Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l'ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.
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Articolo metodologico
Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Colture di cellule dentritiche monocito-derivate (moDC) generate dal midollo osseo di topo usando fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) recentemente sono stati riconosciuti per essere più eterogeneo quanto precedentemente apprezzato. Queste culture contengono ordinariamente moDC pure monocito-derivate macrofagi (moMac) e anche alcune cellule meno sviluppate come monociti. L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo coerente per l'identificazione e la separazione tra i molti tipi di cellule presenti in queste culture come si sviluppano, in modo che loro specifiche funzioni possono essere ulteriormente approfonditi. L'ordinamento strategia presentata qui separa cellule in primo luogo in quattro popolazioni basati sull'espressione di Ly6C e CD115, entrambi i quali sono espressi transitoriamente dalle cellule come si sviluppano nella cultura di GM-CSF-guidato. Questi quattro popolazioni includono comuni dei progenitori mieloidi o CMP (Ly6C-, CD115-), dei progenitori del granulocita/macrofago o GMP (Ly6C +, CD115-), monociti (Ly6C +, CD115 +) e macrofagi monocito-derivati o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c viene aggiunto anche alla strategia di ordinamento per distinguere due popolazioni entro il Ly6C-, CD115-popolazione: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Infine, due popolazioni possono essere ulteriormente distinto all'interno del Ly6C-, CD115 + popolazione sulla base del livello di espressione II MHC di classe. MoMacs esprimere livelli più bassi di MHC di classe II, mentre un precursore di DC monocito-derivate (moDP) esprime maggiore MHC di classe II. Questo metodo consente l'isolamento affidabile delle diverse popolazioni inerente allo sviluppo distinte nei numeri sufficiente per una varietà di analisi funzionale e sviluppo. Evidenziamo una tale lettura funzionale, le risposte differenziali di questi tipi di cellule alla stimolazione con Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).
Introduzione
Coltura delle cellule del midollo osseo murino con la citochina fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) è ampiamente usato come un metodo per generare cellule dentritiche monocito-derivate (moDC; anche conosciuto come infiammatorie DC) in gran numero 1, 2,3,4,5. Queste cellule sono stati estremamente utili in una varietà di studi di cellule dendritiche (DC) funzione 6,7,8. In genere, qu....
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Protocollo
Tutto il lavoro animale è stato approvato dal comitato di uso e Auburn University istituzionale Animal Care in conformità con le raccomandazioni descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health.
1. preparazione per la raccolta del midollo osseo
- Preparare il supporto completo di 250 mL aggiungendo una soluzione di medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% siero fetale del vitello, la glutamina 2mm e 50 µM 2-mercaptoetanolo alla parte superiore di un'unità di boccetta di 0,22 µm filtro del vuoto e applicare il vuoto.
Nota: Terreno completo poss....
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Risultati
Nel tentativo di mantenere il numero di canali disponibili per l'analisi come possibile, celle possibili sono stati selezionati ordinariamente basato su dispersione avanti e laterali, escluse eventi molto piccoli e molto granulari (un tipico cancello viene applicato a tutti il punto appezzamenti in Figura 1A). Per determinare se questa strategia di gating escluso in modo affidabile le cellule morte, abbiamo macchiato con 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (
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Discussione
Questo protocollo facilita l'isolamento di tipi GM-CSF-driven progenitore e precursore delle cellule in numero sufficiente per diversi tipi di analisi tra cui analisi biochimiche, analisi di funzione cellulare in vitroo in vivodi instillazione. Questo metodo rappresenta un significativo passo avanti nel campo dello sviluppo delle cellule dendritiche monocito-derivate, consentendo l'affidabile isolamento e identificazione di cellule presto in questa via di sviluppo, come pure quei tipi di cellula differe.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun conflitto di divulgare.
Ringraziamenti
Siamo grati per l'assistenza tecnica da Alison Chiesa uccello alla Auburn University scuola di medicina veterinaria flusso Cytometry Facility, per finanziamenti dal NIH per EHS R15 R15 AI107773 e per il cellulare e il programma di biologia molecolare all'Università di Auburn di estate finanziamento della ricerca di PBR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | HyClone | SV30014.04 | per integrare il terreno completo e FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | per integrare il terreno completo |
| 2-mercaptoetanolo (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | per integrare il terreno completo |
| Filtro sottovuoto da 75 mM | Thermo Scientific | 156-4045 | per sterilizzare terreni completi |
| ACK Lisi Buffer | Lonza | 10-548E | per lisare i globuli rossi |
| HBSS tampone | Corning | 21-020-CM | per salvare i leucociti dopo la lisi dei globuli rossi |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), | Lonza | 17-512F | deve essere privo di endotossine; refrigerato a 4 ° C |
| 35 µ m Filtro cellulare | Falcon | 352235 | rompere i grumi prima di passare attraverso il citometro. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | concentrazione utilizzabile di 10 ng/mL |
| Piastra trattata con coltura tissutale | VWR | 10062-896 | per cellule di midollo osseo dopo il raccolto |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | per differenziare CMP e MoDC |
| Citometro a flusso MoFlo XPD | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% etanolo | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Tubo conico | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Topi | Il laboratorio Jackson | 000664 | Femmina; 10-20 settimane di età |
| biosicurezza | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| Siringa da 10 ml | BD Biosciences | 301604 | |
| ago da 23 G | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuga 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Versione 10 | flowjo.com |
Riferimenti
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al.
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Ristampe e permessi
