Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

Summary

Gel-seq consente ai ricercatori di preparare contemporaneamente le librerie per entrambi DNA - e RNA-seq trascurabile costo aggiunto a partire da 100-1000 cellule utilizzando un dispositivo semplice idrogel. Questa carta presenta un approccio dettagliato per la fabbricazione del dispositivo, nonché il protocollo biologico per generare librerie accoppiate.

Abstract

La capacità di amplificare e sequenza di DNA o RNA da piccoli campioni di partenza è stato raggiunto solo negli ultimi cinque anni. Purtroppo, i protocolli standard per la generazione genomico o librerie di trascrittomica sono incompatibili e i ricercatori devono scegliere se sequenza DNA o RNA per un particolare campione. Gel-seq risolve questo problema consentendo ai ricercatori di preparare contemporaneamente le librerie per sia DNA che RNA a partire con 100-1000 cellule utilizzando un dispositivo semplice idrogel. Questa carta presenta un approccio dettagliato per la fabbricazione del dispositivo, nonché il protocollo biologico per generare librerie accoppiate. Abbiamo progettato di Gel-seq, così che potrebbe essere facilmente implementato da altri ricercatori; molti laboratori di genetica hanno già le attrezzature necessarie per riprodurre la fabbricazione di dispositivi di Gel-seq. Il nostro protocollo impiega Kit comunemente usati per l'amplificazione sia intero-trascrizione (WTA) e preparazione di biblioteca, che sono anche suscettibili di essere familiare ai ricercatori già esperto in generazione genomica e trascrittomica librerie. Il nostro approccio permette ai ricercatori di far per valere il potere di sequenziamento del DNA e di RNA su un singolo campione senza spaccare e con costo aggiuntivo trascurabile.

Introduction

Prossima generazione sequenziamento (NGS) ha avuto un profondo impatto sulla strada la ricerca genetica è condotta. Dove i ricercatori una volta concentrata sul sequenziamento del genoma di un'intera specie, ora è possibile sequenziare il genoma di un singolo tumore o anche una singola cella in un esperimento. ¹ NGS ha anche reso conveniente per sequenziare i trascritti di RNA trovati all'interno di una cella, un insieme di dati noto come il trascrittoma. La capacità di amplificare e sequenza di DNA o RNA da piccoli campioni di partenza è stato raggiunto solo negli ultimi cinque anni. ^{2 , 3 , 4} purtroppo, protocolli standard sono incompatibili e i ricercatori devono decidere di sequenza di DNA o RNA per un dato campione. Quando un campione di partenza è abbastanza grande, può essere diviso a metà. Alle scale più piccole, tuttavia, perdita di materiale dovuto spaccare campioni può influire sulla qualità di biblioteca e pool di campioni possono media di interessanti variazioni fra le cellule. ⁵ inoltre, i ricercatori sono sempre più interessati ad esaminare i campioni che non possono essere suddivisi, come cellule singole o biopsie di piccolo tumore eterogeneo. ⁶

Per risolvere questo problema, tre protocolli sono stati recentemente sviluppati per RNA e DNA di sequenza dallo stesso campione iniziale: Gel-seq⁷, G & T-seq⁸e DR-seq⁹. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per Gel-seq, che può essere utilizzato per generare simultaneamente librerie di DNA e RNA da poco più di 100 celle a costi trascurabili aggiunto. L'aspetto di novità di Gel-seq è la capacità di separare DNA e RNA basata esclusivamente sulla dimensione utilizzando matrici di idrogel di basso costo. L'innovazione di nucleo del protocollo Gel-Seq è la separazione fisica del DNA da RNA. Questa separazione si ottiene elettroforeticamente utilizzando una combinazione di membrane di poliacrilammide che sfruttano le differenze di dimensioni tra queste molecole. Per mettere queste differenze di dimensione nel contesto, considera come DNA e RNA sono Imaging: mentre DNA esiste sulla micron-scala e possa essere visualizzato utilizzando microscopi tradizionali, RNA esiste su scala nanometrica e deve essere imaged utilizzando tecniche complesse come la cryo-elettrone microscopia. ¹⁰

L'approccio alla separazione del DNA e RNA in questo protocollo è illustrato nella Figura 1. Il pannello di sinistra mostra DNA e RNA gratis galleggianti in soluzione nei pressi di una membrana. Quando viene applicato un campo elettrico, come mostrato nel pannello di destra, DNA e RNA esperienza una forza elettroforetica che induce la migrazione attraverso la membrana. Regolando le proprietà della membrana, abbiamo creato una membrana semipermeabile che separa il DNA dal RNA. Le molecole di DNA vengono spinte contro la membrana, ma rimanere impigliate ai margini a causa delle loro grandi dimensioni. Piccole molecole di RNA, d'altra parte, possono riconfigurare e tessere la loro strada attraverso la membrana. Questo processo, noto come reptation, è simile a quello di che un serpente si muove attraverso l'erba. Alla fine queste molecole di RNA vengono fermate da una seconda membrana ad alta densità che è troppo difficile per i polimeri ancora più piccoli (> 200 paia di basi) a divincolarsi attraverso. Una volta fisicamente separato, DNA e RNA possono essere recuperati ed elaborati per generare informazioni sul genoma e il trascrittoma. Mentre possiamo separare DNA e RNA, abbiamo trovato risultati migliori si ottengono se il RNA è inverso trascritto in cDNA prima della separazione. Gli ibridi di cDNA/RNA sono più stabili di RNA da solo e possono ancora passare attraverso la membrana a bassa densità.

Figura 1 . Principio di funzionamento del gel-seq. Il principio sottostante utilizzato per separare fisicamente il DNA e RNA. In un campo elettrico applicato, piccole molecole di RNA migrano attraverso la membrana a bassa densità ma grandi molecole di DNA sono intrappolati sulla superficie. Questa figura è stata riprodotta da Ref. 7 con il permesso della Royal Society of Chemistry. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo articolo descrive in dettaglio sia la fabbricazione del dispositivo Gel-seq e accoppiato il protocollo biologico per generare librerie di DNA e RNA. Una panoramica di entrambi è illustrata nella Figura 2. Il dispositivo è fabbricato da stratificazione tre differenti densità gel di poliacrilammide in cima a vicenda in un processo simile alla creazione di standard gel d'impilamento. ¹¹ il protocollo biologico inizia con 100-1000 cellule sospese in PBS. Le cellule sono lisate e il RNA viene convertito in cDNA prima che il dispositivo viene utilizzato per separare il DNA genomico da ibridi cDNA/RNA. Dopo la separazione e recupero, genomica e trascrittomica librerie vengono preparate utilizzando un processo che segue da vicino il protocollo di kit di preparazione libreria standard intero genoma. Ulteriori dettagli sullo sviluppo e la convalida di Gel-seq possono essere letto in laboratorio su una pubblicazione di Chip "Gel-seq: intero genoma e sequenziamento del trascrittoma di basso input del DNA e RNA libreria preparazione simultanea utilizzando barriere semipermeabile idrogel ." ⁷

Figura 2 . Protocollo di gel-seq. Una panoramica dei passaggi per fabbricare il dispositivo Gel-seq e il protocollo generare coppia librerie di DNA e RNA. Porzioni di questa figura sono state riprodotte da Ref. 7 con il permesso della Royal Society of Chemistry. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per generare le librerie di DNA e RNA da cellule singole, i ricercatori dovrebbero considerare l'utilizzo di G & T-seq o DR-segg. G & T-Seq, come Gel-seq, si basa su una separazione fisica di RNA dal DNA genomico. Questo approccio si basa sul RNA messaggero (mRNA) 3 ′ poliadenilazione coda come una menu a discesa destinazione. il mRNA viene catturato il magnetic beads utilizzando un primer oligo-dT biotinilato. Una volta che il mRNA è stato catturato le perline sono tenute in posizione da un magnete e il supernatante contenente il DNA genomico può essere rimosso e trasferito in un'altra provetta. Dopo aver completata questa separazione fisica, librerie separate possono essere generate dal mRNA e DNA. ⁸ questo approccio funziona bene se il RNA di interesse è poliadenilazione, tuttavia non può essere utilizzato per studiare le trascrizioni non poliadenilazione, come RNA ribosomiale, tRNA o RNA da procarioti.

DR-seq si basa su un passaggio di pre-amplificazione dove sono amplificati sia DNA e cDNA derivate da RNA nello stesso tubo. Il campione è quindi diviso in due ed elaborato in parallelo per preparare librerie di DNA e RNA-seq. Per distinguere tra il DNA di genomic e il cDNA derivate da RNA, DR-seq adotta un approccio computazionale. Sequenze dove sono presenti solo esoni informaticamente vengono soppressi nei dati di DNA genomici, come quelli potrebbe avere avuto origine da DNA o RNA. ⁹ un vantaggio di questo approccio è che il DNA e cDNA/RNA bisogno di non essere fisicamente separate come avviene in Gel-seq e G & T-segg. Lo svantaggio, tuttavia, è che il DR-seq richiede conoscenza a priori del genoma e del trascrittoma (cioè, esoni e introni) e potrebbe non essere l'ideale per applicazioni come il sequenziamento dei nuclei, in cui molte trascrizioni non sono ancora completamente impiombato e contengono ancora gli introni. ¹²

L'aspetto di novità di Gel-seq è la capacità di separare il DNA ed il RNA in centinaia di celle basate esclusivamente sulla dimensione. Questo metodo richiede nessuna conoscenza aprioristicamente del genoma o del trascrittoma, è robusta contro splicing incompleta e non è limitata alle trascrizioni di poli-adenylated. Per le applicazioni dove un ricercatore può iniziare con almeno 100 cellule, Gel-seq fornisce un approccio diretto con materiali economici e ampiamente disponibili.

Protocol

1. preparazione soluzione chimica

Nota: I passaggi seguenti sono per la preparazione di soluzioni chimiche necessarie nei passaggi successivi. Questi possono essere fatti alla rinfusa e conservati per diversi mesi.

1. Per iniziare, preparare 50 mL di acqua deionizzata, purificata da sterilizzare in forno a 254 nm UV reticolazione per 15 min (15 mJ/cm² esposizione totale) neutralizzare qualsiasi DNA contaminante. Riscaldare a 37 ° C per uso nella seguente procedura.
2. Fare 10 mL di un 40% del totale (T) e 3,3% crosslinker (C) (29: 1) soluzione di precursore di poliacrilammide. Pesare 3,867 g di acrilammide monomero e 0,133 g di bis-acrilammide monomero. Combinare e portare il volume fino a 10 mL con acqua purificata calda e vortice fino a completa dissoluzione. Conservare al riparo dalla luce a temperatura ambiente.
   Nota: Premiscelato 40% T, soluzioni di poliacrilammide di 3.3% C (29: 1) possono essere acquistate in commercio.
3. Fare 10mL di 50% T, soluzione di gel 5% C. Pesare 4,750 g di acrilammide monomero e 0,250 g di bis-acrilammide monomero. Combinare e portare il volume fino a 10 mL con acqua purificata tiepida e vortice fino a completa dissoluzione. Conservare al riparo dalla luce a temperatura ambiente.
4. Fare 10 mL di una soluzione di saccarosio di 50% (p/v). Aggiungere 5 g di saccarosio per un cilindro graduato e aggiungere acqua calda purificata fino ad un volume totale di 10 mL. Vortice fino a completa dissoluzione e conservare a temperatura ambiente.
5. Fare 10 mL di 10% APS (w/v). Aggiungere 1 g di ammonio persolfato (APS) per un cilindro graduato. Aggiungere a freddo (~ 4° C) purificata dell'acqua fino a un volume totale di 10 mL e agitare fino a completa dissoluzione. Immediatamente congelare in aliquote di 200 µ l.

2. gel-seq Cassette Fabrication

Nota: Gel-seq è stato originariamente sviluppato con cassette in posizione verticale (per ulteriori informazioni, vedere Tabella materiali ); Tuttavia, il presente protocollo possa essere adattato per funzionare con qualsiasi vassoio di elettroforesi del gel standard.

1. Preparare gel precursori in tre provette di plastica separate aggiungendo reagenti come mostrato nella tabella 1 di . Non aggiungere APS o tetrametiletilendiammina (TEMED) fino al diretto nei passaggi seguenti. Ingredienti di vortice per miscelare accuratamente.

Precursore del Gel di riempimento		Precursore di Gel ad alta densità		Bassa densità Gel precursore
40 %T, 3.3%C acrilamide Bisacrylamide soluzione	1,6 mL	50 %T, 5 %C acrilammide Bisacrylamide soluzione	2,4 mL	40 %T, 3.3%C acrilamide Bisacrylamide soluzione	0,6 mL
Acqua deionizzata	10,2 mL	Acqua deionizzata	1,0 mL	Acqua deionizzata	4,8 mL
Soluzione di saccarosio (50% p/v)	2,6 mL	Soluzione di saccarosio (50% p/v)	0,6 mL
10 X Tris-Borato-EDTA	1,6 mL			10 X Tris-Borato-EDTA	0,6 mL
Persolfato dell'ammonio (10% w/v)	104.0 Μ l	Persolfato dell'ammonio (10% w/v)	50,0 Μ l	Persolfato dell'ammonio (10% w/v)	Μ l 39.0
TEMED	6,0 Μ l	TEMED	1,0 Μ l	TEMED	2,2 Μ l
Volume totale	16,1 mL	Volume totale	4,1 mL	Volume totale	6,0 mL

Tabella 1. Reagenti di sintesi del gel. Reagenti di precursore del gel di poliacrilammide sufficienti per la fabbricazione di 2 cassette.

2. De-gas soluzioni di monomero gel inserendo un ago attraverso il tappo del tubo e collegare questo ago una linea del vuoto di casa. Immergere questo assembly in un set bagno ad ultrasuoni ad alta e attendere fino a quando bolle interrompere emergenti dal liquido prima di passare alla fase successiva (~ 60 secondi / tubo).
   Nota: La qualità del vuoto e la potenza del bagno ad ultrasuoni non è critici fino a quando bolle possono essere visto emergenti dalla soluzione.
3. Aggiungere TEMED e APS per il riempimento gel precursore e vortexare brevemente. Immediatamente aggiungere 6 mL del precursore del gel di riempimento per ogni vassoio del gel pipettando la soluzione nella parte superiore della cassetta. Utilizzare una micropipetta 1ml per aggiungere il precursore in sei incrementi per evitare di versare. Il tempo totale per questo passaggio dovrebbe essere meno di 3 minuti.
4. Verificare che il fluido piano posizionando le cassette in posizione verticale su una tabella di livello. Riempire il resto della cassetta con acqua deionizzata, degassato. Pipettare l'acqua, utilizzando nuovamente con incrementi di 1 mL, lentamente al centro della cassetta per minimizzare la miscelazione. Consentire il polimero a curare per almeno un'ora, fino a tutta la notte.
5. Dopo il polimero ha guarito, invertire le cassette di gel sopra un lavandino per rimuovere la sovrapposizione di acqua. Pistola ad aria compressa può essere utilizzata per asciugare delicatamente l'interfaccia soffiando aria attraverso l'apertura superiore della cassetta da una distanza di 6 pollici.
6. Aggiungere TEMED e APS per il precursore di gel ad alta densità e vortexare brevemente. Aggiungere immediatamente µ l 320 del precursore ad alta densità per la cassetta, nuovamente utilizzando una pipetta da 1 mL. Assicurarsi che il fluido cappotti uniformemente lo strato di gel di riempimento da dondolo la cassetta avanti e indietro circa 3 volte. Questo passaggio dovrebbe richiedere meno di tre minuti.
7. Riempire il resto della cassetta con acqua deionizzata, degassato. Pipettare lentamente con una pipetta da 1 mL in al centro della cassetta per minimizzare la miscelazione. Consentire il polimero curare per almeno quindici minuti, preferibilmente un'ora.
8. Ancora una volta, invertire le cassette di gel per rimuovere la sovrapposizione di acqua. Aria compressa può essere utilizzato per asciugare delicatamente l'interfaccia. Aggiungere TEMED e APS per il precursore di gel a bassa densità e vortexare brevemente. Immediatamente riempire il resto della cassetta (~1.65 mL) con il precursore di gel a bassa densità e inserire il pettine di gel.
9. Pipettare un eccesso di precursore di riserva nella parte superiore del pettine come esso sarà assorbito durante la polimerizzazione. Consentire il polimero curare almeno 4 ore, preferibilmente durante la notte. Gel può essere conservato per una settimana o più in un buffer di acido Tris-borato-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone TBE).

3. preparazione del campione e trascrizione inversa

1. A partire con una sospensione di cellule di interesse e lavorando in una cappa a flusso laminare della polimerasi reazione a catena (PCR), è possibile utilizzare un contatore automatico delle cellule o un emocitometro per calcolare la concentrazione cellulare. Diluire le cellule ad una concentrazione di 100 a 1000 cellule per µ l di tampone fosfato salino (PBS).
   Nota: Questo protocollo è stato convalidato su un intervallo di celle compreso PC3, HeLa e cellule del fegato del topo.
2. Utilizzando reagenti forniti nel WTA kit (Vedi Tabella materiali), mix 19 µ l di tampone di lisi e 1 µ l di inibitore di RNAsi a preparare un 10x stock soluzione del tampone di reazione. Creare un mix master di lisi di sufficiente volume contenente 0,5 µ l di tampone di reazione e 2.75 µ l di acqua libera nucleasi per ciascun campione.
3. Dispensare la sospensione cellulare su e giù per 5 volte per risospendere le cellule depositate e quindi Pipettare 1 µ l di campione in una provetta di striscia libera di 200 µ l nucleasi sterilizzata da UV. Ripetere se necessario a seconda del numero di campioni. Assicurarsi di includere un controllo negativo di pipettaggio 1 µ l di acqua gratuita di nucleasi invece di celle per una reazione. Successivamente, aggiungere 3,25 µ l di mix master Lisi per ogni campione e Miscelare pipettando delicatamente su e giù per 5 volte.
4. Preriscaldare un termociclatore (con coperchio riscaldato) a 72 ° C. Aggiungere 1 µ l di primer RT e 1 µ l di 20 µM casuale hexamer con adattatore WTA (5 ′-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3 ′) per ogni campione. Prenotare almeno un tubo come controllo positivo per preparazione libreria gDNA e aggiungere 2 µ l di acqua invece di primer.
   Nota: Random hexamer con adattatore WTA è facoltativo e ha un impatto minimo sui risultati di sequenziamento.
5. Incubare i campioni a 72 ° C nel termociclatore preriscaldato per 3 minuti per lisare le cellule. Rimuovere le cellule dal termociclatore e posto sul ghiaccio per 2 minuti. Conservare il controllo positivo a 4 ° C fino al passaggio 5.
6. Mentre le cellule sono Lisi, creare un volume sufficiente di mix master trascrizione inversa per tutti i campioni di RNA che contiene i seguenti rapporti di reagente: 2 µ l di buffer primo strand, 0,5 µ l di interruttore del oligonucleotide modello (TSO), 0,25 µ l di inibitore di RNAsi e 1 µ l di della trascrittasi inversa (100 U / µ l).
7. Preriscaldare il termociclatore a 42 ° C. Aggiungere 3,75 µ l di mix master trascrizione inversa ai campioni rimanenti, portando il volume totale del campione a 10 µ l. Mix pipettando su e giù per 5 volte.
8. Eseguire la trascrizione inversa mettendo immediatamente i campioni in un termociclatore preriscaldato. Eseguire il seguente programma: 42 ° C per 90 min, 70 ° C per 10 min, 4 ° C per sempre. Si tratta di un punto di arresto sicuro.

4. gel separazione e recupero di esempio

1. Pulire accuratamente una camera di elettroforesi del gel utilizzando un prodotto di rimozione del DNA. Applicare alcuni mL di liquido detergente e un panno monouso libero wipe wipe su tutte le superfici della camera e quindi riempire la camera con 0,5 pulito x TBE. Per risultati ottimali, posizionare l'intero apparato in un forno a reticolazione UV di 254 nm e sterilizzare per 15 minuti (15 mJ/cm²).
2. Inserire la cassetta di Gel-seq nella camera di elettroforesi del gel e bloccarlo in posizione. Rimuovere lentamente il pettine di gel tirando verso l'alto. Muoversi lentamente per evitare il gel di lacerazione o strappo qualsiasi delle braccia.
3. Mantenere i campioni dal passaggio 3 sul ghiaccio, riservare almeno un campione come controllo positivo per la generazione della libreria di cDNA. Memorizzare questo controllo a 4 ° C fino al passaggio 6. Aggiungere 2 µ l di 6 X caricamento colorante per gli altri campioni, portando il volume totale di ~ 12 µ l. accuratamente mescolare i campioni pipettando su e giù per 5 volte.
4. Unire 1 µ l di una scaletta di DNA con 2 µ l di 6x loading dye e 7 µ l di acqua. Pipettare questa miscela in corsia 1 della cassetta Gel-seq come un controllo di elettroforesi. Pipettare i campioni dal passaggio precedente in corsie separate della cassetta Gel-seq. Fare attenzione a evitare la contaminazione tra pozzetti inserendo la pipetta completamente in ogni pozzetto e rimuoverlo utilizzando solo un movimento verticale.
5. Utilizzando un alimentatore di standard del gel di elettroforesi, applicare un campo elettrico di 250 V attraverso la cassetta di Gel-seq per 30 minuti separare il gDNA da ibridi cDNA/RNA. Una volta separato, rimuovere la cassetta di Gel-seq dalla camera di elettroforesi del gel e aprire le due metà della cassetta aprendo i bordi con una spatola.
6. Usando un bisturi, tagliare il gel a metà appena sotto lo strato ad alta densità. Scartare la metà contenente gel di riempimento sollevando con la mano guantata. Sbucci delicatamente il gel rimanente fuori la cassetta da raschiare con una spatola di vernice o altro strumento simile. Inserire in questa sezione del gel in un piatto contenente ~ 30 mL di 0.5 x TBE con 3 µ l di gel macchia.
7. Coprire il contenitore per minimizzare photobleaching e immergere il gel agitando delicatamente il contenitore per 5 minuti. Collocare il gel su involucro di plastica e prendere un'immagine UV utilizza un sistema di documentazione del gel (per maggiori dettagli vedi Rif. 13). Un 30 seconda esposizione in genere produce immagini nitide. Verificare che la separazione si è verificato.
8. Spostare il gel un transilluminatore UV per facilitare la visualizzazione degli acidi nucleici. Indossare gli occhiali UV appropriati, confermano i risultati del sistema di documentazione del gel. Il gDNA dovrebbe trovarsi all'inizio del gel a bassa densità e il cDNA nell'interfaccia delle regioni a bassa densità e ad alta densità.
9. Utilizzare un bisturi, tagliare le regioni del gel contenente il gDNA e cDNA. Campioni sono meglio recuperati dal taglio di una 4 mm di sezione rettangolare di mm 10 di gel; Tuttavia, la geometria esatta dipenderà il sistema di elettroforesi del gel utilizzato. Ricordarsi di tagliare anche la corsia caricata con il controllo negativo.
10. Posizionare ogni sezione asportata di gel in un tubo di striscia utilizzando un paio di pinzette a punta smussata. Fare attenzione a non applicare troppa forza o il gel verrà suddiviso in più parti. Dovrebbe questo accadere, semplicemente prendere ogni pezzo e aggiungerlo al tubo.
11. Macinare il gel in ogni provetta utilizzando la punta di una pipetta (200 µ l pipette suggerimenti funzionano bene) spostando la punta della pipetta in modo circolare contro il fondo del tubo. Aggiungere acqua gratuita di nucleasi (40 µ l in campioni gDNA e 80 µ l nei campioni di cDNA) ad ogni provetta prima di rimuovere la punta della pipetta utilizzata per macinare il gel per minimizzare la perdita di campione.
12. Posizionare i tubi di striscia per un miscelatore vortex all'interno di un incubatore a 37 ° C e agitare per 8-12 ore. In questo modo gli acidi nucleici diffondere fuori il gel ed è un naturale punto per questo multi protocollo di giorno di sosta.
13. Pipettare i campioni in una piastra di filtro maglia 8 µm e girare la piastra a 2600 x g per 5 minuti per ceppo i frammenti di gel. Sollevare la piastra filtro maglia lontano il portatasselli e pipettare i campioni di acqua gel-libera in un nuovo tubo di striscia 200 µ l.
14. Aggiungere 1 µ l di proteasi (0,9 AU/mL) ad ogni campione contenente gDNA, mix ben pipettando su e giù e incubare a 50 ° C per 15 min seguita da un'inattivazione termica a 70 ° C per 15 min. Questo passaggio è fondamentale per impoverire nucleosomi e rende il gDNA accessibile per la procedura di reazione successiva.
15. Utilizzando un ago 18 calibro, colpire i fori nelle calotte di tutte le provette. Posizionare i campioni in un vacufuge per ridurre il volume di liquido. gDNA campioni devono essere ridotta a 5 µ l e cDNA campioni ridotti a 10 µ l.
16. A seconda della vacufuge e il numero di campioni, il tempo di evaporazione totale varia tra 30 e 60 minuti. Se il volume del campione scende di sotto del volume di destinazione, è sufficiente aggiungere acqua gratuita di nucleasi per aumentare il volume del campione.

5. gDNA libreria preparazione

1. Utilizzando un fluorimetro o tecnologia simile, quantificare la concentrazione di DNA in ogni campione gDNA dal passaggio 4, nonché il controllo positivo dal passaggio 3. Per un protocollo dettagliato vedere il manuale di riferimento del fluorimetro. ¹⁴
2. Diluire i campioni a 0,2 ng / µ l di DNA. A seconda del tipo di cella di partenza e qualità dei risultati richiesti, le concentrazioni più basse possono produrre ancora praticabile librerie. Alcune sperimentazioni sarà richiesto; Tuttavia, gli autori hanno avevano successo con librerie à partire 0,1 ng / µ l.
3. Completare gDNA libreria preparazione seguendo il protocollo di volume reazione mezza preparazione libreria in Step 7.

6. cDNA Library preparazione

1. A partire da 10 µ l del cDNA campioni e controllo positivo dal passaggio 4, aggiungere 12,5 µ l di miscela di X qPCR 2, 0,5 µ l cDNA PCR primer e acqua priva di nucleasi 2 µ l.
2. Eseguire PCR in un termociclatore in tempo reale utilizzando il seguente protocollo: avviamento a caldo a 95 ° C per 3 min, seguiti da cicli di 20-30 di 98 ° C per 10 s, 65 ° C per 30 s e 72 ° C per 3 min campione totale volume è 25 µ l. monitorare le curve di reazione e interrompere l'amplificazione prima th reazioni e lasciano la fase esponenziale (incremento del segnale lineare rispetto al numero di cicli) onde evitare artefatti PCR a causa di overamplification. Per ulteriori informazioni su come evitare overamplification, vedere la sezione di discussione di questa carta come pure Rif. 15.
3. Dopo l'amplificazione, pulire il prodotto usando i branelli di immobilizzazione reversibile (SPRI) fase solida seguendo il protocollo nel passaggio 8. Una volta completato, procedere al passaggio successivo.
4. Utilizzando un fluorimetro o tecnologia simile, quantificare la concentrazione di DNA in ogni campione di cDNA, nonché il controllo positivo dal passaggio 4. Diluire i campioni se necessari per contenere circa 0,2 ng / µ l di DNA. Concentrazioni leggermente inferiori producono ancora praticabile librerie. Alcune sperimentazioni sarà richiesto, tuttavia gli autori hanno avevano successo con librerie à partire 0,1 ng / µ l.
5. Passaggio facoltativo: eseguire una separazione di elettroforesi del gel di poliacrilammide standard su 1-2 µ l di ciascun prodotto qPCR per convalidare la reazione di generazione libreria lavorato. Un'immagine di esempio del risultato di successo è illustrata nella Figura 4. Per un protocollo dettagliato su come condurre l'elettroforesi del gel di poliacrilammide, vedere Rif. 16.
6. Completare la preparazione di cDNA biblioteca seguendo il protocollo di reazione libreria preparazione kit metà volume nel passaggio 7.

7. Biblioteca preparazione con reazioni di metà del Volume

1. Libreria preparazione segue il protocollo di kit di preparazione libreria usando le reazioni a metà volume. ¹⁷ tutti i reagenti a cui fa riferimento in questa sezione del protocollo sono dalla preparazione libreria kit (Vedi Tabella materiali). Iniziare da UV sterilizzazione un numero sufficiente di tubi in striscia per il numero di campioni da elaborare.
2. Eseguire la reazione di transposase aggiungendo 5 µ l di tampone di transposase per ogni tubo di striscia per essere usato per il test. Quindi aggiungere 2,5 µ l ingresso DNA a 0,2 ng / µ l (totale 0,5 ng) seguita da 2,5 µ l transposase. Mescolare pipettando su e giù per 5 volte.
3. Incubare a 55 ° C per 5 minuti, quindi tenere premuto a 10 ° C. Dopo che il campione raggiunge i 10 ° C, togliere il termociclatore e immediatamente aggiungere 2,5 µ l transposase fermata tampone per ogni campione. Conservare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti.
4. Preparare la reazione di PCR per amplificare il campione di trasposizione trattati aggiungendo 7,5 µ l biblioteca della preparazione della PCR mix, 2,5 µ l di un primer di indice 1 e 2,5 µ l di un primer di indice 2. Questi iniettori sono proprietari e sono forniti dal produttore del kit di preparazione di libreria. Miscelare bene pipettando su e giù per 5 volte.
   Nota: Assicurarsi che per ogni campione vengono utilizzate combinazioni di primer unico. Ci sono 12 diversi indice 1 primer e 8 iniettori diverso indice 2, che permette di etichettare in modo univoco fino a 96 campioni diversi. Scegliere una combinazione unica di primer per ogni campione.
5. Eseguire PCR utilizzando il seguente programma in un termociclatore. Il volume del campione è di 25 µ l.
   72 ° C per 3 minuti
   95 ° C per 30 secondi
   12 cicli di:
   95 ° C per 10 secondi
   72 ° C per 30 secondi
   55 ° C per 30 secondi
   72 ° C per 5 minuti
   Tenere a 10 ° C
6. Pulire le librerie preparate usando i branelli SPRI seguendo il protocollo nel passaggio 8. Le librerie devono essere convalidate mediante elettroforesi su gel o un dosaggio simile. Consultare il manuale di kit di preparazione libreria per dettagli su come convalidare le librerie. ¹⁷

8. solido fase reversibile immobilizzazione perlina biblioteca pulizia

1. Fase solida perline reversibile immobilizzazione (SPRI) devono essere conservati in aliquote di 1,5 mL e dovrebbero essere portato a temperatura ambiente prima di ogni utilizzo. Si consiglia inoltre di preparare fresco 80% etanolo per ogni esperimento. La procedura seguente si basata il protocollo di perlina SPRI nel manuale del kit WTA. ¹⁸
2. Aggiungere 1 µ l di buffer di lisi di kit WTA per ogni prodotto PCR. Vortice le perline SPRI finché non uniformemente misti, quindi aggiungere 50 µ l di perline SPRI per ogni campione. Mescolare pipettando il campione su e giù per 10 volte e poi incubare i campioni a temperatura ambiente per 8 minuti.
3. Girare brevemente i campioni per raccogliere il liquido dal lato dei tubi. Posizionare i campioni su un dispositivo di separazione magnetica per ~ 5 minuti fino a quando il liquido appare completamente chiaro.
4. Mentre i campioni sono il dispositivo di separazione magnetica, lentamente Pipettare il surnatante e scartare - fare attenzione a non disturbare l'anello di perline sul tubo. Successivamente aggiungere 200 µ l di etanolo di 80% per ogni campione senza disturbare le perline. Attendete per 30 secondi e poi accuratamente Pipettare il sovranatante. Ripetere questo passaggio (lavaggio a etanolo) una volta.
5. Consentire ai campioni di asciugare per 30 s - 1 min. Non asciugare troppo i campioni come grandi frammenti saranno diventare permanentemente vincolati ai talloni.
   Nota: Un breve tempo di asciugatura è consigliabile accertarsi di che rimuovere tutte le tracce di etanolo. Restino tracce di etanolo dietro leggermente possono inibire le reazioni a valle.
6. Rimuovere i campioni dal dispositivo di separazione magnetica e aggiungere 15 µ l di acqua per ogni campione per eluire il DNA dalle perle. Pipettare su e giù e garantire che le perle vengono rimossi dai lati dei tubi. Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti. Girare brevemente i campioni e poi metterli sul dispositivo di separazione magnetica per ~ 1 minuto fino a quando la soluzione appare chiara.
7. Mentre i campioni sono il dispositivo di separazione magnetica, lentamente Pipettare fino il supernatante e trasferirlo ai tubi puliti. Fare attenzione a non disturbare l'anello di perline sul tubo. Scartare i tubi con perline.

Results

La separazione fisica degli ibridi gDNA e cDNA/RNA nel dispositivo Gel-seq possa essere visualizzata attraverso gel fluorescente per immagini; un risultato rappresentativo è illustrato nella Figura 3. Pannello A Mostra il dispositivo fabbricato di Gel-seq; falso colore è stata aggiunta per distinguere le regioni di diversi gel. Pannello B rivela una stretta di quattro separazioni differenti utilizzate per la convalida. La terza corsia, un controllo negativo, ...

Discussion

Ci sono diversi passaggi critici connessi con la fabbricazione di dispositivi di Gel-seq, nonché il protocollo stesso. Durante la produzione, si consiglia di iniziare con gli spessori di strato prescritti per le varie regioni del gel. Abbiamo trascorso un tempo significativo fabbricazione differenti opzioni di test e il protocollo descritto qui produce i migliori dispositivi per le cassette elencati nella tabella materiali e reagenti. Se i ricercatori usano un sistema alternativo di cassetta, trovino nec...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti
Acrilammide Monomero	Sigma Aldrich	A8887-100G
Persolfato di ammonio	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Indicato nel testo come perline di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI)
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientifico	R0611	Indicato nel testo come colorante di caricamento 6X
Alcool etilico	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kit	Kapa BioSystems	7959613001	Indicato nel testo come miscela 2X qPCR
N,N′-Methylenebis(acrilammide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Conosciuto anche come bis-acrilammide
NexteraXT Kit di preparazione della libreria di DNA (indicato nel testo come kit di preparazione della libreria)	Illumina	FC-131-1024	Include: TD (indicato nel testo come tampone di trasposasi), ATM (indicato nel testo come tampone di arresto della trasposasi) e NPM (indicato nel testo come miscela PCR per la preparazione della libreria)
Acqua	priva di nucleasiKit Millipore	3098
Proteasi	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 (indicato nel testo come kit di amplificazione dell'intero trascritto (WTA)	Takara/Clontech	634888	Include: tampone di lisi, inibitore della RNasi, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (indicato nel testo come RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (indicato nel testo come first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (indicato nel testo come oligonucleotide switch modello (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (indicato nel testo come trascrittasi inversa) e PCR Primer II A (indicato nel testo come cDNA PCR primer)
Esamero casuale con adattatore WTA	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Saccarosio	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Decontaminante per superfici	ThermoFisher Scientific	7010PK	Indicato nel testo come prodotto per la rimozione del DNA
Tampone tris-borato-EDTA (concentrazione 10X)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10.000X concentrato in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Indicato nel testo come gel stain
Equipment
BD Precisionglide  aghi per siringhe, calibro 18	Sigma Aldrich	Z192554	Qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Bagno a ultrasuoni della serie CPX	di Branson Sigma Aldrich	Z769363	Qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Cassette di gel vuote, mini, 1,0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	È accettabile
qualsiasi hardware equivalentePiastra filtrante a rete - Corning  HTS Transwell 96 supporti permeabili a pozzetti - 8.0 µ m dimensione dei pori	Sigma Aldrich	CLS3374	Indicato nel testo come piastra filtrante a rete da 8 um
Alimentatore PowerPac HC	Bio-Rad	1645052	Qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Qubit Fluorimeter	ThermoFisher Scientific	Q33216	Qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Sistema XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001	Qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Bio-Rad CFX96 Touch Sistema di rilevamento PCR in tempo reale	Bio-Rad	1855195	Qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Fuori produzione, qualsiasi hardware equivalente è accettabile
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Indicato nel testo come gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Indicato nel testo come UV transilluminator
Ultrasuoni  Bagno	Bransonic	1207K35	Qualsiasi bagno ad ultrasuoni equivalente è accettabile.