Questo articolo descrive la metodologia dettagliata per preparare una matrice Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME) per manipolazione di alto-rendimento di fisica e chimica di stecche che imita in vivo cellulare microambienti e a identificare l'ambiente cellulare ottima per le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) con l'analisi di singole cellule.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microambienti cellulari consistono di una varietà di segnali, quali fattori di crescita, matrici extracellulari e interazioni intercellulari. Questi spunti sono ben orchestrati e sono fondamentali nella regolazione di funzioni cellulari in un sistema vivente. Anche se un numero di ricercatori hanno tentato di studiare la correlazione tra fattori ambientali e funzioni cellulari desiderate, molto rimane sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della mancanza di una corretta metodologia di imitare tali stimoli ambientali in vitroe testare simultaneamente diversi stimoli ambientali sulle cellule. Qui, segnaliamo una piattaforma integrata di canali microfluidici e una matrice di nanofibra, seguita da analisi unicellulare ad alto contenuto, per esaminare i fenotipi di cellule staminali alterati da fattori ambientali distinti. Per illustrare l'applicazione di questa piattaforma, questo studio si concentra sui fenotipi di autorinnovanti cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Qui, presentiamo le procedure di preparazione per una matrice di nanofibra e la struttura di microfluidica nella fabbricazione di una matrice di Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME). Inoltre, procedura generale della singolo-cella profilatura, con marcatori fluorescenti multiple, multiple imaging di fluorescenza e analisi statistiche, di colorazione cellulare è descritti.
Introduzione
Pluripotenti umane cellule staminali (hPSCs)1,2 auto-rinnovarsi illimitatamente e differenziare in varie linee cellulari del tessuto, che potrebbero rivoluzionare lo sviluppo di farmaci, terapie basate su cellule, ingegneria tissutale e medicina rigenerativa 3 , 4 , 5 , 6. cultura generale piatti e piastre di microtitolazione, tuttavia, non sono progettati per consentire la manipolazione precisa delle cellule fisiche e chimiche a livello cellulare con la gamma di nano - per micrometr....
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Protocollo
1. fabbricazione di matrice MACME
Nota: Tutti i materiali e le attrezzature sono elencati nella tabella materiali.
-
Preparazione di maschere per una matrice di nanofibra e uno stampo per una struttura di microfluidica
- Creare immagini tridimensionali (3D) di maschere utilizzate per il nanofibra matrici e stampi per strutture di microfluidica utilizzando pacchetti software 3D-computer grafica (tabella 1).
Nota: Le immagini 3D vengono letti e stampate da una stampante 3D. Le maschere stampate e muffa hanno le stesse dimensioni con immagini 3D definite utilizzando il soft....
- Creare immagini tridimensionali (3D) di maschere utilizzate per il nanofibra matrici e stampi per strutture di microfluidica utilizzando pacchetti software 3D-computer grafica (tabella 1).
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Risultati
Matrici MACME: progettazione e fabbricazione: In combinazione con la tecnologia di nanofibra, abbiamo usato coltura cellulare microfluidica e screening tecniche impiegate in precedenza per identificare le condizioni ottimali per hPSC auto-rinnovamento o differenziazione35,36 (Figura 1). Questo è adatto per stabilire solide analisi cell-based di alto-rendimento perché gli alloggiamenti.......
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Discussione
Questo protocollo viene illustrato il primo metodo di screening per stabilire un sistema di cultura robusta per la manutenzione di hPSCs qualificato. In primo luogo, abbiamo descritto come preparare una piattaforma con diversi ECMs artificiale e densità di semina utilizzando un dispositivo microfluidico integrato con una matrice di nanofibra, la matrice MACME cellulare. Secondo, quantitativa basata su immagine unicellulare phenotyping era eseguita50 per valutare risultati cellulari individuali e c.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo la Prof. ssa N. Nakatsuji alla iCeMS, Università di Kyoto, per la fornitura di cellule umane ES. Ringraziamo anche la Prof. ssa A. Maruyama Tokyo Institute of Technology per il suo sostegno nell'uso del microscopio a forza atomica. Finanziamento è stato generosamente fornito dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); finanziamento è stato fornito anche dalla nuova energia e organizzazione di sviluppo industriale tecnologia (NEDO) e la Fondazione di Life Science di Terumo. Il WPI-iCeMS è supportato da mondo Premier International Research Centre iniziativa (WPI), il Ministero della pubblica istruzi....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Polistirene (PS) | Sigma | #182435 | Mw medio: 290.000, Mn medio: 130.000 |
| Polimetilglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatina (GT) | Sigma | G2625 | Dalla pelle suina, |
| kit di elastomero siliconico Sylgard 184 | Doe Corning Toray | #1064291 | L'agente indurente PDMS e la base di elastomero siliconico sono componenti di questo kit. |
| OpenSCAD | Questo è un software gratuito di computer grafica 3D (http://www.openscad.org/) utilizzato per progettare lo stampo del dispositivo microfluidico. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | Si tratta di un software di computer grafica 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) utilizzato per la progettazione della maschera utilizzata nella preparazione di array di nanofibre. | |
| Stampante 3D, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| Resina polimerizzabile UV, AR-M2 | Keyence | Viene utilizzata per la stampa 3D da Agilista. | |
| Acido acetico | Sigma | #338826 | ≥ 99,99% |
| Acetato di etile | Sigma | #270989 | Anidro, 99,8% |
| Tetraidrofurano (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Dispositivo | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | Questa è una piastra di base in polistirene su cui viene creato l'array di nanofibre. Questa dimensione della lastra è in genere 127,7 x 85,5 mm. |
| Macchina a scarica corona a pistola | Shinko Electric & Strumentazione | CFG-500 | Questo pratico dispositivo viene utilizzato per generare corona per l'attivazione della superficie inferiore dello strato PDMS al passaggio 1.5 "Assemblaggio degli array MACME" nel protocollo. |
| Siringa da 5 mL | Terumo | SS-05SZ | |
| Ago smussato in acciaio inossidabile (calibro 23) | Nipro | #2166 | Il diametro esterno e la lunghezza sono rispettivamente di 0,6 e 32 mm. |
| Alimentatore ad alta tensione | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimmide, cloridrato | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | Questa proteina è indicata come matrice di gel della membrana basale nel protocollo. |
| CellAdhere Vitronectina, Umana, Soluzione | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Terreno di coltura privo di feeder e xeno per il mantenimento di cellule ES e iPS umane |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| Enzima TrypLE Express (1X), rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | Si tratta di una proteasi ricombinante tripsina-simile per la dissociazione delle cellule di mammifero aderenti. |
| Kit di imaging Click-iT EdU con Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | La marcatura fluorescente delle cellule proliferanti nella colorazione fluorescente su piastra è stata eseguita insieme al manuale del prodotto di questo kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 coniugato | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | Si tratta di un anticorpo secondario utilizzato nella colorazione di cellule fluorescenti su piastra. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | Si tratta di un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un obiettivo CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. (Nikon), fotocamera CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lampada al mercurio (Intensilight, Nikon), tavolino automatizzato XYZ (tavolino motorizzato Ti-S-ER con encoder, Nikon) e cubi filtranti per quattro canali di fluorescenza (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | Questo è un software di imaging per microscopio utilizzato per l'acquisizione automatica delle immagini. | |
| CellProfiler, Versione 2.1.0 | Questo è un software aperto gratuito per l'analisi delle immagini cellulari (http://cellprofiler.org/). | ||
| L'analisi R | SOM viene eseguita dal pacchetto kohonen di questo software. Questo è disponibile gratuitamente (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | Questo è il software di clustering open source (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Con questo software viene eseguito il clustering gerarchico non supervisionato. | ||
| Java TreeView | Questo software open source (http://jtreeview.sourceforge.net/) viene utilizzato per visualizzare i dati di clustering come una mappa di calore e un dendrogramma. | ||
| H9 cellula staminale embrionale umana | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al.
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Ristampe e permessi
