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Articolo metodologico

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

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DOI:

10.3791/57376

7 aprile 2018

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Abstract

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, rappresenta un modello emergente per lo studio del metabolismo. Infatti, drosophila hanno strutture omologhe a organi umani, possiedono vie metaboliche altamente conservate e hanno una durata relativamente breve che consente lo studio dei meccanismi fondamentali differenti in un breve periodo di tempo. Sorprende, tuttavia, che uno dei meccanismi essenziali per il metabolismo cellulare, la respirazione mitocondriale, non è stato accuratamente studiato in questo modello. È probabile che la misura della respirazione mitocondriale in drosofila richiede solitamente un numero molto grande di individui e i risultati ottenuti non sono altamente riproducibili. Qui, è descritto un metodo che permette la misurazione precisa del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando la minima quantità di tessuto dalla drosofila. In questo metodo, toraci sono sezionati e permeabilizzate sia meccanicamente con una pinza tagliente e chimicamente con saponina, permettendo diversi composti di attraversare la membrana cellulare e modulano la respirazione mitocondriale. Dopo il permeabilization, un protocollo viene eseguito per valutare la capacità dei diversi complessi del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS) di ossidare substrati diversi, così come la loro risposta per un disaccoppiatore e parecchi inibitori. Questo metodo presenta molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzando isolamenti mitocondriali, in quanto è più fisiologicamente rilevante perché i mitocondri sono ancora interagendo con le altre componenti cellulari e la morfologia mitocondriale è conservata. Inoltre, la preparazione del campione sono più veloci, e i risultati ottenuti sono altamente riproducibili. Combinando i vantaggi della drosofila come un modello per lo studio del metabolismo con la valutazione della respirazione mitocondriale, importanti nuove intuizioni possono essere svelati, soprattutto quando le mosche sono sperimentando diversi ambientale o fisiopatologico condizioni.

Introduzione

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato utilizzato come organismo modello per la ricerca genetica per sopra un secolo1. Lo studio di questo organismo non ha solo portato a significative conoscenze fondamentali sull'ereditarietà legata al sesso2, mutazione tasso3, lo sviluppo del sistema neurale e la determinazione di destino cella4, ma anche recentemente è emerso come un strumento prezioso per studiare i meccanismi inerenti alle diverse malattie come Alzheimer e Parkinson5,6. Inoltre, è un ....

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Protocollo

1. reagenti preparazione

  1. Preparare le seguenti soluzioni per la dissezione e la permeabilizzazione del tessuto.
    1. Preparare la soluzione di conservazione: 2,77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20mm della taurina, 15mm fosfocreatina di Na2, imidazolo di 20 mM, 0.5 mM dithiothreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (possono essere memorizzati a-20 ° C).
    2. Preparare la soluzione di saponina: 5 mg di saponina in 1 mL di soluzione di conservazione (preparare freschi ogni giorno).
  2. Preparare le seguenti soluzioni per la misurazione della respirazione.
    1. P....

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Risultati

Una traccia di rappresentante del consumo di ossigeno mitocondriale mediante il protocollo descritto sopra è fornita nella Figura 2. Il piruvato e malate iniettato nelle camere insieme con le fibre muscolari permeabilized si riferiscono alla respirazione CI-perdita, vale a dire, quando il complesso I di ETS è stimolato dal NADH prodotte attraverso l'ossidazione del piruvato e malate tramite il ciclo dell'acido tricarbossilico (CI). Durante questo tas.......

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Discussione

In questo studio, è descritto un metodo per la preparazione del campione prima le misure del consumo di ossigeno mitocondriale in drosofila. Questo metodo è stato sviluppato per risolvere diversi problemi relazionati ai protocolli utilizzando isolamenti mitocondriali, in particolare in termini di durata e numero di esemplari richiesto. Invece di lavorare con isolamenti mitocondriali solitamente che richiedono grandi quantità di tessuti ottenuti da individui diversi, questo esperimento viene eseguito sulle fibre muscolari.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dalla Nazionale Scienze e ingegneria Research Council (NSERC, scoperta grant) e Université de Moncton NP. LHB desidera ringraziare i finanziamenti a sostegno dell'Istituto canadese della Université de Moncton, Nuovo Brunswick Innovation Foundation (NBIF) e Health Research (CIHR). Il lavoro di EHC è supportato dall'Alzheimer Society of Canada, Canada di cervello, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick Health Research Foundation e Université de Moncton.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Respirometro ad alta risoluzione Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02Kit respirometro Startup O2K
 
Set di titolazione O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03Siringhe Hamilton con diversi volumi
 
Software DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati
 
Pinza antimagnetica a punta fineVWR82027-400
 
Secura225D-1S-DQESartorius AG, Goettingen, GermaniaBilancia semi-micro (distribuita da diverse aziende) 
 
Drosophila melanogaster wild-type w1118Bloomington Drosophila stock Center, IN, USAbr/> Condizioni di conservazione: 24 ° C
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N′-acido tetraaceticoSigma-AldrichE4378EGTA
Condizioni di conservazione: RT
KOHSigma-AldrichP1767ATTENZIONE: corrosivo per i metalli, tossicità acuta, corrosione della pelle, gravi lesioni oculari, tossicità acquatica acuta.
Condizioni di conservazione: RT
CaCO3Sigma-AldrichC4830
Condizioni di conservazione: RT
Na2ATPSigma-AldrichA2383
Condizioni di conservazione: -20 ° C
MgCl2.6H2OSigma-AldrichM9272
Stato di conservazione: RT
TaurineSigma-AldrichT0625
Stato di conservazione: RT
Na2PhosphocreatineSigma-AldrichP7936
Stato di conservazione: -20 ° C
ImidazoleSigma-AldrichI5513
Stato di conservazione: RT
DitiotreitoloSigma-AldrichD0632
Stato di conservazione: 2-8 gradi; C
MES idratoSigma-AldrichM8250
Condizioni di conservazione: RT
Saponina da corteccia di quillajaSigma-AldrichS7900Saponina
Condizioni di conservazione: RT
Preparazione della soluzione: 5 mg in 1 mL di soluzione di conservazione. Preparare fresco ogni giorno.
KClSigma-AldrichP9541
Condizioni di conservazione: RT
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
Condizioni di conservazione: RT
HEPESSigma-AldrichH3375
Condizioni di conservazione: RT
BSASigma-Aldrich05470
Condizioni di conservazione: 2-8 ° C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953Ditionito di sodio. ATTENZIONE: sostanze e miscele autoriscaldanti, tossicità acuta, tossicità acquatica acuta tossicità acquatica cronica.
Condizioni di conservazione: RT
Piruvato di sodioSigma-AldrichP2256Piruvato
Condizioni di conservazione: 2-8 gradi; C
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Preparare fresco ogni giorno.
Acido L-(-)-malicoSigma-AldrichM1000Malato
Condizioni di conservazione: RT
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH e conservare a -20 °C.
Adenosina 5'-difosfato sale monopotassico idratoSigma-AldrichA5285ADP
Condizioni di conservazione: -20 C
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH e conservare a -80 °C.
Citocromo c da cuore equinoSigma-AldrichC7752Citocromo c
Condizioni di conservazione: -20 ° C
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.
L-ProlinaSigma-AldrichP0380Proline
Condizioni di conservazione: RT
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.
Succinato di sodio bibasico esaidratoSigma-AldrichS2378Succinato
Condizioni di conservazione: RT
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con HCl e conservare a -20 °C.
sn-glicerolo 3-fosfato bis(cicloesilammonio) saleSigma-AldrichG7886glicerolo-3-fosfato
Condizioni di conservazione: -20 ° C
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con HCl e conservare a -80 °C.
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazoneSigma-AldrichC2920FCCP. ATTENZIONE: tossicità acuta, sensibilizzazione cutanea, tossicità acquatica cronica.
Condizioni di conservazione: RT
Soluzione Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare in fiale di vetro a -20 °C.
RotenoneSigma-AldrichR8875ATTENZIONE: tossicità acuta, irritazione cutanea, irritazione oculare, tossicità specifica per organi bersaglio (sistema respir), tossicità acquatica acuta, tossicità acquatica cronica.
Soluzione Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare in fiale scure a -20 °C.
Acido malonicoSigma-AldrichM1296Malonato. ATTENZIONE: tossicità acuta, gravi lesioni oculari.
Condizioni di conservazione: RT
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH. Preparare fresco ogni giorno.
Antimicina A da Streptomyces sp.Sigma-AldrichA8674Antimicina A. ATTENZIONE: tossicità acuta, tossicità acquatica acuta, tossicità acquatica cronica.
Condizioni di conservazione: -20 ° Soluzione C
Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare a -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiamminaSigma-AldrichT7394TMPD
Condizioni di conservazione: RT
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare in fiale scure a -20 °C.
(+)-L-ascorbato di sodioSigma-AldrichA4034Ascorbato
Condizioni di conservazione: RT
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare in fiale scure a -20 °C.
NaN3Sigma-AldrichS2002Azide di sodio. ATTENZIONE: tossicità acuta (orale e cutanea), tossicità specifica per organi bersaglio (cervello), tossicità acquatica, tossicità acquatica cronica.
Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.
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Riferimenti

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal o....

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Ristampe e permessi

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Drosophila melanogasterdissezione del toracepermeabilizzazione con saponinarespirometria ad alta risoluzionesistema di trasporto degli elettroniossidazione del substratorisposta all disaccoppianteanalisi degli inibitorirespirazione mitocondriale