Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.
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Articolo metodologico
Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Genetica chimica sempre più è stata impiegata per decodificare tratti in piante che possono essere recalcitranti alla tradizionale genetica a causa della ridondanza genica o letalità. Tuttavia, la probabilità di una piccola molecola sintetica essendo bioactive è bassa; di conseguenza, migliaia di molecole dovrà essere testati al fine di trovare quelli di interesse. Gestione robotica sistemi sono progettati per gestire un numero elevato di campioni, aumentando la velocità con cui una biblioteca chimica può essere proiettata oltre a minimizzare/standardizzazione errore di liquidi. Per ottenere una schermata di alto-rendimento avanti genetica chimica di una biblioteca di 50.000 piccole molecole su Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolli usando un liquido multicanale banco manipolazione robot sono stati sviluppati che richiedono minima coinvolgimento tecnico. Con questi protocolli, 3.271 piccole molecole sono state scoperte che ha causato alterazioni fenotipiche visibile. 1.563 composti indotto brevi radici, 1.148 composti alterate colorazione, 383 composti causati radice dei capelli e altre, non categorizzata, alterazioni e germinazione 177 composti hanno inibiti.
Introduzione
Negli ultimi 20 anni i ricercatori nel campo della biologia vegetale hanno compiuto grandi progressi utilizzando approcci di genetica chimica, sia avanti e indietro, migliorando la nostra comprensione della biosintesi della parete cellulare, il citoscheletro, la biosintesi dell'ormone e di segnalazione, gravitropismo, patogenesi, biosintesi delle purine ed endomembrane traffico1,2,3,4,5. L'impiego di tecniche di genetica chimica in avanti permettendo l'identificazione di fenotipi di interesse e permette ai ....
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Protocollo
1. creazione di una libreria di diluizione
- Etichetta 625 piastre di diluizione biblioteca a mano, garantendo che essi corrispondono alla loro piastra corrispondente dalla biblioteca chimica. Inoltre, connettersi in flusso e out tubi di flusso per il multicanale suggerimento lavaggio automatizzato Labware posizionatore (ALP) passando attraverso l'unità di Console per il serbatoio da 5 galloni (Vedi Tabella materiali).
- Accedere al computer e accendere la pompa di lavaggio attraverso la connessione del Controller del dispositivo per il multicanale suggerimento Wash ALP al fine di far circolare l'acqua. Questo si spegne automaticamente....
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Risultati
La capacità di esattamente ed efficientemente caratterizzare fenotipi basati sull'aggiunta di piccole molecole alle concentrazioni sotto un microscopio per dissezione di screening è l'obiettivo finale di questo metodo di inoltro genetica chimica su Arabidopsis. I fenotipi osservati quando tutti i 50.000 composti erano stati proiettati era vari e può essere suddiviso in diverse classi distinte (Figura 2). Figura 3A
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Discussione
Questo protocollo è progettato per aiutare i ricercatori nella realizzazione di uno schermo in avanti genetica chimica su Arabidopsis. Forniamo risultati rappresentativi da uno schermo di 50.000 composti (Figura 2 e Figura 3), uno dei più grandi schermi avanti genetica chimica eseguita su Arabidopsis ad oggi9,13,23. L'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi pe.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo Jozsef cicogna, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez per la discussione costruttiva e critica. Dr. Sharyn Perry per le fotografie fenotipiche. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto cooperativa contratto n. 1355438.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tastiera | Provider locale | N/A | Utilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento del mouse Biomek FX |
| Provider locale | N/A | Utilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento dello schermo del computer Biomek FX | |
| Provider locale | N/A | Utilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento del computer Biomek FX | |
| Provider locale | N/A | Utilizzato per la progettazione e il funzionamento del protocollo Biomek FX | |
| DIVERSet Libreria di screening diversificata | ChemBridge | N/A | Libreria chimica |
| Biomek | Beckman Coulter | N/A Gestisce | e progetta il controller del dispositivo Biomek FX |
| Beckman Coulter | 719366 | Gestisce la pompa dell'acqua/stazione di lavaggio delle punte | |
| Impilatore Carosello Pendente | Beckman Coulter | 148240 | Funzionamento manuale di Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Unità rotante che ospita tutti gli FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot che esegue le operazioni desiderate |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Telaio Braccio per posizionare correttamente |
| i componenti Attrezzatura di inquadratura | Beckman Coulter | 719415 | Centra il braccio nell'Accuframe |
| Lavaggio multicanale delle punte ALP | Beckman Coulter | 719662 | Lava le punte dopo il bagno di etanolo |
| Caricatore di punte ALP | Beckman Coulter | 719356 | Carica pneumaticamente le punte sul braccio |
| Compressore d'aria | Fornitore | locale N/A | Fornisce aria per il caricamento pneumatico delle punte |
| Azionamento della console MasterFlex | Cole-Parmer | 77200-65 | Pompa utilizzata per far circolare l'acqua attraverso il tubo dell'aria della lavatrice della punta multicanale |
| Fornitore locale | N/A | Fornisce aria dal compressore d'aria al | |
| tubo dell'acqua | Fornitore locale | N/A | Fornisce acqua da 5 galloni Riserva alla rondella della punta Statico |
| coltro Beckman | viene fornito con l'attrezzatura di supporto Biomek FX | per lo schermo | |
| 5 galloni di riserva | nostro fornitore locale | N/A | ricircola l'acqua sporca dalla pulizia delle punte |
| Pinze Beckman | Coulter | Viene fornito con le pinze Biomek FX | e sposta l'attrezzatura nei posti corretti |
| 96 canali 200 &; Testa a L | Beckman Coulter | Viene fornito con Biomek FX | Contiene i 96 puntali utilizzati all'interno dello schermo |
| AP96 P200 Puntali per pipette | Beckman Coulter | 717251 | Utilizzato per realizzare la libreria di screening Piastra a |
| fondo piatto a 96 pozzetti | Costar | 9018 | Aiuta nella visulizzazione dello schermo |
| Piastra a fondo V a 96 pozzetti | Costar | 3897 | Aiuta nella conservazione della libreria di diluizione |
| AlumaSeal 96 Pellicola sigillante | MedSci | F-96-100 | Guarnizioni per la conservazione sia della libreria chimica che della libreria di diluizione |
| Sacchetti per sandwich con chiusura lampo | in plastica Fornitore locale | N/A | Utilizzato per garantire un ambiente umido per lo schermo |
| AP96 P20 Puntali per pipette | Beckman Coulter | 717254 | Utilizzato nella creazione della libreria di diluizione |
| Camera di crescita | Percival | AR36L3 | Germina i semi per la fenotipia visulizzazione |
| Spatola | Fornitore locale | N/A | Contiene i semi da aggiungere nei pozzi dove la semina liquida non è riuscita a seminare adeguatamente |
| Stuzzicadenti | Fornitore locale | N/A | Spinge i semi dalla spatola ai pozzi |
| Miscela di sali basali Murashige e Skoog | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Aggiungi alla miscela di terreni |
| MS Acido libero monoidrato | Fisher Scientific | ICN19483580 | Aggiunto ai terreni MS per diminuire il pH |
| Polvere di agar | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Aumenta lo spessore dei terreni per supportare la sospensione di semi |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Aumenta il pH a livelli adeguati |
| Flacone per la conservazione dei terreni da 1 litro | Corning | 1395-1L | Contiene una quantità sufficiente di terreno per uno schermo |
| Provette da centrifuga in polipropilene | Corning | 431470 | Sterilizza i semi prima della vernilizzazione |
| Sonda di pH | Davis Instruments | YX-58825-26 | Utilizzato per la produzione di terreni |
| ALP (Automated Labware Positioners) Manuale d'uso | Coltro Beckman PN | 987836 | Aiuta a configurare l'attrezzatura di accompagnamento per il Biomek FX Biomek |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Guida per l'utente | Beckman Coulter | 609862-AA | Aiuta a configurare il carosello |
| dell'impilatoreBiomek FX e FXP Workstation per l'automazione di laboratorio Manuale dell'utente | Beckman Coulter | PN 987834 | Utilizzato per inquadrare il pod multicanale |
| Biomek FXP Workstation per l'automazione di laboratorio Guida all'avvio per il cliente | Beckman Coulter | PN B32335AB | Utilizzato per facilitare la configurazione del software Biomek FX |
| Biomek Manuale dell'utente | Beckman Coulter | PN 987835 | Utilizzato per configurare e comprendere il Software |
Riferimenti
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- Mc....
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Ristampe e permessi
