Articolo metodologico

Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/57393

⸱

30 aprile 2018

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetica chimica sempre più è stata impiegata per decodificare tratti in piante che possono essere recalcitranti alla tradizionale genetica a causa della ridondanza genica o letalità. Tuttavia, la probabilità di una piccola molecola sintetica essendo bioactive è bassa; di conseguenza, migliaia di molecole dovrà essere testati al fine di trovare quelli di interesse. Gestione robotica sistemi sono progettati per gestire un numero elevato di campioni, aumentando la velocità con cui una biblioteca chimica può essere proiettata oltre a minimizzare/standardizzazione errore di liquidi. Per ottenere una schermata di alto-rendimento avanti genetica chimica di una biblioteca di 50.000 piccole molecole su Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolli usando un liquido multicanale banco manipolazione robot sono stati sviluppati che richiedono minima coinvolgimento tecnico. Con questi protocolli, 3.271 piccole molecole sono state scoperte che ha causato alterazioni fenotipiche visibile. 1.563 composti indotto brevi radici, 1.148 composti alterate colorazione, 383 composti causati radice dei capelli e altre, non categorizzata, alterazioni e germinazione 177 composti hanno inibiti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi 20 anni i ricercatori nel campo della biologia vegetale hanno compiuto grandi progressi utilizzando approcci di genetica chimica, sia avanti e indietro, migliorando la nostra comprensione della biosintesi della parete cellulare, il citoscheletro, la biosintesi dell'ormone e di segnalazione, gravitropismo, patogenesi, biosintesi delle purine ed endomembrane traffico1,2,3,4,5. L'impiego di tecniche di genetica chimica in avanti permettendo l'identificazione di fenotipi di interesse e permette ai ricercatori di capire i fondamenti genotipici di particolari processi. Al contrario, genetica chimica inversa Cerca prodotti chimici che interagiscono con un pre-determinata proteina bersaglio6. Arabidopsis è stato all'avanguardia di queste scoperte in biologia vegetale, perché il suo genoma è piccolo, mappato e annotati. Ha un tempo di generazione breve, e sono presenti più righe di mutante/reporter disponibili per facilitare l'identificazione di macchinari subcellulare aberrante7.

Ci sono due principali colli di bottiglia che rallentano i progressi degli schermi genetici chimici in avanti, l'iniziale processo di screening e determinare l'obiettivo del composto di interesse8. Un aiuto importante nell'aumentare la velocità di selezione piccola molecola è l'uso di apparecchiatura automatizzata9e automazione. Robot di manipolazione dei liquidi sono un ottimo strumento per la gestione delle grandi biblioteche di piccole molecole e hanno contribuito a guidare il progresso nelle scienze biologiche10. Il protocollo qui presentato è stato progettato per alleviare il collo di bottiglia associato con il processo di screening, che consentano l'identificazione di piccole molecole bioattive a ritmo veloce. Questa tecnica riduce il carico di lavoro e il tempo per conto dell'operatore, anche diminuendo il costo economico per il ricercatore di principio.

Finora, le librerie più chimiche analizzate hanno tenuto tra 10.000 e 20.000 composti, alcuni con oltre 150.000 ed alcuni con minor come 709,11,12,13,14, 15 , 16. il protocollo introdotto nel presente documento è stato implementato su una libreria piccola molecola di 50.000 composti (Vedi Tabella materiali), uno della più grande genetica chimica avanti schermi condotti su Arabidopsis fino ad oggi. Questo protocollo si adatta con l'attuale tendenza verso una maggiore efficienza e velocità per quanto riguarda la genetica chimica in avanti, soprattutto per quanto riguarda erbicida scoperta, scoperta di insetticida, fungicida scoprire, drug discovery e biologia del cancro17 ,18,19,20,21. Anche se qui implementato con Arabidopsis, questo protocollo, potrebbe facilmente essere adattato alle colture cellulari, spore e potenzialmente anche gli insetti in mezzo liquido all'interno di 96, 384- o 1536 pozzetti. Grazie alle sue piccole dimensioni, Arabidopsis è favorevole alla proiezione a 96 pozzetti. Tuttavia, distribuendo uniformemente tra pozzi è una sfida. Mano il seeding è accurata, ma ad alta intensità di manodopera, e anche se ci sono dispositivi progettati per erogare semi in piastre da 96 pozzetti, essi sono costosi da acquistare. Qui, ci mostrano come questo passaggio può essere aggirato con solo una piccola perdita in precisione.

L'obiettivo generale di questo metodo era per fare lo screening di una grande biblioteca chimica contro Arabidopsis più gestibile, senza compromettere la precisione, tramite l'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi. L'utilizzo di questo metodo migliora l'efficienza del ricercatore di diminuire il tempo necessario per completare la gestione di serie di diluizione iniziale e schermate successive fenotipiche, consentendo una visualizzazione rapida dei campioni sotto un microscopio per dissezione e rapida identificazione di nuove piccole molecole bioattive. Figura 1 illustra i risultati chiave di questo protocollo in 4 passi.

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Figura 1: flusso di lavoro complessivo dello schermo in avanti genetica chimica. Una panoramica del protocollo per essere descritto con qualche dettaglio per ciascuno dei 4 passaggi chiave. 1: ricevendo la biblioteca chimica, 2: rendere la libreria di diluizione, 3: rendendo le piastre di Screening e 4: incubazione e visualizzare le piastre di Screening. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. creazione di una libreria di diluizione

  1. Etichetta 625 piastre di diluizione biblioteca a mano, garantendo che essi corrispondono alla loro piastra corrispondente dalla biblioteca chimica. Inoltre, connettersi in flusso e out tubi di flusso per il multicanale suggerimento lavaggio automatizzato Labware posizionatore (ALP) passando attraverso l'unità di Console per il serbatoio da 5 galloni (Vedi Tabella materiali).
  2. Accedere al computer e accendere la pompa di lavaggio attraverso la connessione del Controller del dispositivo per il multicanale suggerimento Wash ALP al fine di far circolare l'acqua. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.
  3. Carico, a mano, il 10 di Stacker fissato al carosello Stacker, nel seguente ordine in Alberghi A - D (Figura 4, Stacker); una scatola di AP96 P20 puntali in camera 1, quattro V 96 pozzetti-piastre di fondo in camere a 2-5 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio dalla libreria di ordinato e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore). Inoltre, caricare una scatola di AP96 P20 puntali in camera 6 e quattro 96 pozzetti V-piastre inferiori nelle camere: 7-9 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio della biblioteca ordinata e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore).
  4. Istituire, a mano, il ponte con un serbatoio di acqua 300 mL su P3, un 300 mL 70% EtOH bagno il P7, suggerimento Loader ALP (TL1) e multicanale suggerimento Wash ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, ponte).
  5. Utilizzando il software operativo, presentare AP96 P20 puntali da 10 Stacker e spostarli all'Alpe Loader Tip.
    Nota: 1.5 tramite 1.12 tutte sono fatte con il liquido gestione software operativo del robot; Vedi Tabella materiali.
  6. Presentiamo 2 camera da Hotel A e separare tutti i quattro 96 pozzetti V-fondo piastre sul ponte, mettendo sul fondo due su P4 e P8 e le prime due su P5 e P9 (Figura 4).
  7. Caricare AP96 P20 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l. 90 µ l del serbatoio di acqua di 300 mL di aspirare e dispensare al v 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4. Ripetere questo passaggio per la piastra su P8.
  8. Mescolare la piastra libreria chimica su P5 ripetutamente aspirazione e il dosaggio 15 µ l tre volte. Inoltre, aspirare 10 µ l dalla cassa della libreria chimica su P5 e Pipettare 10 µ l nella piastra diluizione su P4.
  9. Mescolare le soluzioni della piastra sul P4 da ripetutamente aspirazione e il dosaggio 50 µ l di un totale di tre volte. Una volta miscelato, pulire le punte di pipetta P20 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH da P7, poi lavarli in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.
  10. Ripetere i passaggi da 1.8-1.9 per la seconda coppia di piastre su P8 e P9. Al momento di creare il secondo V 96-Well-piastra inferiore diluizione, stack le piastre nel seguente ordine dal basso verso l'alto: P4, P5, P8 e P9. Quindi, posizionare la risma un vuoto statico ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.
  11. Ripetere i passaggi 1.6-1.10 5 camera in Hotel A è vuoto. Ripetere il passaggio 1.5 su raggiungendo la camera 6, spostando nuovo AP96 P20 puntali all'Alpe Loader Tip e mettendo i puntali per pipette usate AP96 P20 su un vuoto statico ALP.
  12. Ripetere i passaggi 1.6-1.10 9 camera di Hotel A è vuoto. Tuttavia, al fine di procedere all'Hotel B, le piastre e suggerimenti sul ponte devono essere ricaricati in a Hotel.
  13. A mano, ri-riempire il serbatoio di acqua di 300 mL. Questo passaggio è cruciale, e il programma del computer può incorporare una pausa dettagliare questo messaggio, che richiede l'utente a premere 'continua', prima di eseguire il passaggio successivo.
  14. Ripetere i passaggi da 1.5-1.13 per i rimanenti Hotel, garantendo un serbatoio dell'acqua pieno 300 mL ogni volta prima di procedere all'hotel successivo.

2. aggiunta di miscela di Media-semi per piastre di Screening

  1. Fare ½ Murashige e Skoog (MS) Media con 0,1% Agar con l'aggiunta di 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar a 1 L DI H2O. regolare il pH a 5.7 però l'aggiunta di 5 M di idrossido di potassio durante il monitoraggio con una sonda di pH.
  2. Sterilizzare i semi agitando in 1% candeggina e SDS tra 15 e 30 min e poi lavare 4 volte con un volume uguale di acqua mediante centrifugazione. Una volta che i semi sono sterili, metterli a 4 ° C da 24 ore a 7 giorni per vernilization. Il centro di risorse biologiche di Arabidopsis descrive ulteriori metodi di sterilizzazione, vernilization e crescita22.
  3. Aggiungere i semi ai media a mano ad una densità di 0,1 g/100 mL. Questa densità si traduce in una media di 3-10 semi per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  4. Luogo, a mano, quattro 96 pozzetti piatto-piastre di fondo in camere 1 e 2 di Hotel A (Figura 6, A Hotel). Inserire una casella di AP96 P250 puntali sull'Alpe Loader Tip, un serbatoio 300ml riempito con la miscela di semi di media creata nei passaggi da 2.1-2.3 in P3 e un serbatoio 300 mL riempita con 70% EtOH sul P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Ponte).
    Nota: 2.5 tramite 2.8 sono fatto con il software operativo.
  5. Presentare le camere 1 e 2 in Hotel A e separare le pile di quattro piastre. Posizionare una piastra su ciascuna delle Alpi vuoto statico (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Caricare AP96 P250 puntali sulla testa con 96 canali a 200 µ l.
  6. 90 µ l dal serbatoio 300ml media-seme su P3 di aspirare e dispensare nel primo appartamento di 96 pozzetti-piastra inferiore. Ripetere questo processo fino a quando tutte le otto tavole contengono la miscela di semi di media.
  7. Pulizia delle punte di pipetta P250 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l dal serbatoio 300 mL riempito con 70% EtOH sul P7. Lavare le punte in multicanale suggerimento lavare Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte, scaricare le punte presso TL1 e raccogliere i piatti a mano.

3. aggiunta di piccole molecole per piastre di Screening

  1. Carico, a mano, una scatola di AP96 P250 puntali in 1 camera di Hotel A, due V 96 pozzetti-piastre inferiori del libreria di diluizione in camere da 2, 4, 6 e 8 e due 96 ben piatto-Screening piastre inferiori in camere 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Fascicolatore e Figura 7, un Hotel). Inoltre, collegare i tubi flessibili da e verso l'Alpe di Wash suggerimento multicanale per il serbatoio da 5 galloni.
    Nota: 3.2 al 3.10 sono fatto con il software operativo.
  2. Configurare il mazzo per contenere un serbatoio di lavaggio 300 mL 70% EtOH presso P7; il serbatoio di media-seme può essere lasciato sul ponte a P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, ponte). Inoltre, accendere l'unità di Console tramite connessione del dispositivo Controller per far circolare l'acqua attraverso l'Alpe Wash suggerimento multicanale. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.
  3. Presentiamo la scatola di Tip pipetta AP96 P250 da Hotel A e spostarlo all'Alpe Loader Tip.
  4. Presentare il V 96 pozzetti-piastre di diluizione biblioteca inferiori da 2 camera di Hotel al ponte e posto uno statico ALP P4 e uno su P8. Presentare il piatto di 96 pozzetti-piastre di Screening di fondo da camera 3 di Hotel al ponte e posizionare uno statico ALP P5 e uno su P9.
  5. Caricare AP96 P250 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l.
  6. Mescolare il V 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. In seguito, aspirare 10 µ l da questo piatto e versare nel piatto 96-Well-piastra di Screening inferiore su P5.
  7. Mescolare le soluzioni nella piastra a P5 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. Pulire le punte di pipetta AP96 P250 con etanolo di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH dal serbatoio a P7 e poi lavare i suggerimenti in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.
  8. Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6 per il secondo V 96-Well-piastra di fondo diluizione biblioteca (P8) e 96 pozzetti piatto-piastra inferiore Screening (P9).
  9. Stack due 96 pozzetti V-piastre di diluizione biblioteca inferiori insieme e le due piastre di fondo Screening 96 pozzetti piatto insieme. Spostare le piastre statico Alpi P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.
  10. Ripetere i passaggi da 3.4-3.9 tre volte, l'aggiunta di prodotti chimici diluiti allo screening piatti un totale di otto volte. Infine, controllare il numero di semi in ciascun pozzetto delle piastre di screening attraverso visual conformazione e integrare tali pozzetti con meno di tre semi per ulteriori seme vernalizzato e sterilizzato.

4. incubazione e visualizzazione delle piastre di Screening

  1. Incubare le piastre a 96 pozzetti a fondo piatto di Screening per quattro giorni in una camera climatica a 22 ° C su un ciclo luce/buio di 16/8 in un contenitore di prova di essiccazione. Visualizzare le piastre da 96 pozzetti a fondo piatto Vagli sotto un microscopio per dissezione. Registrare tutti i fenotipi aberranti per ulteriori indagini.

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Risultati

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La capacità di esattamente ed efficientemente caratterizzare fenotipi basati sull'aggiunta di piccole molecole alle concentrazioni sotto un microscopio per dissezione di screening è l'obiettivo finale di questo metodo di inoltro genetica chimica su Arabidopsis. I fenotipi osservati quando tutti i 50.000 composti erano stati proiettati era vari e può essere suddiviso in diverse classi distinte (Figura 2). Figura 3A

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è progettato per aiutare i ricercatori nella realizzazione di uno schermo in avanti genetica chimica su Arabidopsis. Forniamo risultati rappresentativi da uno schermo di 50.000 composti (Figura 2 e Figura 3), uno dei più grandi schermi avanti genetica chimica eseguita su Arabidopsis ad oggi9,13,23. L'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi pe...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Jozsef cicogna, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez per la discussione costruttiva e critica. Dr. Sharyn Perry per le fotografie fenotipiche. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto cooperativa contratto n. 1355438.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
TastieraProvider localeN/AUtilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento del mouse Biomek FX
Provider localeN/AUtilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento dello schermo del computer Biomek FX
Provider localeN/AUtilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento del computer Biomek FX
Provider localeN/AUtilizzato per la progettazione e il funzionamento del protocollo Biomek FX
DIVERSet Libreria di screening diversificataChemBridgeN/ALibreria chimica
BiomekBeckman CoulterN/A Gestiscee progetta il controller del dispositivo Biomek FX
Beckman Coulter719366Gestisce la pompa dell'acqua/stazione di lavaggio delle punte
Impilatore Carosello PendenteBeckman Coulter148240Funzionamento manuale di Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker CarouselBeckman Coulter148520Unità rotante che ospita tutti gli FX Stacker 10's
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo
Biomek FXBeckman Coulterhttps://www.beckman.com/liquid-handlersRobot che esegue le operazioni desiderate
AccuframeArtisan Technology Group76853-4Telaio Braccio per posizionare correttamente
i componenti Attrezzatura di inquadraturaBeckman Coulter719415Centra il braccio nell'Accuframe
Lavaggio multicanale delle punte ALPBeckman Coulter719662Lava le punte dopo il bagno di etanolo
Caricatore di punte ALPBeckman Coulter719356Carica pneumaticamente le punte sul braccio
Compressore d'ariaFornitorelocale N/AFornisce aria per il caricamento pneumatico delle punte
Azionamento della console MasterFlexCole-Parmer77200-65Pompa utilizzata per far circolare l'acqua attraverso il tubo dell'aria della lavatrice della punta multicanale
Fornitore localeN/AFornisce aria dal compressore d'aria al
tubo dell'acquaFornitore localeN/AFornisce acqua da 5 galloni Riserva alla rondella della punta Statico
coltro Beckmanviene fornito con l'attrezzatura di supporto Biomek FXper lo schermo
5 galloni di riservanostro fornitore localeN/Aricircola l'acqua sporca dalla pulizia delle punte
Pinze BeckmanCoulterViene fornito con le pinze Biomek FXe sposta l'attrezzatura nei posti corretti
96 canali 200 &; Testa a LBeckman CoulterViene fornito con Biomek FXContiene i 96 puntali utilizzati all'interno dello schermo
AP96 P200 Puntali per pipetteBeckman Coulter717251Utilizzato per realizzare la libreria di screening Piastra a
fondo piatto a 96 pozzettiCostar9018Aiuta nella visulizzazione dello schermo
Piastra a fondo V a 96 pozzettiCostar3897Aiuta nella conservazione della libreria di diluizione
AlumaSeal 96 Pellicola sigillanteMedSciF-96-100Guarnizioni per la conservazione sia della libreria chimica che della libreria di diluizione
Sacchetti per sandwich con chiusura lampoin plastica Fornitore localeN/AUtilizzato per garantire un ambiente umido per lo schermo
AP96 P20 Puntali per pipetteBeckman Coulter717254Utilizzato nella creazione della libreria di diluizione
Camera di crescitaPercivalAR36L3Germina i semi per la fenotipia visulizzazione
SpatolaFornitore localeN/AContiene i semi da aggiungere nei pozzi dove la semina liquida non è riuscita a seminare adeguatamente
StuzzicadentiFornitore localeN/ASpinge i semi dalla spatola ai pozzi
Miscela di sali basali Murashige e SkoogPhytoTechnology LaboratoriesM524Aggiungi alla miscela di terreni
MS Acido libero monoidratoFisher ScientificICN19483580Aggiunto ai terreni MS per diminuire il pH
Polvere di agarAlfa Aesar9002-18-0Aumenta lo spessore dei terreni per supportare la sospensione di semi
5M KOHSigma-Aldrich484016Aumenta il pH a livelli adeguati
Flacone per la conservazione dei terreni da 1 litroCorning1395-1LContiene una quantità sufficiente di terreno per uno schermo
Provette da centrifuga in polipropileneCorning431470Sterilizza i semi prima della vernilizzazione
Sonda di pHDavis InstrumentsYX-58825-26Utilizzato per la produzione di terreni
ALP (Automated Labware Positioners) Manuale d'usoColtro Beckman PN987836Aiuta a configurare l'attrezzatura di accompagnamento per il Biomek FX Biomek
Biomek 2000 Stacker Carousel Guida per l'utenteBeckman Coulter609862-AAAiuta a configurare il carosello
dell'impilatoreBiomek FX e FXP Workstation per l'automazione di laboratorio Manuale dell'utenteBeckman CoulterPN 987834Utilizzato per inquadrare il pod multicanale
Biomek FXP Workstation per l'automazione di laboratorio Guida all'avvio per il clienteBeckman CoulterPN B32335ABUtilizzato per facilitare la configurazione del software Biomek FX
Biomek Manuale dell'utenteBeckman CoulterPN 987835Utilizzato per configurare e comprendere il Software
Software del caricatore della punta Il di ALP Il

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
  2. Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
  3. McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
  4. Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
  5. Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
  6. De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
  7. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
  8. Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131(2015).
  9. Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
  10. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  11. DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
  12. Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
  13. Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
  14. Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
  15. Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
  16. De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
  17. Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  18. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  19. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  20. Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
  21. Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
  22. Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
  23. Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
  24. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
  25. Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
  26. Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
  27. Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).

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