-acqua potrebbe essere significativamente ridotta di queste lacune di breve periodo di tempo e potrebbe prevenire la denaturazione proteica o limitato orientamento delle particelle. Un altro approccio promettente che potrebbe proteggere le proteine sensibili dall'interfaccia aria-acqua è di coprire il film campione di sostanze tensioattive di basso peso molecolare. Questi composti potrebbero essere rapidamente introdotti da una fase di condizionamento in cryoWriter prima della preparazione di griglia. L'elevato rapporto superficie-volume sistemi microfluidici è un'ulteriore limitazione del cryoWriter, come campione può potenzialmente essere perso di adsorbimento non specifico alla superficie microcapillary e disturbare l'analisi quantitativa di conteggio delle particelle. Il problema è risolto in due modi: in primo luogo, il campione non percorrere lunghe distanze all'interno del microcapillary. Infatti, il volume del campione nanolitro rimane all'estremità capillare in tutta l'elaborazione. In secondo luogo, la superficie in rapporto al volume è ulteriormente ridotto utilizzando microcapillari con diametri interni relativamente grandi, per esempio, 180 µm. in terzo luogo, le superfici dei microcapillari possono essere passivate facilmente, se necessario, ad esempio, trattandole con glicoli di etanolo polilisina commercialmente disponibile (PLL-PEG).

L'analisi ad alta risoluzione delle proteine mediante l'approccio di singola particella utilizzato in EM richiede solo 100.000 a qualche milione di immagini di particelle singole proteine. Ciò significa che la microfluidica tecniche possono fornire abbastanza complessi della proteina per l'indagine strutturale. Precedenti²⁸è stato sviluppato un metodo di immuno-precipitazione miniaturizzati per il rapido isolamento dei complessi della proteina (circa 1 ora) dalla quantità di cellule minimal (circa 40.000 cellule). Questo metodo verrà ora essere collegato direttamente alla fase di preparazione del campione miniaturizzati della cryoWriter. L'obiettivo finale è quello di sviluppare una pipeline integrata microfluidici per preparazione griglia isolamento e cryo-EM proteina ultra-veloce che richiede meno di due ore in tutto. Inoltre, come dimostrato dalla Figura 6, la piccola quantita ' e il volume di materiale necessario per la preparazione del campione e la condizionata quasi senza perdita di dati e la procedura di preparazione griglia ottenuta utilizzando il cryoWriter, rendono possibile studiare la proteina complessi di singole celle. Insieme, il metodo miniaturizzati immuno-precipitazione e la cryoWriter porre le fondamenta di un nuovo metodo di proteomica chiamato "singola cella visual proteomics", come abbiamo recentemente dimostrato per shock termico esperimenti²⁴. Algoritmi di analisi di dati orientati all'analisi delle immagini "visual proteomics" sono attualmente in fase di test.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manipolazione dei liquidi
Punta microcapillare	Nuovo obiettivo	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 &; m ID punta, 100 & micro; m ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 µ m ID punta, 150 & micro; m ID , pk. 20
Manicotto conduttivo	Nuovo obiettivo	CONGAS-1	Elastomero conduttivo per contatto HV, 12" di lunghezza
Tubo in silice fusa	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Tubo FS standard, 150 & micro; m ID, 363 &; m OD, 5 metri
Connettore PressFit	BGB-Analytik	2525LD	Deact. Connettore PressFit da 0,25 a 0,25 mm ID, pk. 25
Siringa 10 & micro; l	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT - Luer Tip (ago non incluso)
Controllore per pompe a siringa	Cetoni	A3921000093	Controllore neMESYS
Unità di dosaggio per pompa a siringa	Cetoni	A3921000095	Dosatore neMESYS
Controllo della temperaturaSensore del punto di
rugiada	Meltec	UFT75-AT	Sensore di umidità/temperatura, calcolo del punto di rugiada, USB e DLL integrata
Temperatura sensore	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Sensore di temperatura montabile in superficie Pt1000
Controllore Peltier	Cooltronic	TC2812	Regolatore di temperatura PID per l'attivazione di sistemi azionati da Peltier con uscita a tensione costante
Elemento Peltier	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40x40 mm
Blocco di raffreddamento ad acqua			- Blocco di raffreddamento ad acqua per elemento Peltier 40x40 mm, base in rame
Pompa dell'acqua	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Blocco scambiatore di calore ad acqua	-		Blocco scambiatore di calore ad acqua con 2 ventole per raffreddare l'acqua circolante
Refrigeratori d'acqua piccoli	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram copper edition 2 pz
Piccoli elementi Peltier	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 mm 3,4 A 8,1 W 3,8 V 74 ° C, 2 pz
Meccanica
Stadio lineare asse z	Dyneos AG	M-404.2PD	Stadio traslazionale di precisione ad alto carico, corsa di 50 mm, motore DC
Stage controller	Dyneos AG	C-863	Mercury Servo Controller
Microscopio stadio asse xy	Prior Scientific	H117EIL5	Stadio motorizzato per Zeiss Axiovert 200 Microscopio invertito
Magneti permanenti piccoli	Supermagnete	S-05-08-N	Cilindro magnetico Ø 5 mm, altezza 8,47 mm, neodimio, N45, nichelato, pk. 10
Elettromagnete piccolo	Schramme	EG1025A02/110	Elettromagnete 24V 220 N 150 N 2,5 W
Elettromagnete di controllo	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Scheda PCB di controllo elettromagnete
Mozzo	solenoideDistrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini pinzette	Microscopia elettronica	Scienze 0302-M5S-PS	Dumont Tipo 5 mini, punte super sottili
Varie parti optomeccaniche	Thorlabs	-
-Varie parti meccaniche	Officina Biozentrum, Università di Basilea-Piastre		adattatrici progettate su misura, supporti, ecc. vedi file CAD allegati
Optics
Laser diodo	Thorlabs	CPS780S	780 nm modulo diodo laser 2,5 mW
Rivelatore fotografico	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM		emsdiasum.comDTF-03523	30 nm DuraSiN™ membrane in nitruro di silicio per TEM, confezione da 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537  SIGMA	Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Colorazione negativa a base di vanadio
NanoW 2%	nanoprobes.com		Colorazione negativa a base di tungsteno
Software
openBEB			Il framework openBEB 2 è disponibile su richiesta, la versione 3 sarà scaricabile
software (plug-in openBEB)		Disponibile su richiesta, potrebbero essere applicati costi aggiuntivi per il software del driver di terze parti.