L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

Sommario

L'epicardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo e nella riparazione del cuore fornendo le cellule e fattori di crescita per la parete del miocardio. Qui, descriviamo un metodo alle cellule dell'epicardio primarie umane di cultura che consente lo studio e il confronto delle loro caratteristiche inerenti allo sviluppo e adulti.

Abstract

L'epicardio, uno strato di cellule epiteliali che copre il miocardio, ha un ruolo essenziale durante sviluppo cardiaco e la risposta di riparazione del cuore dopo lesione ischemica. Quando attivato, le cellule dell'epicardio subiscono un processo noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) per fornire le cellule del miocardio. Inoltre, l'epicardio contribuisce via la secrezione di fattori paracrini essenziale. Per apprezzare appieno il potenziale rigenerativo dell'epicardio, è necessario un modello di cellula umana. Qui abbiamo delineare un modello di coltura cellulare romanzo per derivare cellule derivate dell'epicardio primarie (EPDCs) da tessuto cardiaco umano adulto e fetale. Per isolare EPDCs, l'epicardio è dissecato dall'esterno dell'esemplare cuore e trasformato in una sospensione unicellulare. Successivamente, EPDCs sono placcati e coltivate in medium EPDC contenente l'inibitore della 5-chinasi ALK SB431542 per mantenere il loro fenotipo epiteliale. EMT è indotta dalla stimolazione con TGFβ. Questo metodo consente, per la prima volta, lo studio del processo di EMT dell'epicardio umano in un ambiente controllato e agevola guadagnando più comprensione nel secretoma di EPDCs che può aiutare la rigenerazione del cuore. Inoltre, questo approccio uniforme consente un confronto diretto del comportamento umano adulto e fetale dell'epicardio.

Introduzione

L'epicardio, uno strato epiteliale unicellulare che buste il cuore, è di vitale importanza per lo sviluppo cardiaco e riparazione (rivisto in Smits et al. ¹). inerente allo sviluppo, l'epicardio nasce dall'organo proepicardial, una piccola struttura situata alla base del cuore in via di sviluppo. Intorno giorno dello sviluppo E9.5 in mouse e post-concezione 4 settimane in umani, cellule iniziano a migrare da questa struttura di cavolfiore e coprire il miocardio in via di sviluppo². Una volta che si forma uno strato di singola cellula epiteliale, una parte delle cellule dell'epicardio subisce epiteliale di transizione mesenchimale (EMT). Durante EMT, le cellule perdono le loro caratteristiche epiteliali, quali adesioni cellula-cellula e ottenere un fenotipo mesenchimale che dà loro la capacità di migrare nel miocardio in via di sviluppo. Le cellule derivate dell'epicardio formate (EPDCs) possono differenziarsi in diversi tipi di cellule cardiache tra cui fibroblasti, cellule muscolari lisce e potenzialmente cardiomiociti e cellule endoteliali³, anche se la differenziazione di questi ultimi due cellulari resti di popolazioni oggetto di dibattito (rivisto in Smits et al. ⁴). Inoltre, l'epicardio fornisce segnali paracrini istruttivo al miocardio a regolare la crescita e la vascolarizzazione^5,6,7,8. Diversi studi hanno dimostrato che alterata formazione dell'epicardio conduce ai difetti inerenti allo sviluppo in muscolo cardiaco^9,10, sistema vascolare¹¹e conduzione sistema¹², sottolineando l'essenziale contributo dell'epicardio per la formazione del cuore.

Anche se nel cuore adulto epicardio è presente come uno strato dormiente, esso diventa riattivato su ischemia¹³. Alberino-ferita di riattivazione dell'epicardio ricapitola molti dei processi descritti per sviluppo cardiaco, tra cui proliferazione ed EMT¹⁴, seppur meno efficientemente. È interessante notare che, sebbene l'esatto meccanismo completamente non è capito, il contributo dell'epicardio di riparazione può essere migliorato dal trattamento con, per esempio, Thymosin β4¹⁵ o modifica mRNA di VEGF-A¹⁶, con conseguente migliorato cardiaco funzione dopo infarto miocardico. L'epicardio è quindi considerato un'interessante fonte di cellule per migliorare la riparazione endogena del cuore ferito.

Meccanismi di sviluppo cardiaco sono spesso ricapitolate durante la lesione, anche se in modo meno efficiente. In cerca di attivatori dell'epicardio, è fondamentale che possiamo determinare e confrontare l'intera capacità dell'epicardio feto ed adulto. Inoltre, da un punto di vista terapeutico, è importante che, oltre a esperimenti sugli animali, estendiamo conoscenza per quanto riguarda la risposta dell'epicardio umano. Qui, descriviamo un metodo per isolare e adulte e fetale dell'epicardio derivate cellule umane (EPDCs) in una morfologia epiteliale-cell-like della coltura e di indurre EMT. Con questo modello, ci proponiamo di esplorare e confrontare il comportamento delle cellule dell'epicardio adulto e fetale.

Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di materiale umano dell'epicardio, che non è stato studiato accuratamente. D'importanza, il protocollo di coltura delle cellule e isolamento descritto fornisce un singolo metodo uniforme per derivare entrambi EPDCs di cobble fetali ed adulti, consentendo un confronto diretto tra queste fonti di due cellule. Inoltre, poiché l'epicardio è isolato basato sulla sua posizione, è accertato che le cellule sono in realtà epicardially derivata¹⁷.

Mentre metodi di isolamento EPDC umani sono state stabilite in precedenza, queste si basano principalmente su protocolli di conseguenza dove pezzi di tessuto cardiaco o dell'epicardio sono piastrate su un cellulare cultura piatto^18,19. Questo approccio quindi seleziona specificamente per le cellule che perdere parzialmente il loro fenotipo epiteliale al fine di migrare, e che sono più inclini a subire EMT spontanea. Nel protocollo attuale, l'epicardio è prima trasformato in una soluzione di singola cellula che permette il EPDCs isolato per preservarne lo stato epiteliale. Questo metodo fornisce quindi un modello solido in vitro per lo studio dell'epicardio EMT.

Protocollo

Tutti gli esperimenti con campioni di tessuto umano sono stati approvati dal comitato etico del Leiden University Medical Center e conforme alla dichiarazione di Helsinki. Tutti i passaggi sono eseguiti con attrezzature sterili in un flusso di cultura cellulare mobile.

1. preparati

1. Preparare il supporto di EPDC mescolando di Dulbecco esente modificato Eagle (DMEM basso-glucosio) e Medium 199 (M199) in un rapporto 1:1. Aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS, calore inattivati per 25 min a 56 ° C) e completare con 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina. Pre-riscaldare il mezzo EPDC in bagnomaria a 37 ° C.
2. Preriscaldare la tripsina 0.25%/EDTA (1:1) a bagnomaria a 37 ° C.
3. Pozzi di cappotto con gelatina. Aggiungere 0,1% gelatina/PBS in ciascun pozzetto e incubare le piastre per almeno 15 min a 37 ° C. Linee guida per la piastra di coltura cellulare richiesto sono riassunti nella tabella 1. Rimuovere con attenzione tutto il liquido prima di placcatura di cellule.
4. Preparare una soluzione stock di 10 mM SB431542 (SB), diluita in DMSO (attenzione). Rendere le aliquote di 50 µ l in provette in polipropilene fondo conico, come provette Eppendorf e conservarli a-20 ° C. Si noti che le aliquote SB possono essere scongelate solo una volta.

2. recupero e conservazione degli esemplari adulti e fetale cuore

1. Memorizzare i auricles umano adulto direttamente alla rimozione durante l'intervento chirurgico in un tubo da 50 mL con 15 mL alto-glucosio DMEM contenente 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. I campioni sono generalmente 3-5 cm nel formato e possono essere memorizzati fino a 48 h dopo la dissezione.
2. Conservare il cuore fetale ottenuto da materiale di aborto elettivo in mezzo EPDC a 4 ° C fino a 24 h dopo l'isolamento. Per questo protocollo, è possibile utilizzare campioni con un'età gestazionale tra 12-22 settimane. Notare che tutto il cuore può essere utilizzato per l'isolamento dell'epicardio.

3. isolamento dello strato dell'epicardio

1. Nel flusso laminare, preparare un piatto di coltura cellulare di 100 mm con PBS e posizionare una goccia separata (~ 200 µ l) di PBS nel coperchio. Riempire una provetta da 15 mL con 5 mL di terreno pre-riscaldato di EPDC.
2. Posizionare il tessuto in coltura cellulare piatto pieno di PBS. Assicurarsi che il tessuto è inumidito frequentemente durante la procedura.
3. Utilizzando un microscopio stereoscopico, rimuovere tanto dello strato dell'epicardio dal campione di tessuto possibile staccando di usando il forcipe.
   Nota: L'epicardio può essere riconosciuto come uno strato molto sottile, trasparente aderito strettamente all'esterno del cuore (Figura 1A). Se si tenta di evitare la contaminazione con tessuto adiposo epicardico e vasi sanguigni poiché questo ostacolerà l'isolamento.
4. Raccogliere i pezzi di tessuto dell'epicardio nella goccia di PBS sul coperchio.
5. Tagliare il tessuto dell'epicardio in piccoli pezzi (0,5 mm³) usando un bisturi (Figura 1B), oppure usando le punte taglienti di piccola pinzetta. Si noti che i pezzi devono essere in grado di passare un P1, puntale 000 (punto 3.6).
6. Aggiungere 1 mL di tripsina al tessuto dell'epicardio e raccogliere i pezzi e la tripsina con una P1, 000 puntale. Trasferire il tessuto in una provetta conica per centrifuga da 1,5 mL (Figura 1).
7. Incubare la provetta nel bagnomaria a 37 ° C per 10 minuti, agitando a ~ 60 giri/min.
8. Rimuovere il tubo dal bagno di acqua e pulire la parte esterna del tubo con etanolo al 70%.
9. Consentire al tessuto di depositarsi sul fondo del tubo (Figura 1) e trasferire con cautela il supernatante contenente cellule dell'epicardio nella provetta di 15 mL contenente 5 mL di terreno di EPDC per inattivare la tripsina.
10. Ricostituire il tessuto restante nella provetta conica per centrifuga con tripsina 1 mL e Miscelare pipettando delicatamente su e giù.
11. Ripetere il passaggio 3,7 a 3.10 due volte. Nella fase finale, dopo un totale di 30 min di incubazione di tripsina, trasferire il surnatante e il tessuto restante dell'epicardio nella provetta contenente il mezzo EPDC.
12. Quando tutte le celle sono raccolti in media EPDC, delicatamente passare la sospensione attraverso una siringa da 10 mL con un ago di calibro 19 in una provetta da 15 mL nuova meccanicamente dissociare le cellule (Figura 1E).
    Nota: Assicurarsi di omogeneizzare la sospensione pipettando su e giù prima di passare la soluzione attraverso l'ago per evitare che l'ago sempre ostruito.
13. Per dissociare ulteriormente le cellule, ripetere il passaggio 3.12 con un ago da 21 gauge.
14. Posizionare un colino di cella da 100 µm in cima a un tubo da 50 mL e trasferire il supporto che contiene le cellule dell'epicardio sul filtro utilizzando una pipetta di 10 mL per rimuovere tutti i restanti gruppi (Figura 1F).
15. Lavare il filtro per raccogliere le cellule residue di pipettare 5 mL di terreno di EPDC sul filtro.
16. Dispensare la sospensione cellulare dal tubo da 50 mL in una provetta da 15 mL. Poiché cellule depositano sul fondo della provetta, agitare delicatamente la soluzione prima di pipettaggio.
    Nota: Mentre questo passaggio non è necessario, un tubo più piccolo aiuta la visualizzazione del pellet dopo la centrifugazione.
17. Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (Figura 1).
18. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare (Figura 1 H) nel volume richiesto di mezzo EPDC (tabella 1).
    Nota: Per EPDCs fetale, direttamente usare EPDC mezzo contenente 10 µM dell'inibitore della chinasi ALK5 (EPDC + SB). Le cellule adulte possono essere placcate senza SB durante il primo passaggio.
19. Piastra di sospensione cellulare su piastre di coltura la gelatina rivestito (Figura 1I). Le dimensioni del pozzo dipende dalle dimensioni del campione del tessuto dell'epicardio (tabella 1). Nota che il confluency di bassa indurrà l'avvenimento di EMT.
20. Posizionare le cellule nell'incubatore per almeno 48 h a 37 ° C, 5% CO₂ per permettere alle cellule di fissare la piastra di coltura.

4. la cultura di EPDCs

1. Ricostituire il mezzo EPDC + SB almeno ogni 3 giorni.
2. Ispezionare le cellule almeno ogni 3 giorni con il microscopio. Quando le cellule raggiungono confluency, vale a dire, quando la piastra di coltura è completamente ricoperta di cellule, le cellule in un rapporto di superficie di 1:2 del passaggio. Si noti che arrivano fino a confluenza può prendere ~ 5-10 giorni.
   1. Aspirare il mezzo utilizzando una pipetta o un sistema di aspirazione con, per esempio, una pipetta di vetro.
   2. Lavare accuratamente le cellule aggiungendo PBS alle cellule. Delicatamente la piastra di turbinio e aspirare il PBS.
   3. Aggiungere tripsina alla piastra. Ruotare delicatamente la piastra per coprire tutte le cellule con tripsina e incubare la piastra per 1 min a 37 ° C.
      Nota: Utilizzare come tripsina piccolo come possibile (indicazione: 200 µ l di un 6 piastra bene)
   4. Toccare la piastra per scollegare meccanicamente le cellule dalla parte inferiore della piastra. Utilizzare il microscopio per controllare visivamente se cellule staccato. In caso contrario, incubare la piastra di coltura cellulare per un minuto in più.
   5. Aggiungere il volume richiesto di mezzo EPDC + SB alle cellule, risospendere pipettando su e giù e trasferire la sospensione cellulare per una nuova piastra di coltura di gelatina rivestito.
      Nota: In generale, le cellule possono essere mantenute in una morfologia di ciottoli fino al passaggio 8.

5. l'induzione di EMT in EPDCs

1. Per indurre EMT, dissociare le cellule con tripsina e trasferimento alle cellule di nuova gelatina rivestito pozzi in un rapporto di superficie di 1:2 in mezzo EPDC + SB, come descritto in 4 e incubare per almeno 24 h a 37 ° C, 5% CO₂.
2. Verificare se confluenza è 50-70% e se EPDCs hanno una morfologia di ciottoli.
   Nota: Confluency riguarda la capacità di EPDCs di subire EMT.
3. Aspirare il mezzo dalle cellule e lavare le cellule con attenzione con PBS (Vedi punto 4.2.1 - 4.2.2).
4. Stimolare le cellule con 1 ng/mL TGFβ3 in mezzo EPDC e metterli in un incubatore a 37 ° C, 5% CO₂ per 5 giorni. Si noti che durante la stimolazione, il supporto di EPDC contenente TGFβ3 non deve essere rifornito.
5. Monitorare quotidianamente le cellule. Dopo 5 giorni, le cellule che hanno subito la EMT sono riconosciute da una morfologia fusiforme (Figura 2A).
6. Cultura EPDCs fusiformi secondo il metodo designate in 4 senza aggiunta di SB o TGFβ al medium EPDC. Si noti che in generale, EPDCs fusiformi possono essere coltivate fino a passaggio 20.
7. Convalidare l'avvenimento di EMT con macchiatura immunofluorescente usando gli anticorpi contro i marcatori mesenchymal αSMA o il Vimentin o da falloidina per rilevare la formazione di fibre di stress di F-actina (Figura 2B), o mediante qRT-PCR per geni correlati all'EMT ( ad esempio, WT1, Periostina, Col1A1, αSMA, N-caderina, MMP3, lumaca, lumaca) (Figura 2 e tabella 2).

Risultati

Qui, descriviamo un protocollo semplice per isolare EPDCs da tessuto cardiaco umano adulto e fetale (Figura 1). Questo protocollo sfrutta la posizione facilmente raggiungibile dell'epicardio sulla parte esterna del cuore (Figura 1A). Macchiatura del auricle cuore dopo dissezione dimostra che l'epicardio WT1 + viene rimosso mentre il sottostante subepicardial matrice extracellulare e tessuto miocardico rimangono intatti (

Discussione

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e cultura primaria dell'epicardio cellule derivata da cuori umani adulti e fetali. Ampia caratterizzazione di queste cellule è stato precedentemente pubblicato il¹⁷. Abbiamo dimostrato che entrambi i tipi cellulari possono essere mantenuti come cellule epiteliali di ciottoli-come una volta coltivate con l'inibitore della chinasi di ALK5 SB431542. EMT è parte integrante di attivazione dell'epicardio in vivo durante sia lo sviluppo e la ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Siero fetale bovino	Gibco	10270-106
Tripsina 0,25%	Invitrogen	25200-056
Penicillina G sale sodico	Roth	HP48
Solfato di streptomicina	Roth	HP66
Tripsina 1:250 da pancreas bovino	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatina da pelle suina	Sigma-Aldrich	G1890
Piastre di coltura a 6 pozzetti	Greiner bio-one	657160
Piastre di coltura a 12 pozzetti	Corning	3512
Piastre di coltura a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µ L Puntali per pipette filtrati	Corning	4809
Pipetta da 10 ml	Greiner bio-one	607180
Pipetta da 5 ml	Greiner bio-one	606180
Piatto per colture cellulari 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	fatte in casa e sterilizzate
1,5 mL	Eppendorf
Provette da centrifuga da 15 ml	Greiner bio-one	188271
Provette da centrifuga da 50 ml	Siringa Greiner bio-one	227261
10 mL	Becton Dickinson	305959
aghi 19 gauge	Becton Dickinson	301700
aghi 21 gauge	Becton Dickinson	304432
Setacci per celle EASYstrainer, 100 & micro; m	Greiner bio-one	542000
TGFβ 3	R& D systems	243-B3
Monoclonale Anti-Actina, &alfa;-Muscolo liscio	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Falloidina	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Pipet P1.000	Gilson	F123602
Controller per pipette	Integra	155 015
Stereomicroscopio	Leica	M80
Microscopio a luce invertita	Centrifuga Olympus	CK2
Eppendorf		5702
Waterbath	GFL	1083

O provette Eppendorf 0030120086