Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Summary

Nilo rosso macchiatura di fisso Caenorhabditis elegans è un metodo per la misurazione quantitativa dei depositi di lipidi neutri, mentre olio rosso O colorazione facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi fra i tessuti.

Abstract

Caenorhabditis elegans è un organismo modello eccezionale in cui studiare il metabolismo dei lipidi e dell'omeostasi energetica. Molti dei suoi geni del lipido sono conservati negli esseri umani e sono associati con la sindrome metabolica o altre malattie. Esame di accumulazione del lipido in questo organismo può essere effettuato da coloranti fissativi o metodi privo di etichetta. Macchie di fissativo come Nilo rosso e olio rosso O sono modi poco costosi, affidabili per misurare quantitativamente i livelli di lipidi e di osservare qualitativamente distribuzione dei lipidi attraverso tessuti, rispettivamente. Inoltre, queste macchie consentono per high throughput screening di vari geni del metabolismo di lipidi e percorsi. Inoltre, loro natura idrofobica facilita la solubilità dei lipidi, riduce l'interazione con i tessuti circostanti e previene la dissociazione in solvente. Anche se questi metodi sono efficaci ad esaminare il contenuto di lipidi in generale, non forniscono informazioni dettagliate circa la composizione chimica e la diversità dei giacimenti del lipido. Per questi scopi, metodi privo di etichetta come microscopia di GC-MS e automobili sono meglio adatto, le spese in deroga.

Introduction

I lipidi sono essenziali per la vita. Essi sono parti integranti delle membrane, fungono da messaggeri secondari e trasduttori del segnale e hanno funzioni cruciali in stoccaggio di energia. Quando il metabolismo dei lipidi è dysregulated, si porta a malattie come obesità e diabete di tipo II, che sono premendo di preoccupazioni di sanità pubblica⁹. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo modello eccellente per studiare il metabolismo dei lipidi perché ha un ciclo di vita relativamente breve, un corpo trasparente, un lignaggio di conosciuti delle cellule e un genoma sequenziato completamente. Principalmente un ermafrodito, c. elegans permette ai ricercatori di raccogliere grandi quantità di animali isogeni in breve periodi di tempo a carryout high throughput avanti schermi genetici per studiare una vasta gamma di geni e vie metaboliche⁴. Questo approccio ha rivelato un alto grado di conservazione in 273 c. elegans geni di metabolismo lipidico tra gli esseri umani, topi, ratti e della drosofila. Inoltre, oltre 300 geni del lipido in c. elegans hanno orthologues umana che sono associati con le malattie non correlate alla sindrome metabolica¹¹. Esame di immagazzinaggio del lipido in c. elegans ha per lo più tradizionalmente, tingere-contrassegnati saggi, che forniscono informazioni affidabili sull'accumulo di lipidi. Meno comune è una descrizione di dove localizzare i lipidi e le differenze misurate in abbondanza di lipidi attraverso tessuti. Tuttavia, recenti studi hanno rilevato che la distribuzione dei lipidi può essere importante come accumulo di lipidi⁶.

Ultimamente, gli studi hanno cominciato a integrare metodi come spettrometria liquida di cromatografia-Massachussets ad alte prestazioni (HPLC-MS), spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS), e anti-stokes coerente della microscopia Raman scattering (automobili) all'indirizzo del carenze di approcci basati su macchia analizzando direttamente il contenuto di estratti del lipido, frazioni specifiche del lipido e giacimenti del lipido, rispettivamente^10,11. Inoltre, microscopia di automobili ha rivelato che red Nilo può servire solo come un proxy per accumulo di grasso quando viene utilizzato come una fissativo della tintura, per il suo uso come una macchia vitale conduce alla macchiatura fuori bersaglio di auto-fluorescente organelli¹⁰. Tuttavia, le competenze tecniche necessarie e i costi associati con questi cromatografia e microscopia Metodi rendono loro uso insostenibile per molte domande di ricerca. In questo articolo, discutiamo un metodo conveniente e affidabile per fissarsi e macchia i depositi di lipidi neutri in c. elegans utilizzando Nilo rosso e olio rosso O per distinguere l'abbondanza del lipido in animali interi e in tessuti specifici.

Rosso del Nilo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, è un colorante benzophenoxazone che prontamente si dissolve in vari solventi organici, ma è praticamente insolubile in acqua. Si tratta di un eccellente lysochrome colorante utilizzato per macchiare lipidi neutri come trigliceridi o esteri del colesterolo perché è dotato di un colore forte, solubilizza bene in lipidi, ha trascurabile interazione con i tessuti circostanti ed è meno solubili in solvente rispetto a lipidi. Ha un'eccitazione e emissione massimi di 450-500 e 520 nm, rispettivamente¹. Quando il Nilo rosso-macchiato di c. elegans è visto per fluorescenza verde, corpi discreti del lipido possono essere osservati in tutto l'intestino e altri tessuti o in cluster o uniformemente dispersi, a seconda del genotipo dell'animale o il trattamento sperimentale ⁷.

Olio rosso O è un lysochrome, liposolubili colorante usato per macchiare i trigliceridi e lipoproteine. Si chiama un colorante azoico perché la sua struttura chimica contiene due gruppi azoici, collegati a tre anelli aromatici. È difficile ionizzare, che lo rende altamente solubili nei lipidi. La macchia di colore è rosso e il massimo di assorbimento della luce è 518 nm ³. C. elegans macchiato con olio rosso O Visualizza le goccioline del lipido rosso che si stagliano contro il corpo trasparente dell'animale, che facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi tra diversi tessuti⁶.

Protocol

1. Nilo rosso (NR) colorazione dei lipidi

1. Preparazione della soluzione di riserva di 5 mg/mL NR
   1. In una bottiglia da 500 mL, aggiungere 200 mL di acetone 100% 100 mg di polvere di NR.
   2. Coprire la bottiglia con foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
   3. Prima dell'uso, agitare la soluzione per 2 h al buio.
   4. Per uso a lungo termine, conservare la soluzione di riserva di NR in bottiglia ermeticamente senza qualsiasi esposizione alla luce. Soluzione di riserva di scala NR secondo esigenze di ricerca. Assicurarsi che la stessa soluzione di riserva è utilizzata attraverso esperimenti NR-macchiatura per ottenere la colorazione coerente e risultati di formazione immagine.
2. Preparazione della soluzione di lavoro di NR
   1. Per ogni 1 mL di isopropanolo 40% (v/v), aggiungere 6 µ l di soluzione madre NR.
   2. Preparare 600 µ l di soluzione di lavoro di NR per ciascun campione.
      Nota: Assicurarsi di fresco NR lavorando soluzione proprio prima della colorazione. A seconda delle esigenze di soluzione stock di NR, utilizzare un tubo conico graduata da 50 mL o 15 mL.
3. Preparazione di vermi per colorazione di NR del lipido
   1. Crescere vermi alla fase iniziale di L4 a 20 ° C il mezzo di sviluppo del nematode (NGM) seminato con tardo-registro OP50 Escherichia coli.
   2. Lavare i vermi fuori la piastra con 1 mL di soluzione tampone fosfato + 0,01% Triton X-100 (PBST) soluzione: 1x e mettere la sospensione di vite senza fine in una provetta da 1,5 mL microfuge.
   3. Centrifugare che i vermi a 560 x g per 1 min. rimuovere il surnatante e ripetere questo passaggio fino a e. coli è deselezionato dalla sospensione.
   4. Aggiungere 100 µ l di 40% isopropanolo al pellet di verme e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
   5. Centrifugare i vermi a 560 x g per 1 min e rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet di verme.
      Nota: Maggiori volumi di uso di PBST per lavare i vermi fuori le piastre se utilizzando piastre più grandi o più vermi per piastra di colorazione. Non lavare i vermi in PBST più di 15 min prima della fissazione del campione. Eseguire ulteriori lavaggi se il surnatante non viene cancellato dei batteri. Svolgere l'incubazione in 40% isopropanolo utilizzando un nutator o un rocker. Monitorare sempre i tubi per assicurarsi di agitazione di esempio completo è in corso.
4. Lipidica macchiatura con NR
   1. Nel buio, aggiungere 600 µ l di soluzione di lavoro di NR per ogni campione. Invertire i tubi tre volte e mescolare completamente i vermi in soluzione NR.
   2. Ruotare il campione al buio a temperatura ambiente per 2 h.
   3. Dopo l'incubazione, centrifugare i vermi a 560 x g per 1 min e rimuovere il surnatante.
   4. Aggiungere 600 µ l di PBST e incubare i campioni al buio per 30 minuti rimuovere macchie di NR in eccesso.
   5. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min e rimuovete tutti ma circa 50 µ l del surnatante.
      Nota: Incubazione NR non richiede agitazione. Sedimentazione di worms è comune durante questo passaggio.
5. Preparazione dei vetrini per formazione immagine del microscopio
   1. Risospendere il pellet di verme nel surnatante rimanenti.
   2. Posto 5 µ l di sospensione di vite senza fine su un vetrino da microscopio e messo un vetrino coprioggetto con attenzione per evitare di intrappolare bolle d'aria.
   3. Sigillare il coprioggetto con lo smalto prima dell'imaging di vermi.
   4. Preparare solo un paio di diapositive alla volta. In tal modo la formazione immagine NR rimane costante attraverso campioni. La qualità delle immagini NR-macchiato diminuisce dopo 6 h. discreti del lipido goccioline sono difficili da osservare e fluorescenza di fondo aumenta, che interferisce con il rilevamento del segnale NR.
6. Imaging di vermi NR-macchiato
   1. I vermi a ingrandimento 5x per catturare animali diversi per campo di vista dell'immagine.
   2. Passare a 10 ingrandimenti per migliore quantificazione delle singole viti senza fine.
   3. Utilizzare FITC/GFP canale immagine vermi NR-macchiato e provare tempi di esposizione differenti per determinare le condizioni ottimali per la quantificazione.
   4. Salvare i file in formato TIF per evitare di perdere dati a causa di compressione.
      Nota: Tempi di esposizione tipico variano da MS. 100-1000 avendo un tempo di esposizione ottimale, utilizzare per tutti i campioni per mantenere la coerenza di imaging.
7. Quantificazione di immagine colorazione NR
   1. Caricare micrografie ImageJ. Nel menu pull-down di plugin, è necessario utilizzare la funzione Bio-Formats se il file di immagine non viene riconosciuto.
   2. Nell'immagine dal menu a discesa, sotto la funzione di stack, utilizzare immagini-Stack per creare una serie di immagini quando micrografie diversi vengono confrontati.
   3. Nello stesso menu pull-down, regolare la luminosità/contrasto dello stack immagine e propagare le modifiche a tutte le immagini facendo clic su Applica.
   4. Utilizzare lo strumento di selezione poligono per delineare ogni verme imaged e utilizzare la funzione di misura sotto menu pull-down di analisi per quantificare l'intensità di fluorescenza emessa dal NR.
   5. Per ogni immagine, cinque siti di fondo di misurare e calcolare l'intensità di fluorescenza di fondo media.
   6. Sottrarre l'intensità di fluorescenza di fondo da ogni verme imaged utilizzando la formula N = G - (A x B), dove N sta per fluorescenza netto, G per fluorescenza lordo, A per area totale verme e B per fluorescenza di fondo medio.
   7. Per normalizzare l'intensità della fluorescenza di dimensione del verme, dividere il fluorescenza netto di ogni verme dalla sua superficie totale. I risultati sono riportati come intensità di fluorescenza, in unità arbitrarie (UA), al pixel.
      Nota: Evitare di esportare le immagini in formato JPEG. Mentre la compressione rende più gestibile per archiviare i file, l'integrità dei dati è compromessa da questo formato. Assicurarsi che tutte le immagini sono per volta e analizzate in modo identico. Ricordati di includere una barra di scala per valutare adeguatamente formato a diversi ingrandimenti. Per visualizzare meglio le differenze nell'intensità di fluorescenza usando ImageJ, cambiare il tipo di immagine da RGB a 8 bit e selezionare fuoco dal menu immagine ricerca tabelle (LUT). Questo crea un'immagine di mappa di calore nel quale colore aumentata luminosità correla con l'intensità di fluorescenza maggiore.

2. olio rosso O macchiatura (ORO) dei lipidi

1. Preparazione della soluzione di riserva ORO
   1. In una bottiglia da 250 mL, aggiungere 500 mg di polvere di ORO a 100 mL di isopropanolo 100% e mescolare bene.
   2. Una volta preparato, conservare la soluzione ermeticamente chiuso con nessuna esposizione alla luce.
2. Preparazione della soluzione di lavoro di ORO
   1. Diluire la soluzione di riserva di ORO in acqua (3:2) al 60% di isopropanolo.
   2. Prima dell'uso, è possibile filtrare la soluzione di ORO di lavoro attraverso un filtro da 0,2 µm in acetato di cellulosa siringa sterile.
      Nota: Per una migliore qualità di soluzione, preparare la soluzione di lavoro ORO il giorno prima e lasciarlo mescolare durante la notte. Tuttavia, se la soluzione è necessario lo stesso giorno, diluire e mescolare la soluzione ORO su un rocker per almeno 2 h prima dell'uso. Prima a dondolo, avvolgere tubo conico in nastro di paraffina per evitare la fuoriuscita della soluzione ORO.
3. Preparazione di vermi per colorazione di ORO del lipido
   1. Crescere i vermi a 20 ° C il mezzo di sviluppo del nematode (NGM) seminato con tardo-registro OP50 Escherichia coli alla fase di vita desiderato.
   2. Aggiungere 1 mL di soluzione PBST alla piastra e agitare fino a quando tutti i vermi sono fuori la piastra. Inclinare la piastra e lavare con 1 mL di PBST. Trasferire la sospensione di vite senza fine in una provetta di microfuge 1,5 mL.
   3. Centrifugare che i vermi a 560 x g per 1 min. eliminare il surnatante senza disturbare il pellet e ripetere il lavaggio passo con 1 mL di PBST tre volte. Rimuovere tutti i supernatanti ma 100 µ l.
   4. Aggiungere 600 µ l di 40% isopropanolo al pellet di verme e rock a temperatura ambiente per 3 min.
   5. Centrifugare i vermi a 560 x g per 30 s e Rimuovi tutto surnatante ma 100 µ l senza interrompere il pellet di verme.
      Nota: Utilizzare volumi più elevati di PBST per lavare i vermi fuori piastre se facendo macchiatura di alto-rendimento. Non lavare vermi in PBST più di 15 min prima della fissazione del campione. Fare ulteriori lavaggi se surnatante non viene cancellato dei batteri. Svolgere con incubazione in 40% isopropanolo utilizzando un nutator o un rocker. Monitorare sempre i tubi per assicurarsi di agitazione di esempio completo è in corso.
4. Lipidica macchiatura con ORO
   1. Aggiungere 600 µ l ORO lavoro soluzione a ciascun campione. Capovolgere la provetta tre volte e mescolare i vermi bene in ORO.
   2. Ruotare i campioni a 30 rpm per 2 ore a temperatura ambiente.
   3. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min ed eliminare tutti i supernatanti ma 100 µ l.
   4. Risospendere i campioni in 600 µ l di PBST e ruotare i tubi a 30 rpm per 30 min rimuovere macchie di ORO in eccesso.
   5. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min ed eliminare tutti, ma 50 µ l del surnatante.
   6. Per distinguere meglio la posizione di germline cellule intestinali e dell'animale, macchia i nuclei aggiungendo 1 µ l di (2-(4-amidinophenyl) - 1H-indole-6-detto) (DAPI) per ogni 1 mL di soluzione di lavoro di ORO. Eseguire colorazione ORO per 2 h con l'aggiunta di DAPI prima del montaggio diapositive per imaging. I nuclei intestinali sono di dimensioni maggiori e la gonade si distingue per le cellule germinali in via di sviluppo.
      Nota: Dopo ORO macchiatura, vermi possono aderire ai lati del tubo microfuge e non riescono a formare una pallina evidente. Se questo accade, centrifugare nuovamente i vermi o consentire vermi depositarsi per gravità per almeno 10 min.
5. Preparazione delle diapositive per worm imaging
   1. Risospendere i vermi nel surnatante rimanente e mescolare bene la soluzione.
   2. Mettere 5 µ l di sospensione di vite senza fine su un vetrino da microscopio e porre un coprivetrino attentamente, assicurando che nessun aria formano delle bolle.
   3. Sigillare il coprioggetto con smalto e vermi di immagine.
      Nota: Dopo la fissazione e colorazione, vermi possono essere molto rigidi e difficili da dispensare. Per aggirare questo problema, rendere wide-bore pipette, tagliando loro suggerimenti.
   4. Conservare i vetrini in un rack di micro-centrifuga a 4 ° C fino a 24 ore se non imaging immediatamente dopo la colorazione.
6. Imaging di vermi ORO-macchiato
   1. Utilizzare una fotocamera in grado colore alle viti senza fine ORO tinto di immagine.
   2. Utilizzare ingrandimento 5x per diversi worm in un campo di vista di immagine.
   3. Passare a ingrandimento 10x per una migliore analisi delle singole viti senza fine.
   4. Esportare le immagini in formato TIF per evitare perdita di dati dovuta alla compressione.
      Nota: Se la macchiatura con ORO + DAPI, accendere la fotocamera in grado colore a uno che può catturare la fluorescenza.
7. Analisi di immagini di worms ORO-macchiato
   1. Caricare micrograph(s) ImageJ. Nel menu pull-down di plugin, è necessario utilizzare la funzione Bio-Formats se il file di immagine non viene riconosciuto.
   2. Nell'immagine dal menu a discesa, sotto la funzione di stack, utilizzare immagini-Stack per creare una serie di immagini quando micrografie diversi vengono confrontati.
   3. Regolare la luminosità/contrasto sotto menu pull-down stesso per migliorare la visibilità di goccioline lipidiche.
   4. Classificare le immagini secondo l'accumulazione del lipido in tutto il corpo dell'animale o in tessuti specifici.
   5. Migliore valutazione della localizzazione del lipido e per l'identificazione di artefatti dell'immagine non specifici usando ImageJ, selezionare la funzione di colore sotto menu pull-down di immagine e fare clic su Stack in RGB per mostrare i segnali di ogni componente RGB.

Results

SKN-1 è un bZip, fattore di trascrizione di cytoprotective che condivide omologia con mammiferi NRF2 ed è stato indicato per mediare l'ossidazione degli acidi grassi. A seconda della concentrazione di glucosio nella loro dieta, worm con un allele costitutivamente attivato skn-1 mostrano livelli di lipidi differenti quando macchiato con Nilo rosso⁷. Figura 1A -C Mostra attivato skn-1 gli animali espost...

Discussion

L'aumento dell'obesità e tassi di malattia metabolica rende c. elegans un modello adatto per studiare i meccanismi che regolano l'accumulo di grasso nelle cellule e tessuti. La prova recente suggerisce che i cambiamenti nei livelli di lipidi sono correlati con i processi cellulari che vanno da⁸, l'attivazione di recettori dell'ormone², a capacità riproduttiva⁵di segnalazione dell'insulina. Rispetto ai metodi di cromatografia, Nilo rosso e ol...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscopio	Zeiss	n/a	Microscopio a fluorescenza
Fotocamera ERC5s	Axiocam	n/a
Fotocamera MRm	Axiocam	n/a	Rosso
Nilo	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Oil rosso O	Alfa Aesar	A12989	Lipid Stain
DAPI	Thermo Fisher	D1306	Colorazione DNA
Alcool isopropilico	BDH	BDH1133-1LP	Soluzione fissativa
0,2 &; m seterile filtro per siringa	VWR	28145-477	Filtro in acetato di cellulosa
Centrifuga 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuga
Agitatore Girarrosto	da laboratorio Quake	400110Q
Agitatore Rotatore per tubi	VWR	10136-084	Rotatore
K2HPO4	Sigma-Aldrich	7758-11-4	NGM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	7778-77-0	NGM
MgSO4	Alfa Aesar	7786-30-3	NGM
CaCl2	Sigma-Aldrich	10035-04-8	NGM
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NGM
Colesterolo	Sigma-Aldrich	57-88-5	NGM
Peptone	BD Biosciences	211677	NGM
Agar	Teknova	L9110	NGM
LB media	Sigma-Aldrich	L3147	Crescita batterica