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Articolo metodologico

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

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DOI:

10.3791/57314

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3 febbraio 2018

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1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Un protocollo è presentato per preparare polivinil alcool-co-itaconico acido idrogel con rigidità variabile, che sono stati innestati con e senza oligopeptidi, per studiare l'effetto della rigidità dei biomateriali sulla differenziazione e proliferazione delle cellule staminali. La rigidità nel caso degli idrogeli fu controllata dal tempo di reticolazione.

Abstract

L'effetto di segnali fisici, ad esempio la rigidità dei biomateriali sulla proliferazione e differenziazione delle cellule staminali, è stato studiato da diversi ricercatori. Tuttavia, la maggior parte di questi investigatori hanno utilizzato idrogel di poliacrilamide per coltura della cellula formativa nei loro studi. Pertanto, i loro risultati sono discutibili perché tali risultati potrebbero provenire dalle caratteristiche specifiche del poliacrilammide e non dallo spunto fisico (rigidità) dei biomateriali. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di idrogeli, che non si basano su poliacrilammide, dove vari staminali, cellule compreso le cellule staminali embrionali umane (ES) e umane pluripotenti indotte (iPS) staminali, può essere coltivato. Idrogel con rigidità variabile sono stati preparati da bioinerte polivinil alcool-co-itaconico acido (P-IA), con rigidità controllata dal grado di reticolazione cambiando tempo di reticolazione. Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con e senza oligopeptidi derivato dalla matrice extracellulare sono stati studiati come una futura piattaforma per la coltura delle cellule staminali e differenziazione. La cultura e il passaggio di cellule staminali del liquido amniotico, cellule staminali adiposo-derivate, cellule ES umane e cellule umane iPS è descritto in dettaglio qui. Nel caso degli idrogeli oligopeptide P-IA ha mostrato prestazioni superiori, che sono state indotte dalle loro proprietà di rigidità. Questo protocollo riporta la sintesi del biomateriale, loro manipolazione superficiale, insieme a controllare le proprietà di rigidezza e infine, il loro impatto sul destino delle cellule staminali utilizzando condizioni di coltura privo di xeno. Basato su studi recenti, tali substrati modificate possono fungere da piattaforme future per sostenere e dirigere il destino di varie cellule staminali linea per diversi collegamenti; e inoltre, rigenerare e ripristinare le funzioni dell'organo perso o tessuto.

Introduzione

Il destino del differenziamento di cellule staminali in un lignaggio specifico delle cellule e la proliferazione delle cellule staminali, soprattutto umane pluripotenti indotte (iPS) e cellule staminali embrionali umane (ES), a lungo termine è noto per essere regolata da inibitori, fattori di crescita, e / o piccole molecole bioattive in terreni di coltura. Recentemente, i segnali fisici dei biomateriali, in particolare la rigidità dei biomateriali di coltura delle cellule, sono stati riconosciuti per essere un fattore importante che guida il destino delle cellule staminali proliferazione e differenziazione1,2, 3,4,5,6. Di conseguenza, diversi ricercatori hanno iniziato a investigare sul destino delle cellule staminali, che sono coltivati su idrogeli, sulla differenziazione, principalmente utilizzando idrogel di poliacrilamide con rigidità diverse.

La rigidità dei biomateriali possa controllare adesioni focali, morfologia delle cellule, fenotipo delle cellule e adesione delle cellule staminali, soprattutto in bidimensionale (2D) coltivazione1,2,3,5. Meccano-rilevamento di biomateriali di cellule staminali è generalmente controllata di segnalazione tramite recettori integrinici focale di adesione. NMMIIA, miosina non muscolare contrattilità IIA-dipendente del citoscheletro di actina svolge un ruolo critico nel processo di mechanosensing delle cellule staminali in 2-D cell coltivazione sistemi3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler e i suoi colleghi ha sviluppato un concetto interessante che cellule staminali adulte, quali midollo osseo le cellule staminali (BMS) coltivate sui biomateriali di cultura delle cellule con una rigidità simile a quella di tessuti specifici, tendono a differenziarsi in cellule ha provenute da tessuti specifici5. BMS cellule incubate su idrogel di poliacrilamide morbido 2-D rivestito con collagene di tipo I (con una rigidità paragonabile a quella dei tessuti cerebrali) nei media espansione fossi spontaneamente indotte a differenziarsi in linee cellulari di neurone iniziale, considerando che BMS cellule coltivate su idrogel con una rigidità simile a quella del muscolo o tessuti collagena dell'osso sono stati trovati per indurre la differenziazione in primi lignaggi di miociti e osteoblasti, rispettivamente, il 2-D poliacrilammide idrogeli3,5. Molti ricercatori hanno studiato il destino delle cellule staminali di differenziazione coltivate su poliacrilammide idrogeli immobilizzati con collagene tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Tuttavia, va ricordato che alcune contraddittorie segnala1,18,22,23,24 esiste per il ben noto idea suggerita da Engler et al. 5 questo è perché idea5 di Engler è stato sviluppato esclusivamente su idrogel di poliacrilamide e i loro risultati hanno avuto origine da caratteristiche specifiche di biomateriale (poliacrilammide) e non solamente dalla stecca fisica (rigidità) di il biomateriale. Pertanto, è importante sviluppare un altro tipo di idrogel, di cui la rigidità può essere controllata da reticolazione nel caso degli idrogeli. Per questo scopo, bioinerte idrogeli sono stati sviluppati, che sono stati preparati da polivinil alcool-co-itaconico acido (P-IA) con una diversa rigidezza, che era controllata dal grado di reticolazione con un cambiamento reticolazione tempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. le cellule staminali possono essere coltivate su nonmodified P-IA idrogeli, come pure P-IA idrogeli innestati con matrici extracellulari (ECMs) e oligopeptidi. In un precedente studio25, cellule staminali ematopoietiche umane (hHSCs) da sangue del cordone ombelicale sono state coltivate su P-IA idrogel con valori di rigidità differenti che vanno da un 3 kPa a 30 kPa modulo elastico dove fibronectina o un oligopeptide derivato da fibronectina (CS1, EILDVPST) è stata innestata nel caso degli idrogeli P-IA. Alta ex vivo piega espansione di hHSCs è stata osservata nel caso degli idrogeli P-IA innestato con CS1 o fibronectina, che visualizzata una rigidità intermedia che vanno da 12 kPa a 30 kPa25.

IPS umano e cellule ES non possono essere coltivate coltura convenzionale polistirolo (TCP) piatti33,34 ES umano e cellule iPS richiedono legame specifico con ECMs, come vitronectina o laminina per mantenere la loro pluripotenza durante la coltura a lungo termine. Di conseguenza, diverse strutture di idrogeli di P-IA oligopeptide-innestati con caratteristiche di rigidità ottimale sono stati progettati e preparati nelle formazioni di una singola catena, una catena singola con un segmento comune, una doppia catena con un segmento comune e un tipo di ramificata catena32. Oligopeptide sequenze sono stati selezionati da domini di integrina e glicosaminoglicani-associazione di ECMs. Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con oligopeptidi vitronectin-derivati con una doppia catena o un segmento comune, che hanno un modulo di deposito a circa 25 kPa, supportata la coltura a lungo termine di ES umano e cellule iPS per oltre 12 passaggi sotto privo di xeno e chimica condizioni definite32. Il segmento comune e doppia catena con molecole di adesione cellulare nel caso degli idrogeli facilitato la proliferazione e pluripotenza delle umane ES e iPS celle32. Qui, un protocollo per la preparazione di idrogeli di P-IA (con un modulo di deposito da 10 kPa a 30 kPa, che è stata misurata in condizioni di umide nell'aria) innestato con e senza oligopeptidi o ECMs è descritto. Viene mostrato come cultura e passaggio parecchie cellule staminali (tra cui le cellule staminali del liquido amniotico, cellule staminali adiposo-derivate, cellule ES umane e cellule umane iPS).

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Protocollo

Gli esperimenti in questo studio sono stati approvati dai comitati di etica dell'ospedale di Landseed (05-13-IRB) di Taiwan e National Central University. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con tutte le linee guida istituzionali e governative pertinenti ed applicabili e regolamenti durante questo studio.

1. soluzione e preparazione di terreni

  1. Purificazione di polimero
    1. Purificare il P-IA con gruppo dell'acido carbossilico con un grado di idrolisi di > 96,5% di P-IA di lavaggio con etanolo. Mettere 20 g di P-IA in 200 mL di etanolo in un becher da 500 mL conico e agitare su un agitatore magnetico per 24-30 h. cambio l'etanolo con etanolo ogni 8-10 h.
    2. Rimuovere P-IA da etanolo mediante filtrazione utilizzando un filtro Büchner.
    3. P-IA asciutto di essiccazione sotto vuoto a temperatura ambiente per 24 h.
      Nota: Si raccomanda di pulire la trappola del sistema di essiccazione a vuoto (tramite la rimozione di etanolo) frequentemente, soprattutto durante le prime poche ore, perché la trappola tende ad occludersi dopo la rimozione di una grande quantità di etanolo da P-Ia.
  2. Preparazione della soluzione P-IA
    Nota: Aggiungere il polimero molto lentamente in solvente (acqua). Si consiglia di prendere almeno 15 min per aggiungere il P-IA in solvente. Se il solvente è aggiunto nel polimero, il polimero non sarebbe dissolto completamente. Fare attenzione a non generare esplosiva di ebollizione della soluzione P-IA. Uso di occhiali protettivi durante la preparazione della soluzione P-IA. Il processo di riscaldamento della soluzione P-IA è essenziale per sciogliere il cristallino P-Ia. È suggerito (e preferibile) per preparare la soluzione di P-IA in una camera sperimentale relativamente pulita, se possibile.
    1. Sciogliere il P-IA in acqua pura a una concentrazione di peso 0.050% per l'esperimento di coltivazione delle cellule o una concentrazione di peso 0.50% per la misurazione del reometro: ad esempio, sciogliere 50 mg di P-IA in 100 mL di acqua pura per la coltura cellulare e 500 mg di P-IA in 100 mL di de acqua ionizzata (DI) per le misurazioni di reometro.
    2. Agitare la soluzione di P-IA per 1h sulla piastra calda.
      Nota: Per evitare l'ebollizione esplosiva, non riscaldare la soluzione oltre a 95 ° C. Ebollizione esplosiva della soluzione polimerica ad alta temperatura può generare ustioni della pelle. Pertanto, eseguire il riscaldamento del P-IA molto con attenzione e monitorare la temperatura della soluzione P-IA durante il riscaldamento.
    3. Dopo la soluzione di P-IA è stata raffreddata a temperatura ambiente, agitare la soluzione di P-IA a temperatura ambiente per 48 h. soluzione di P-IA calda lascia sulla piastra calda senza riscaldamento e poi lasciarlo senza agitazione a temperatura ambiente per 20-24 h garantire che siano bolle d'aria non presenti nella soluzione P-IA.
  3. Preparazione della soluzione di reticolazione
    1. Effettuare la composizione della % di glutaraldeide reticolazione soluzione 1.0 peso da soluzione di glutaraldeide acquosa 25%, 20,0% Na2di peso così4 utilizzo 99% > purezza e 1.0 peso % H2così4. Ad esempio, per un 6 o 12 Beh piastra di coltura cellulare, aggiungere 100 µ l di soluzione di glutaraldeide, 2 g di solfato di sodio e 100 µ l di acido solforico in 10 mL di acqua pura.
  4. Terreni di coltura umana delle cellule ES/PS
    Nota: Uso DMEM/F12 media, media 6 essenziale ed essenziale 8 media per la coltura delle cellule.
    1. Ritorno congelato 50 X essenziale 8 supplemento lentamente alla soluzione durante la notte da scongelare in frigorifero a 4 ° C.
    2. Aggiungere una bottiglia di 50 supplemento x8 essenziali in una bottiglia di media basale 8 essenziali. Separare il media in piccole aliquote (50 mL CAD.) in tubi di centrifugazione 100ml, quindi conservare i supporti a-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel piatto preparazione

  1. Preparazione dei film P-IA
    1. Iniettare un'aliquota di 1 mL della soluzione P-IA in un piatto TCP di 35 mm ed asciugare il piatto in forno a 45 ° C per 2 giorni per produrre un film P-IA in un banco di lavoro pulito.
  2. Reticolazione dei piatti idrogel P-IA
    1. Immergere i film P-IA in una soluzione acquosa di reticolazione per 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 e 48 h.
      Nota: ' P-IA -X' (per esempio, P-IA-12 h) si riferisce a un reticolato di idrogel P-IA per X h (ad es., 12 h).
    2. Dopo reticolazione, sciacquare l'idrogel di P-IA con acqua pura a temperatura ambiente e quindi mantenere idrogeli in acqua pura a temperatura ambiente in un banco di lavoro pulito.
    3. Sterilizzare i P-IA idrogeli mediante immersione in una soluzione di etanolo 75.0 volume/volume% per 1 min, sciacquare l'idrogel di P-IA in acqua pura sei volte e quindi mantenere l'idrogel di P-IA in acqua pura fino a quando non utilizzati per colture cellulari.
  3. Preparazione di piatti di idrogel P-IA innestato con oligopeptide o ECM
    1. Attivare l'idrogel di P-IA tramite immersione in 1 mL di soluzione acquosa contenente 10 mg/mL N.-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide cloridrato (EDC) e 10 mg/mL N- Idrossisuccinimide (NHS) per 1 h a 37 ° C o a 4 h a 4 ° C.
    2. Sciacquare l'idrogel di P-IA con 1 mL di fosfato tampone salino (PBS, pH 7,2) 3 volte e immergere l'idrogel di P-IA in una soluzione di PBS contenente 1 mL di oligopeptide (100-1.500 µ g/mL) o ECM (10-100 µ g/mL) per 24 h a 4 ° C.
      Nota: Le sequenze di oligopeptide ed ECMs usato per coltura della cellula formativa sono riassunti nella tabella 1.
    3. Dopo l'innesto l'oligopeptide o ECM, lavare l'idrogel di P-IA con acqua pura 3 volte.
      Nota: Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con Y µ g/mL di oligopeptide o ECM (Z) è appresso P-IA -Xh -Z oP-IA-Xcon la h -Z-Y, dove X indica il tempo di reticolazione (h), Y indica la concentrazione del oligopeptide o ECM, e Z indica un oligopeptide differenti o ECM.

3. coltura cellulare umano ES/iPS

  1. Metodo di passaggio e di manutenzione dell'indifferenziato ES umano e cellule iPS
    1. Mantenere umano ES (ad es., WA09 o H9) cellule o umano iPS (ad esempio, HS0077) cellule su Matrigel in media 8 essenziali in piatti 6 cm utilizzando standard umano ES/iPS delle cellule di cultura protocolli28,32.
    2. Incubare le cellule umane di vicino-confluenti ES/iPS con dispase 2,0 mg/mL II in DMEM/F-12 media a 37 ° C per 8-10 minuti e poi risciacquare cellule umane ES/iPS due volte con DMEM/F12 media.
    3. Dopo l'aggiunta di 2 mL di DMEM/F-12 media per piastre di coltura delle cellule ES/iPS umani, scollegare debolmente colonie aderenti con un raschietto di cella o di pipettaggio.
    4. Raccogliere le cellule umane ES/iPS in provette da centrifuga 15 mL e centrifugare le cellule umane ES/iPS a 160 × g per 5 min a 37 ° C.
    5. Dopo la centrifugazione, scartare il DMEM/F12 e sospendere le cellule umane ES/iPS in 1 mL di E8 media e poi contare la densità delle cellule utilizzando un contatore di cellule.
    6. Inoculare le cellule ES/iPS dopo la regolazione adeguata densità (1-5 x 104 cellule per cm2 per passaggio o come indicato) in piastre di coltura nuovo (P-IA idrogeli innestati con l'oligopeptide o ECM).

4. caratterizzazione della caratterizzazione delle cellule umane ES/iPS

  1. Valutazione dell'attività della fosfatasi alcalina (AP)
    1. Misurare l'attività della fosfatasi alcalina (AP) di cellule umane ES/iPS utilizzando una colorazione diretta di fosfatasi alcalina standard.
  2. Immunostaining
    1. Eseguire immunostaining del Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 e Oct3/4 sulle cellule hES e fianchi per indagare la pluripotenza seguendo il protocollo convenzionale28,32.
    2. Aggiungere un volume di 0,5 mL di paraformaldeide al 4% (volume/volume) in ogni piatto ben 24 in cui sono state coltivate le cellule umane ES/iPS e successivamente, incubare i piatti per 15 min a 4 ° C per fissare le cellule.
    3. Aspirare la soluzione di paraformaldeide da ciascun pozzetto. Aggiungere 1 mL di PBS per bene, quindi aspirare PBS per sciacquare le cellule. Eseguire il processo di risciacquo 3 volte.
    4. Permeabilize le membrane cellulari aggiungendo 0,5 mL dello 0,3% (volume/volume) soluzione di Triton-X100 in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
    5. Aspirare la soluzione di Triton-X100, aggiungere 300 µ l di 2% (peso/volume) albumina di siero bovino (BSA) in PBS (tampone di arresto) in ogni pozzetto e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    6. Rimuovere il tampone bloccante pipettando e successivamente, aggiungere gli anticorpi primari desiderati (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) e Tra-1-81(1:200) di pipetta, cfr. tabella 2) in ciascun pozzetto, dove 1: 200 indica gli anticorpi sono stati diluiti con PBS 200 volte e incubate per un giorno a 4 ° C.
    7. Aspirare la soluzione di anticorpo primario e lavare le cellule con 300 µ l di 0.05% Tween 20 in soluzione PBS 3 volte a temperatura ambiente.
    8. Aggiungere 300 µ l di anticorpi secondari (1: 200, cfr. tabella 2), che sono specifici per il sottotipo di IgG primario, in soluzione al 2% (peso/volume) BSA in ogni bene e incubare per 1 h a temperatura ambiente al buio.
    9. Lavare le cellule con 300 µ l di 0.05% Tween 20 in soluzione PBS 3 volte a temperatura ambiente al buio.
    10. Analizzare le cellule marcate da microscopia di fluorescenza o microscopia confocale.
  3. Formazione embryoid body
    1. Indagare la pluripotenza delle cellule umane ES/iPS da formazione embryoid body (EB) a passaggi 10 e 20.
      Nota: Vicino a 80% confluenza in piastre da 6 pozzetti è sufficiente per la preparazione della formazione di EB.
    2. Sciacquare ES umana o cellule iPS con 2 mL di terreno DMEM/F-12 due volte e poi immergere le cellule in 1,5 mL di Essential 6 media.
    3. Tagliate a circa 32 pezzi utilizzando 200 µ l consigli vicino a 80% confluenti umane cellule ES o iPS. Successivamente, scollegare le cellule dai piatti utilizzando un raschietto di cella.
    4. Raccogliere le cellule umane ES/iPS e trasferimento in un piatto di allegato 6 pozzetti ultrabasso.
    5. Supporti cambio Essential 6 pipettaggio vecchi media e aggiungendo media freschi ogni 2 giorni.
      Nota: Coltura le cellule in sospensione per 2 settimane a 37 ° C con 5% CO2.
    6. Dopo l'EBs omogeneamente sono stati sospesi nei media Essential 6, trasferire EBs alla cultura su piatti TCP 24 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina peso e cultura le cellule nei media di 6 essenziale per una settimana supplementare.
    7. Macchia le celle con gli anticorpi contro i marcatori delle cellule derivate da tre strati germinali embrionali [AFP (endoderma), GFA (ectoderma), β III-tubulina (ectoderma) e SMA (mesoderma)] e valutare le cellule con il metodo di immunostaining descritto sopra.
  4. Formazione di teratoma
    1. Indagare la pluripotenza delle cellule umane ES/iPS da formazione di teratoma a passaggi 10 e 20.
      Nota: 5 piatti della confluenza di 80% in piastre da 6 pozzetti sono sufficienti per la formazione di teratoma (almeno 3 x 106 cellule sono necessarie per gli esperimenti di formazione di teratoma).
    2. Sciacquare le cellule con 2 mL DMEM/F-12 media due volte e quindi aggiungere 1,5 mL DMEM/F-12 supporti per le piastre di coltura delle cellule.
    3. Tagliate quasi 80% confluenti ES o iPS cellule umane a circa 32 pezzi utilizzando 200 µ l consigli. Successivamente, scollegare le cellule dai piatti utilizzando un raschietto di cella.
    4. Raccogliere le cellule umane ES/iPS in una provetta da centrifuga 15 mL e centrifugare le cellule a 160 × g per 5 min a 37 ° C.
    5. Dopo la centrifugazione, sospendere il pellet cellulare in 100 µ l DMEM/F12 e poi mix la cella pellet con 100 µ l Matrigel (rapporto 1:1 in volume).
    6. Trasferire la sospensione cellulare in una siringa pre-raffreddata a-20 ° C. Iniettare, in totale, almeno 3 × 106 cellule per via sottocutanea nel maschio NOD-SCID (cenno del capo. CB17 -Prkdascid/JNarl) topi (5-8 settimane).
    7. Dopo 5-8 settimane, sezionare i teratomas, difficoltà con soluzione di paraformaldeide 4,0% (peso/volume) e quindi conservare a 4 ° C.
    8. Difficoltà il teratoma con paraffina, affettare i teratomas paraffina e macchia con ematossilina ed eosina (H & E) utilizzando un protocollo standard28,32.
      Nota: I ricercatori possono inviare tessuto fisso teratoma all'azienda di difficoltà i teratomas con paraffina, teratomi fetta della paraffina e macchia il campione con H & E, che viene in genere utilizzato nel reparto di patologia negli ospedali.
  5. Coltura delle cellule staminali adiposo-derivate umane (annunci)
    1. Terreni di coltura caldo (DMEM contenente 1% antimicotico Antibiotico e 10% siero bovino fetale (FBS)), 0,25% di tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C in un prima vasca acqua di usarla.
    2. Lavare le cellule umane annunci di pipettaggio 10 mL di PBS in ogni piatto-6cm cultura dove le cellule sono coltivate.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) i piatti di cultura di 6 cm e incubare la soluzione a 37 ° C per 5 min.
    4. Osservare le cellule in piastre di coltura di 6 cm sotto microscopia per confermare che le cellule sono staccate.
    5. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere un volume equivalente di terreni di coltura (DMEM contenente antibiotico antimicotico 1% e 10% FBS) nella provetta da centrifuga per neutralizzare la tripsina-EDTA.
    6. Centrifugare le cellule a 250 × g per 5 min a 37 ° C.
    7. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante con attenzione di pipettaggio, senza disturbare il pellet cellulare.
    8. Risospendere le cellule in coltura e quindi seme le cellule alla densità appropriata (5-10 x 103 cellule per cm2 per passaggio o come indicato) in piastre di coltura nuovo (P-IA idrogeli innestati con e senza oligopeptidi ed ECM).
  6. Staminali del liquido amniotico umano coltura cellulare (AFS)
    1. Caldo media coltivazione (DMEM/MCDB 201 (2:3) contenente 20% siero bovino fetale (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% antibiotico antimicotico), 0,25% di tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C in un prima vasca acqua di usarla.
    2. Lavare le cellule umane di AFS di pipettaggio 10 mL di PBS in ogni piatto-6cm cultura dove le cellule sono coltivate.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) in piastre di coltura di 6 cm e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
    4. Osservare le cellule su piastre di coltura di 6 cm sotto microscopia per confermare le cellule sono staccate.
    5. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere un volume uguale di terreni di coltura (DMEM/MCDB 201 (2:3) contenente 20% siero bovino fetale (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% antibiotico antimicotico) nella provetta da centrifuga per neutralizzare la tripsina-EDTA.
    6. Centrifugare le cellule a 250 × g per 5 min a 37 ° C.
    7. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante con attenzione senza disturbare il pellet cellulare pipettando.
    8. Risospendere le cellule in media coltivazione e quindi seme le cellule alla densità appropriata (5-10 x 103 cellule per cm2 per passaggio o come indicato) in piastre di coltura nuovo (P-IA idrogeli innestati con e senza oligopeptide ed ECM).

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Risultati

P-IA idrogeli innestano con ECM-derivato oligopeptide (oligoECM) o ECM con elasticità differenti sono stati preparati seguendo lo schema di reazione, come si vede in Figura 1A, utilizzando diversi tipi di oligoECM (Figura 1B). Le elasticità nel caso degli idrogeli sono state regolate dall'intensità applicata reticolazione (tempo) (Figura 1). P-IA idrogeli innestati con oligopeptidi vitronectin-deriva...

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Discussione

P-IA-oligoECM e P-IA-ECM idrogel con rigidità variabile sono stati sviluppati per l'espansione a lungo termine di ES umano e cellule iPS mantenendo la loro pluripotenza per oltre dieci passaggi in condizioni prive di xeno, così come per la coltura di cellule umane di AFS, cellule di annunci, e le cellule staminali emopoietiche25,28,32. P-IA idrogeli immobilizzati con oligoECM sono un candidato eccellente per materiali di coltiva...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata parzialmente sostenuta dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan sotto grant numeri 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 e 104-2221-E-008-107-MY3. Questa ricerca è stata sostenuta anche dal Taiwan Landseed ospedale progetto (NCU-LSH-105-A-001). Una sovvenzione per la ricerca scientifica (numero 15K 06591) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone è anche riconosciuto. R. Higuchi desidera ringraziare per il programma di partenariato scientifico internazionale (ISPP-0062) Vice Rettorato per gli studi universitari e di ricerca, King Saud University, Riyadh 11451, Regno dell'Arabia Saudita.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
GTPGPQGIAGQRGVVPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: CS1
EILDVPSTPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH GiapponenessunoSpecifica: Oligopeptide
Abbreviazione: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH GiapponenessunoSpecifica: Matrice extracellulare
Abbreviazione: rVN
VitronectinThermo Fisher scientificA14700Specifica: Matrice extracellulare
Abbreviazione: FN
FibronectinaSigma-AldrichF2006Specifica: Materiale di rivestimento disponibile in commercio
Abbreviazione: Synthemax II
Synthemax IICorning3535Specifica: Polimero
Polivinilalcol-acido co-itaconicoGiappone VAM & PovalAF-17Specifica:
GlutaraldeideSigma-AldrichG5882Specifica: Chimica
Na2SO4Sigma-Aldrich239313Specifica: Chimica
H2SO4Sigma-Aldrich339741Specifica: Chimica
Abbreviazione: EDC
N-(3-Dimetilamminopropil)-N'-etilcarbodiimmide cloridratoSigma-AldrichE7750Specifica: Chimica
Abbreviazione: NHS
N-idrossisuccinimideSigma-Aldrich56480Specifica:
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148Specifica: Chimico
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Specifica: Materiale di consumo per colture cellulari
Raschietto cellulareCorning3008Specifica: Materiale di consumo per colture cellulari
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693Specifica: Terreno di coltura cellulare
Essential 6Thermo Fisher scientificA1516401Specifica: Terreno di coltura cellulare
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001Specifica: Terreno di coltura cellulare
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032Specifica: Terreno di coltura cellulare
DMEMThermo Fisher scientific12800-017Specifica: Terreno di coltura cellulare
MCDB 201Sigma-AldrichM6770Specifica: Cellula
ES Cellula ES umanaWiCell Research Institute, Inc..WA09Specifica: cellula iPS
Cellula iPS umanaBanca cellulare RikenHS0077Specifica: 35 mm
Abbreviazione: TCP
TCP piattoCorning353001Specifica: 60 mm
Abbreviazione: TCP
TCP piattoCorning353002Specifica: piatto da 24 pozzetti
Piatto da 24 pozzettiCorning353047Specifica: Blocco agente
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA8806Specifica: Reagente di rilevamento
Colorazione viva della fosfatasi alcalinaThermo Fisher scientificA14353Specifica: Reagente di rilevamento
Ematossilina ed eosinaSigma-Aldrich1.05175Specifica: Piastra di formazione EB
Piastra di attacco ultrabassa a 6 pozzettiCorning3471Specifica: Materiale di rivestimento
gelatinaSigma-AldrichG9391Specifica: Materiale di rivestimento
MatrigelCorning354230Specifica: Topi
topi NOD-SCIDApplied Research LaboratoriesNessunoSpecifica: Siero
fetale bovinoIndustrie biologiche04-001-1ASpecifica: Antibiotico
antibiotico antimicoticoThermo Fisher scientific15240-062Specifica: Anticorpo
anticorpo per NanogInvitrogenMA1-017Specifica: Anticorpo
anticorpo per SSEA4Abcamab16287Specifica: Anticorpo anticorpo
per OCT3/4InvitrogenPA5-27438Specifica: Anticorpo anticorpo
per Sox2Specifiche Invitrogen48-1400: Anticorpi
anticorpi per actina muscolare lisciaInvitrogenPA5-19465Specifiche: Anticorpi
anticorpi per AFPInvitrogenPA5-21004Specifiche: Anticorpi
anticorpi GFAPInvitrogenMA5-15086Specifiche: Anticorpi
Alexa Fluor 555 - coniugato Anticorpo di capra anti-topoInvitrogenA-21422Specifica: Anticorpo
Alexa Fluor 488 - coniugato Anticorpo di capra anti-coniglioInvitrogenA-11008Specifica: Anticorpo
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Riferimenti

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