Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Sommario

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Abstract

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, rappresenta un modello emergente per lo studio del metabolismo. Infatti, drosophila hanno strutture omologhe a organi umani, possiedono vie metaboliche altamente conservate e hanno una durata relativamente breve che consente lo studio dei meccanismi fondamentali differenti in un breve periodo di tempo. Sorprende, tuttavia, che uno dei meccanismi essenziali per il metabolismo cellulare, la respirazione mitocondriale, non è stato accuratamente studiato in questo modello. È probabile che la misura della respirazione mitocondriale in drosofila richiede solitamente un numero molto grande di individui e i risultati ottenuti non sono altamente riproducibili. Qui, è descritto un metodo che permette la misurazione precisa del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando la minima quantità di tessuto dalla drosofila. In questo metodo, toraci sono sezionati e permeabilizzate sia meccanicamente con una pinza tagliente e chimicamente con saponina, permettendo diversi composti di attraversare la membrana cellulare e modulano la respirazione mitocondriale. Dopo il permeabilization, un protocollo viene eseguito per valutare la capacità dei diversi complessi del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS) di ossidare substrati diversi, così come la loro risposta per un disaccoppiatore e parecchi inibitori. Questo metodo presenta molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzando isolamenti mitocondriali, in quanto è più fisiologicamente rilevante perché i mitocondri sono ancora interagendo con le altre componenti cellulari e la morfologia mitocondriale è conservata. Inoltre, la preparazione del campione sono più veloci, e i risultati ottenuti sono altamente riproducibili. Combinando i vantaggi della drosofila come un modello per lo studio del metabolismo con la valutazione della respirazione mitocondriale, importanti nuove intuizioni possono essere svelati, soprattutto quando le mosche sono sperimentando diversi ambientale o fisiopatologico condizioni.

Introduzione

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato utilizzato come organismo modello per la ricerca genetica per sopra un secolo¹. Lo studio di questo organismo non ha solo portato a significative conoscenze fondamentali sull'ereditarietà legata al sesso², mutazione tasso³, lo sviluppo del sistema neurale e la determinazione di destino cella⁴, ma anche recentemente è emerso come un strumento prezioso per studiare i meccanismi inerenti alle diverse malattie come Alzheimer e Parkinson^5,6. Inoltre, è un ....

Protocollo

1. reagenti preparazione

1. Preparare le seguenti soluzioni per la dissezione e la permeabilizzazione del tessuto.
   1. Preparare la soluzione di conservazione: 2,77 CaK₂EGTA, 7,23 mM K₂EGTA, 5,77 mM Na₂ATP, 6,56 mM MgCl₂, 20mm della taurina, 15mm fosfocreatina di Na₂, imidazolo di 20 mM, 0.5 mM dithiothreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (possono essere memorizzati a-20 ° C).
   2. Preparare la soluzione di saponina: 5 mg di saponina in 1 mL di soluzione di conservazione (preparare freschi ogni giorno).
2. Preparare le seguenti soluzioni per la misurazione della respirazione.
   1. P....

Risultati

Una traccia di rappresentante del consumo di ossigeno mitocondriale mediante il protocollo descritto sopra è fornita nella Figura 2. Il piruvato e malate iniettato nelle camere insieme con le fibre muscolari permeabilized si riferiscono alla respirazione CI-perdita, vale a dire, quando il complesso I di ETS è stimolato dal NADH prodotte attraverso l'ossidazione del piruvato e malate tramite il ciclo dell'acido tricarbossilico (CI). Durante questo tas.......

Discussione

In questo studio, è descritto un metodo per la preparazione del campione prima le misure del consumo di ossigeno mitocondriale in drosofila. Questo metodo è stato sviluppato per risolvere diversi problemi relazionati ai protocolli utilizzando isolamenti mitocondriali, in particolare in termini di durata e numero di esemplari richiesto. Invece di lavorare con isolamenti mitocondriali solitamente che richiedono grandi quantità di tessuti ottenuti da individui diversi, questo esperimento viene eseguito sulle fibre muscolari.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Respirometro ad alta risoluzione Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Kit respirometro Startup O2K
Set di titolazione O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Siringhe Hamilton con diversi volumi
Software Datlab	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati
Pinza antimagnetica a punta fine	VWR	82027-400
Secura225D-1S-DQE	Sartorius AG, Goettingen, Germania		Bilancia semi-micro (distribuita da diverse aziende)
Drosophila melanogaster wild-type w1118	Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA		br/> Condizioni di conservazione: 24 ° C
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N′-acido tetraacetico	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA Condizioni di conservazione: RT
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	ATTENZIONE: corrosivo per i metalli, tossicità acuta, corrosione della pelle, gravi lesioni oculari, tossicità acquatica acuta. Condizioni di conservazione: RT
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830	Condizioni di conservazione: RT
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Condizioni di conservazione: -20 ° C
MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Stato di conservazione: RT
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Stato di conservazione: RT
Na2Phosphocreatine	Sigma-Aldrich	P7936	Stato di conservazione: -20 ° C
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	Stato di conservazione: RT
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	D0632	Stato di conservazione: 2-8 gradi; C
MES idrato	Sigma-Aldrich	M8250	Condizioni di conservazione: RT
Saponina da corteccia di quillaja	Sigma-Aldrich	S7900	Saponina Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: 5 mg in 1 mL di soluzione di conservazione. Preparare fresco ogni giorno.
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	Condizioni di conservazione: RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	Condizioni di conservazione: RT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Condizioni di conservazione: RT
BSA	Sigma-Aldrich	05470	Condizioni di conservazione: 2-8 ° C
Na2S2O4	Sigma-Aldrich	157953	Ditionito di sodio. ATTENZIONE: sostanze e miscele autoriscaldanti, tossicità acuta, tossicità acquatica acuta tossicità acquatica cronica. Condizioni di conservazione: RT
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P2256	Piruvato Condizioni di conservazione: 2-8 gradi; C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Preparare fresco ogni giorno.
Acido L-(-)-malico	Sigma-Aldrich	M1000	Malato Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH e conservare a -20 °C.
Adenosina 5'-difosfato sale monopotassico idrato	Sigma-Aldrich	A5285	ADP Condizioni di conservazione: -20 C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH e conservare a -80 °C.
Citocromo c da cuore equino	Sigma-Aldrich	C7752	Citocromo c Condizioni di conservazione: -20 ° C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.
L-Prolina	Sigma-Aldrich	P0380	Proline Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.
Succinato di sodio bibasico esaidrato	Sigma-Aldrich	S2378	Succinato Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con HCl e conservare a -20 °C.
sn-glicerolo 3-fosfato bis(cicloesilammonio) sale	Sigma-Aldrich	G7886	glicerolo-3-fosfato Condizioni di conservazione: -20 ° C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con HCl e conservare a -80 °C.
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone	Sigma-Aldrich	C2920	FCCP. ATTENZIONE: tossicità acuta, sensibilizzazione cutanea, tossicità acquatica cronica. Condizioni di conservazione: RT Soluzione Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare in fiale di vetro a -20 °C.
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	ATTENZIONE: tossicità acuta, irritazione cutanea, irritazione oculare, tossicità specifica per organi bersaglio (sistema respir), tossicità acquatica acuta, tossicità acquatica cronica. Soluzione Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare in fiale scure a -20 °C.
Acido malonico	Sigma-Aldrich	M1296	Malonato. ATTENZIONE: tossicità acuta, gravi lesioni oculari. Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH. Preparare fresco ogni giorno.
Antimicina A da Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674	Antimicina A. ATTENZIONE: tossicità acuta, tossicità acquatica acuta, tossicità acquatica cronica. Condizioni di conservazione: -20 ° Soluzione C Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare a -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiammina	Sigma-Aldrich	T7394	TMPD Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare in fiale scure a -20 °C.
(+)-L-ascorbato di sodio	Sigma-Aldrich	A4034	Ascorbato Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare in fiale scure a -20 °C.
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002	Azide di sodio. ATTENZIONE: tossicità acuta (orale e cutanea), tossicità specifica per organi bersaglio (cervello), tossicità acquatica, tossicità acquatica cronica. Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.

<