Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.
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Articolo metodologico
Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
La famiglia di caspase di proteasi svolgono un ruolo essenziale nell'apoptosi e l'immunità innata. Tra questi, un sottogruppo conosciuto come initiator caspases sono il primo a essere attivato in queste vie. Questo gruppo include il caspase-2, -8 e -9, come pure i caspases infiammatori, caspasi-1, -4 e -5. I caspases iniziatore sono tutti attivati di dimerizzazione successivo all'assunzione di specifici complessi multiproteici chiamati piattaforme di attivazione. Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un approccio basato su formazione immagine dove dividere le proteine fluorescenti fuse initiator caspases sono utilizzati per visualizzare il reclutamento delle caspasi iniziatore a loro piattaforme di attivazione e la conseguente prossimità di indotto. Questa fluorescenza consente una lettura di uno dei primi passaggi richiesti per l'attivazione di caspase iniziatore. Utilizzando un numero di differenti approcci basati su microscopia, questa tecnica è in grado di fornire dati quantitativi sull'efficienza dell'attivazione di caspase a livello di popolazione, nonché la cinetica di attivazione delle caspasi e la dimensione e il numero di attivazione di caspase complessi su base per cella.
Introduzione
La famiglia di proteasi caspasi è noti per i loro ruoli critici nell'apoptosi e immunita ' 1. A causa della loro importanza, determinare quando, dove e quanto efficientemente caspases specifici vengono attivati può fornire le comprensioni cruciale nei meccanismi della caspasi vie di attivazione. Il protocollo base imaging qui descritto consente la visualizzazione dei primi passi nella cascata di attivazione di caspasi. Questa tecnica sfrutta le interazioni dinamiche della proteina: l'attivazione di caspase che in auto.
I caspases possono essere divisi in due gruppi: i caspases iniziatore (caspasi-1, -2, -4, -5, -8, -....
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Protocollo
1. preparazione delle cellule e piastre di coltura
Nota: Eseguire i passaggi 1-3 in cappa a flusso laminare di coltura del tessuto. Indossare i guanti.
- Se utilizza piatti di fondo di vetro, ricoprire il vetro con fibronectina. Andare al passaggio 1.2 se utilizza piatti di plastica.
- Fare una soluzione di 0,1 mg/mL di fibronectina: diluire 1 mL di soluzione di fibronectina 1 mg/mL in 9 mL di 1X PBS.
- Coprire il fondo di vetro di ciascun pozzetto con 0,5-1 mL di fibronectina e incubare per 1-5 min a temperatura ambiente.
- Utilizzando una pipetta, raccogliere la soluzione di fibronectina e conservare a 4 ° ....
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Risultati
Nella Figura 3è riportato un esempio di caspase-2 BiFC indotta da danno del DNA. Camptotecine, una topoisomerasi io inibitore, è stato usato per indurre il danno del DNA, attivazione di caspase-2. La mCherry proteina fluorescente rosso è stato utilizzato come reporter per mostrare che le cellule esprimono la sonda BiFC e per aiutare a visualizzare il numero totale di cellule. Fluorescenza di Venus è mostrato in verde e la grande puncta rappresentano caspase-2.......
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Discussione
Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo di proteine fluorescenti di Spalato per misurare caspasi indotta prossimità. Venus di Spalato è stato scelto per questa tecnica perché è molto luminoso, altamente fotostabili e il ripiegamento è veloce 13. Così, l'analisi di Venere ripiegamento su caspasi indotta prossimità può fornire vicino le valutazioni in tempo reale delle dinamiche di interazione della proteina caspasi. Venus è diviso in due frammenti leggermente sovrapposti, il capolinea di N di.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare tutti i membri precedenti del laboratorio Bouchier-Hayes, che hanno contribuito allo sviluppo di questa tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal ospedale pediatrico pilota premio Texas bambini a LBH. Ringraziamo la Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) per il permesso di includere i dati pubblicati in collaborazione con la sua squadra. Lo sviluppo dei reagenti descritto è stato sostenuto dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e l'assistenza di Joel M. Sederstrom
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre con fondo in vetro da 20 mm non rivestite a 6 pozzetti n. 1.5 | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Proteina purificata con fibronectina al plasma umano | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Reagente Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| Plasmide C2-Pro VC | Addgene | 49261 | |
| Plasmide C2-Pro VN | Addgene | 49262 | |
| BiFC caspasi infiammatori | disponibili su richiesta presso le cellule LBH | ||
| HeLa che esprimono stabilmente i componenti | disponibili su richiesta presso LBH | ||
| DsRed mito plasmide | Clontech | 632421 | plasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti possono essere trovati su Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
Riferimenti
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J.
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Ristampe e permessi
