CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Summary

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

Abstract

Malformazione del cervello è spesso causato da mutazioni genetiche. Decifrare le mutazioni in tessuti derivati dal paziente ha identificato potenziali fattori causali delle malattie. Per convalidare il contributo di una disfunzione dei geni mutati per lo sviluppo della malattia, la generazione di modelli animali che trasportano le mutazioni è un approccio più ovvio. Mentre germline geneticamente modelli murini (GEMM) sono popolari strumenti biologici e mostrano risultati riproducibili, è limitato dal tempo e costi. Nel frattempo, non di germline GEMM consentono spesso esplorare funzione del gene in un modo più fattibile. Poiché alcuni cervello malattie (ad es., tumori cerebrali) sembrano derivare da somatico ma non le mutazioni di germline, modelli di topi chimerici non germinale, in cui convivono le cellule normali e anormali, potrebbero essere utile per analisi rilevanti per la malattia. In questo studio, segnaliamo un metodo per l'induzione di mutazioni somatiche CRISPR-mediata nel cervelletto. In particolare, abbiamo utilizzato il condizionali topi knock-in, in cui Cas9 e GFP sono cronicamente attivati dal promotore CAG (CMV enhancer/pollo ß-actina) dopo Cre-mediata ricombinazione del genoma. La singolo-guida auto-progettata RNAs (sgRNAs) e la sequenza di Cre ricombinasi, sia codificato in un plasmide singolo costrutto, sono stati consegnati in cellule staminali/progenitrici cerebellari in una fase embrionale usando l'elettroporazione nell'utero . Di conseguenza, cellule trasfettate e loro cellule della figlia sono stati etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP), facilitando così ulteriori analisi fenotipiche. Quindi, questo metodo è non solo risultati basati su elettroporazione genico in cellule embrionali cerebellare ma anche proponendo un nuovo approccio quantitativo per valutare CRISPR-mediata di fenotipi di perdita-de-funzione.

Introduction

Malattie del cervello sono una delle più terribili malattie mortali. Risultano spesso dalle mutazioni genetiche e disregolazione successive. Per comprendere i meccanismi molecolari delle malattie del cervello, perenne sforzi per decifrare il genoma dei pazienti umani hanno scoperto una serie di geni causativi potenziali. Finora, sono stati utilizzati modelli animali geneticamente costruiti di germline per in vivo guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (LOF) analisi di tali geni candidati. Dovuto lo sviluppo accelerato di studi di validazione funzionale, è auspicabile un più fattibile e flessibile in vivo gene sistema di analisi per lo studi....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo norme sul benessere degli animali e sono stati approvati dalle autorità competenti (Regierungspräsidium Karlsruhe, i numeri di omologazione: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 e 14/G133).

1. generare plasmidi pU6-sgRNA-Cbh-Cre

1. Progettare il sgRNA per indirizzare un gene di interesse secondo il protocollo precedentemente pubblicati¹⁴.
   Nota: In questo esperimento, due sgRNAs sono progettati per indirizzare il gene Top2b del mouse e un controllo non mirati sgRNA (tabella 1). Di geni knockout utilizzando la tecnologia CRIS....

Results

Per l'analisi funzionale in vivo , è fondamentale per identificare le celle in cui sono stati introdotti geni esogeni. Mentre l'espressione di un marcatore, come GFP in cellule non proliferanti possono essere continuati per un lungo periodo di tempo, il segnale si perde in sequenza nelle cellule proliferanti. Un'illustrazione di questo effetto è dimostrata nella Figura 1. Per ovviare a perdere l'impronta delle cellule transfected nelle analisi di LOF.......

Discussion

Usando l'elettroporazione exo utero , precedentemente abbiamo segnalato basati su siRNA in vivo analisi funzionali di Atoh1 in una fase iniziale di granuli cerebellari cellulari differenziazione⁸. A causa di siRNA diluizione/degradazione e l'esposizione di embrioni di fuori della parete uterina, l'analisi fenotipica delle cellule del granello individulamente era limitata a fasi embrionali. Tuttavia, il metodo corrente attivata analisi del fenotipo di animali postnatali.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 488 Capra anti-Pollo	ThermoFisher	A11039	Diluizione 1:400
Alexa 568 Asino anti-Topo	Life Technologies	A-10037	Diluizione 1:400
Alexa 594 Asino anti-Coniglio	ThermoFisher	A21207	Diluizione 1:400
Alexa 647 Asino anti-Coniglio	Life Technologies	A31573	Diluizione 1:400
Alcalino Fosfatasi (FastAP)	ThermoFisher	EF0654
Banda per autoclave	Kisker Biotech	150262
BamHI (HF)	NEB	R3136S
BbsI (FastDigest)	ThermoFisher	FD1014
Carta da filtro in cellulosa (Whatman)	Sigma-Aldrich	WHA10347525
Cloth	Tork	530378
Microscopio confocale a scansione laser	Zeiss	LSM800
D-Luciferin	biovision	7903-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Diluizione 1:1000
Stampi in plastica monouso (Tissue-Tek Cyromold)	VWR	4566
DMEM Glutamax		ThermoFisher 31966047
Siero	d'asinoSigma-Aldrich	D9663
EcoRI (HF)	NEB	R3101S
Electro Square Porator	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	12362
Etanolo	Merck	107017
Unguento per gli occhi (Bepanthen)	Bayer	81552983
Fast Green	Merck	104022
Filtro FBS	ThermoFisher	10270-016
(0,22 &; micro; m)	Merck	F8148
Imager cellulare fluorescente (ZOE)	Biorad	1450031
Pinze dritto	Fine Science Tools	91150-20
Garza (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
Anticorpo GFP	Abcam	ab13970	diluizione 1:1000
Gibson Assembly Master	Mix NEB	E2611S
Capillare in vetro con filamento	Narishige	GD1-2
Pad riscaldante	ThermoLux	463265 / -67
Software di elaborazione delle immagini (ImageJ e Fiji)	Siringa NIH-Insulina
(B. Braun OMNICAN U-100)	Carl Roth	AKP0.1
Isoflurano	Zoetis	TU061219
IVIS Lumina LT Serie III Calibro	Perkin Elmer	CLS136331
Kalt Aghi da sutura	Strumenti per la scienza fine	12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix	Kapa Biosystems	KK2601
Ki67 anticorpo	Abcam	ab15580	Diluizione 1:500
Light Pointer	Photonic	PL3000
Penna bloccante liquidi	Kisker Biotech	MKP-1
Metamizol		WDT-Microgrinder
	Narishige	EG-45
Microiniettore	Narishige	IM300
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument Co.	Software per microscopio P-97
ZEN	Zeiss-Filo
di sutura in seta non sterile (0,12 mm)	Fine Science Tools	18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek)	VWR	4583
p27 anticorpo	BD bioscience	610241	diluizione 1:200
Paraformaldeide	Roth	335,3
PBS ( 1x)	Life Technologies	14190169
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
Polietilenimmina	Sigma-Aldrich	408727
pX330 plasmide	Addgene	42230
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
QIAquick Kit di estrazione del gel	Qiagen	28704
Kit di legatura rapida	NEB	M2200S
Pinza ad anello	Strumenti per scienze fini	11103-09
Vetrini (SuperFrost)	Software	ThermoFisher 10417002
per biostatistica (Prism 7)	Software GraphPad,	Inc-Spitacid
	EcoLab	3003840
Stereomicroscopio	Nikon	C-PS
Sucrosio	Sigma-Aldrich	S5016
Forbici chirurgiche	Fine Science Tools	91460-11
Forbici chirurgiche con punta smussata	Fine Science Tools	14072-10
Sutura (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))	SMI	220340
T4 DNA Ligation Buffer	NEB	B0202S
T4 PNK	NEB	M0201S
Forbici per tessuti Smussato (11,5 cm)	Fine Science Tools	14072-10
TOP2B anticorpo	Santa Cruz	sc13059	Diluizione 1:200
Tripsina (2,5 %)	ThermoFisher	15090046
Pinzette con elettrodi a disco da 5 mm e Oslash Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Vaporizzatore	Drä gerwerk AG	GS186