Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.
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Articolo metodologico
High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale come nessun terapeutica specifica esiste per il trattamento di queste lesioni. Negli sforzi per sviluppare trattamenti e terapie di cura per l'esposizione, può essere importante capire i meccanismi cellulari e molecolari di queste lesioni. Proponiamo che l'utilizzo di screening inibitorio piccoli RNA (siRNA) su vasta scala può essere uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. siRNA sono doppio incagliati molecole RNA che sono 19-25 nucleotidi lunghi e utilizzano il percorso per degradare mRNA il silenziamento genico post-trascrizionale che hanno omologia al siRNA. La conseguente riduzione dell'espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Lo sviluppo e la validazione di modelli di esposizione in vitro e metodiche per l'alto throughput screening (HTS) di fluoruro di idrogeno (HF) e cloropicrina-(CP) indotto ferita oculare sono presentati in questo articolo. Sebbene abbiamo scelto queste due sostanze tossiche, i nostri metodi sono applicabili allo studio di altre sostanze tossiche con lievi modifiche al protocollo esposizione tossico. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e la produzione di IL-8 sono stati selezionati come endpoint nel protocollo di screening. Diverse sfide associate con lo sviluppo dell'esposizione tossico e metodi di coltura cellulare adatti per studi HTS sono presentati. La creazione di modelli HTS per queste sostanze tossiche consente ulteriori studi per capire meglio il meccanismo della ferita e alla schermata per potenziali terapie per ferita oculare chimica.
Introduzione
Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Purtroppo, trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale solo come terapie specifiche non esistono per trattare queste lesioni. L'attuale strategia di trattamento è aspecifica e comprende principalmente trattamenti topici terapeutici come lubrificanti, antibiotici, e cycloplegics seguita da antinfiammatori (ad es., steroidi) una volta la cornea ha re-epithelialized1 ,2. Nonostante il migliore trattamento....
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Protocollo
1. cella cultura manutenzione
- Crescere la linea cellulare SV40-HCEC a 37 ° C, 5% CO2e 90% di umidità in DMEM F-12 con 15% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, 10 µ g/L fattore di crescita (EGF) e di 5 mg/L insulina.
- Passaggio della linea cellulare ogni 3-4 giorni (a seconda della densità di semina) per garantire che confluency mai supera l'80% durante la manutenzione di cultura.
- Staccare le cellule da boccette utilizzando una soluzione di distacco (14 mL di soluzione per ogni boccetta di2 cm 150) e l'incubazione a 37 ° C per non più di 8 min.
- Neutralizzare la soluzione di distacco con un uguale volum....
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Risultati
Sviluppo del metodo di esposizione
Abbiamo raffinato ed abbiamo valutato l'idoneità della linea cellulare epiteliale corneale umana SV40-HCEC per uso negli studi HTS. SV40-HCEC furono immortalati utilizzando il grande T antigene di SV-40 e sono stati un regalo da Dhanajay Pal23. C'erano troppe variabili Esplorate nello sviluppo di metodologia di esposizione per presentare brevemente nel p.......
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Discussione
Qui descriviamo i nostri metodi e risultati sullo sviluppo di una cellula epiteliale di cornea elevato throughput screening modello per lo studio delle lesioni HF e CP. Inoltre presentiamo i risultati dalla schermata principale siRNA per lesioni HF. C'erano molte sfide per lo sviluppo di modelli HTS per lo studio delle lesioni TIC. Metodi che potremmo trovare nella letteratura relazionata allo studio di HF, HFA o CP in modelli di coltura cellulare erano di poco aiuto. Maggior parte dei studi in vitro sullo ione .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
DISCLAIMER: le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono la politica ufficiale del dipartimento dell'esercito, dipartimento della difesa o il governo degli Stati Uniti. Questa ricerca è stata sostenuta da un accordo tra agenzie tra NIH/NIAID e il USAMRICD e in parte da un appuntamento per il programma di partecipazione di ricerca post-laurea presso esercito medico Research Institute della chimica difesa amministrata dal rovere Istituto di crinale per scienza e formazione attraverso un accordo tra agenzie tra l'US Department of Energy e USAMRMC.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla nazionale istituti di salute contrastare programma Interagency accordo # AOD13015-001. Vorremmo ringraziare Stephanie Froberg e Peter Hurst per l'impegno e la competenza sulla produzione video.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piattaforma di manipolazione dei liquidi | Bravo Agilent o equivalente | G5409A | |
| Agitatore per piastre | Bravo Agilent o equivalente | Opzione 159 | |
| Testa del puntale monouso Bravo 96LT | Agilent o equivalente | Opzione 178 | Unità di testa di pipettaggio con puntali grandi a 96 canali |
| Testa del puntale monouso Bravo 96ST | Agilent o equivalente | Opzione 177 | Pipettaggio di puntali piccoli a 96 canali unità principale |
| Bravo 384ST testa di puntale monouso | Agilent o equivalente | Opzione 179 | Unità di testa di pipettaggio con puntali piccoli a 384 canali |
| Bravo 96 250 μ L punte barriera sterili | Agilent o equivalente | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μ L punte barriera sterili | Agilent o equivalente | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μ L punte di barriera sterili | Agilent o equivalente | 19133-212 | |
| Lettore di piastre multimodale EnSpire | Perkin Elmer o equivalente | 2300-0000 | Rivelatore di saggi AlphaLISA con eccitazione laser ad alta potenza |
| IL-8 (umano) Kit di rilevamento AlphaLISA | Perkin Elmer o equivalente | AL224F | basato su microsfere no-wash |
| ProxiPlate-384 Plus Micropiastre bianche a 384 pozzetti poco profondi | Perkin Elmer o | equivalente 6008359 | |
| Lipofectamina RNAiMAX | Invitrogen o | equivalente 13778500 | Reagente di trasfezione |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen | o equivalente | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco o | equivalente 12605010 | Soluzione per il distacco cellulare |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments o equivalente | ESSEN BIOSCI 4473 | Microscopio automatizzato alloggiato in incubatore |
| Cloropicrina | Trinity Manufacturing o equivalente | N/A | Tossicità acuta e irritante |
| Terreno di coltura cellulare DMEM-F12 | Invitrogen o equivalente | 11330-057 | Contiene HEPES |
| Siero fetale bovino | Invitrogen o | equivalente 1891471 | |
| Fattore di crescita epidermico umano (grado di coltura cellulare) | Invitrogen o equivalente | E9644-.2MG | |
| Insulina umana ricombinante (grado di coltura cellulare) | Invitrogen o equivalente | 12585-014 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina (grado di coltura cellulare) | Invitrogen o | equivalente 15140122 | |
| Idrocortisone (grado di coltura cellulare) | Sigma o equivalente | H0888-10G | |
| Glucosio (grado di coltura cellulare) | Sigma o equivalente | G7021 | |
| PBS (grado di coltura cellulare) | Sigma o equivalente | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon o equivalente | vari | |
| Tiazoil, blu tetrazolio bromuro | Sigma o equivalente | M5655 | MTT assay |
| tampone siRNA | Thermo o equivalente | B002000 | |
| piastre per colture cellulari a 96 pozzetti | Corning o equivalente | CLS3595 | |
| coltura cellulare T150 | Flaconi Corning o equivalente | CLS430825 | |
| cappa per colture cellulari BSL-2 | Nuaire o equivalente | NU-540 | |
| Serbatoi robotici da 300 mL | Thermo o equivalente | 12-565-572 | |
| 96 serbatoi di automazione deflettori | Thermo o equivalente | 1064-15-8 | |
| flaconi sterili monouso da 500 mL | Corning o | equivalente CLS430282 | |
| Termosigillatrice per micropiastre, | Thermo o equivalente | AB-1443A, | |
| Lamina termosaldante per micropiastre | Thermo o equivalente | , AB-0475 | |
| Cardamonina | Tocris o equivalente | 2509 | Antinfiammatorio, utilizzato come controllo positivo |
| SKF 86002 | Tocris o equivalente | 2008 | Antinfiammatorio, utilizzato come controllo positivo |
| DMSO | Sigma o equivalente | D8418 | |
| 48% acido fluoridrico | Sigma o equivalente | 339261 | Tossicità corrosiva e acuta |
| 1000 μ L Pipettatori monocanale | Rainin o equivalenti | 17014382 | |
| 200 μ L Pipettatori monocanale | Rainin o equivalenti | 17014391 | |
| 20 μ L Pipettatori monocanale | Rainin o equivalenti | 17014392 1000 | |
| μ L Pipettatori a 12 canali | Rainin o equivalente | 17014497 | |
| 200 μ Pipettatori L a 12 canali | Rainin o equivalenti | 17013810 | |
| 20 μ Pipettatori L a 12 canali | Rainin o equivalenti | 17013808 | |
| Punte per pipettatore 1000 μ L | Rainin o equivalente | 17002920 | |
| punte pipettatore 200 μ L | Rainin o equivalente | 17014294 | |
| Punte pipettatore 20 μ L | Rainin o | equivalente 17002928 | |
| Cappa chimica | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| Piastre di conservazione dei campioni da 384 pozzetti | Thermo o | equivalente 262261 | |
| Cloruro di sodio | Sigma o equivalente | S6191 | |
| Provette coniche da 50 mL | Pipette sierologiche termiche o equivalenti | 14-959-49A | |
| 50 mL | Corning o equivalente | 07-200-576 | |
| Pipette sierologiche 25 mL | Corning o equivalente | 07-200-575 | |
| Pipette sierologiche 10 mL | Corning o equivalente | 07-200-574 | |
| Pipette sierologiche 5 mL | Corning o equivalente | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC cellule epiteliali corneali umane immortalizzate | N/A | N/A | Queste cellule non sono disponibili in commercio, ma possono essere ottenute dai ricercatori citati nell'articolo |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore o equivalente | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix o equivalente | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- e 96-array plates | Affymetrix o | equivalente 901257; 901434 | |
| Draegger tubo HF | Draeger o | equivalente 8103251 | |
| tubo Draegger CP | Draeger o equivalente | 8103421 | |
| Pompa Draegger Draeger | o equivalente | 6400000 | |
| Guarnizioni Clear Plate | Resesarch Products International o equivalente | 202502 | |
| Serbatoi di reagenti | VistaLab Technologies o equivalente | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS o equivalente | N/A | Excel add-in utilizzato per l'adattamento automatico delle curve |
Riferimenti
- Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X.
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