Base di un semplice flusso Cytometry Assay per determinare In Vitro dell'anticorpo dipendente valorizzazione del Virus di febbre rompiossa utilizzando siero convalescente Zika Virus

Sommario

Descriviamo un protocollo semplice e facile per misurare il miglioramento dipendente dell'anticorpo dell'infezione di siero convalescente di Zika virus utilizzando le particelle virali di Reporter di virus della Dengue.

Abstract

Il potenziamento dipendente dell'anticorpo dell'infezione ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella patogenesi virale Dengue. Tradizionale analisi che misurano la capacità di anticorpi o siero per migliorare infezione nelle linee cellulari impermissible hanno fatto affidamento sull'utilizzo uscita virale nei media seguiti da saggi di placca per quantificare l'infezione. Più recentemente, queste analisi hanno esaminato l'infezione di febbre rompiossa virus (DENV) nelle linee cellulari usando gli anticorpi fluorescente contrassegnati. Entrambi questi approcci presentano limitazioni che limitano l'uso molto diffuso di queste tecniche. Qui, descriviamo un'analisi semplice in vitro usando Dengue virus reporter particelle virali (RVP) che esprimono la proteina fluorescente verde e le cellule K562 per esaminare potenziamento dipendente dell'anticorpo (ADE) dell'infezione di DENV usando il siero che è stato ottenuto da rhesus macachi 16 settimane dopo l'infezione con il virus di Zika (ZIKV). Questa tecnica è affidabile, comporta la minima manipolazione delle cellule, non implicano l'uso di virus competente replica dal vivo e può essere eseguita in un formato di throughput elevato per ottenere una lettura quantitativa mediante citometria a flusso. Inoltre, questo test può essere facilmente adattato per esaminare aumento dipendente dell'anticorpo (ADE) di altre infezioni da flavivirus come il virus della febbre gialla (YFV), virus dell'encefalite equina giapponese (JEEV), virus del Nilo occidentale (WNV) ecc dove RVP sono disponibili. La facilità di configurazione di test, analisi dei dati e interpretazione dei risultati rende altamente favorevole alla maggior parte delle impostazioni di laboratorio.

Introduzione

Anticorpo dipendente miglioramento (ADE) dell'infezione è un processo per cui le risposte parzialmente traversa-reattivo anticorpo indotte da un sierotipo del virus migliora l'assorbimento di un altro sierotipo del virus, che conduce la viremia e replicazione virale aumentata. ADE è stato ampiamente documentato nelle infezioni di Dengue virus (DENV) dove quattro principali sierotipi sono prevalenti. In un sottogruppo di pazienti, ADE è associata con febbre emorragica Dengue (DHF). Abbiamo recentemente dimostrato che l'infezione del virus (ZIKV) di Zika indotto significativamente elevati livelli di risposte di anticorpi cross-reattivi DENV causato ADE di DENV in vi....

Protocollo

I campioni di siero utilizzati per illustrare il protocollo descritto qui sono stati ottenuti da macaques del reso che erano alloggiate e curate secondo locale, statale e federale politiche in un'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care Internazionale (AAALAC)-accreditato facility. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali e i campioni sono stati acquisiti attraverso un protocollo di condivisione di tessuto.

1. giorno 1

Nota: Eseguire tutti i passaggi descritti di seguito in una flusso laminare ste....

Risultati

I sieri da 4 rhesus macaques erano raccolti a 16 settimane dopo l'infezione con ZIKV e testato per il loro potenziale migliorare DENV-1, 2, 3 e 4 infezione in cellule K562. Gli animali hanno avuti viremia di picco di ~ 1 x 10⁵ copie di ZIKV RNA/mL di plasma dal giorno 3 dopo infezione che è sceso a livelli che erano sotto il limite di rilevazione di 7 giorni dopo l'infezione. No la viremia è stata rilevata nel plasma post-all'infezione 16 settimane. L'analisi RVP è stata esegui.......

Discussione

Flavivirus come DENV e ZIKV condividere testimonianze significative di omologia in entrambe le loro proteine strutturali e non strutturali che generano gli anticorpi che cross-reagiscono con a vicenda^13,14. Queste risposte di anticorpi cross-reattivi sono state indicate per migliorare di infezione sia in vivo che in vitro con un sierotipo eterologo o altro relativi flavivirus^1,2. Il pote.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DENV 1-4 RVP	Cellule molecolari integrali	RVP-501
K562	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillina-Streptomicina	MP biomedicals	1670049	100 UI Pen/mL, 100 ug Strepto/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in soluzione di aminoacidi non essenziali RPMI-10
MEM (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Piruvato di Sodio	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutammina	Fisher Scientific	MT25005CI
Piastre sterili con fondo a V	Thomas	Scientific 333-8001-01V
BD Falcon Polipropilene Provette FACS da 5 ml	VWR	60819-728
Piastre con fondo a U non sterili	Falcon	Ref 353910	Un'alternativa ad alta produttività alle provette FACS
da 5 mL, sterile, pipetta sierologica	Denville
200uL	Puntali	P3020 CPS
20uL Pipetta multicanale	Denville	P1121
50-200uL Pipetta multicanale	Denville	P3975-8-B
5-50uL Pipetta multicanale	Denville	P3975-9-B
20% formadeide	Tousimis	#1008B
Bagnomaria	ThermoFisher	TSCOL35
termomiscelatore	Eppendorf	2231000387	Un'alternativa a un bagnomaria per l'inattivazione del calore
Incubatore a CO2	ThermoFisher	13-998-213
Etanolo	Sigma Aldrich	E7023
Candeggina liquida	Fisher	Scientific NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		software di analisi per citometria a flusso
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II citometro a flusso	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher	Scientific NC9724348