Neovascularization dell'iride, una complicazione comune della malattia della retina ischemica, può portare ad avvistare-minaccioso il glaucoma neovascular. Qui, descriviamo un protocollo murino per indurre il neovascularization iris sperimentali che possono essere utilizzati per la valutazione non invasiva delle sostanze l'angiogenesi di modulazione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo un modello del neovascularization dell'iride indotta da puntura come un modello generale per la valutazione non invasiva dell'angiogenesi. Il modello è anche rilevante per il targeting glaucoma neovascolare, una complicazione avvistare-minacciosa di retinopatia diabetica. Questo metodo si basa sull'induzione della risposta vascolare iris da una serie di forature autosigillante uveale su topi BALB/c e sfrutta la maturazione post-partum del vasculature oculare del mouse. Cuccioli di mouse subiscono uveale forature da giorno postnatale 12.5, naturalmente quando i cuccioli aprono i loro occhi, fino al giorno postnatale 24,5. Grazie alla trasparenza della cornea, sistema vascolare iride può essere analizzato facilmente attraverso il tempo con metodi non invasiva in vivo . Inoltre, l'iride semitrasparente di topi BALB/c può essere flatmounted per l'analisi dettagliata immunohistologic con la colorazione di fondo minimo non specifici. In questo modello, l'angiogenesi è determinata essenzialmente dall'infiammatorio e sistemi di attivazione del plasminogeno. Il modello indotta da puntura è il primo per indurre il neovascularization dell'iride in piccoli roditori e ha il vantaggio di consentire analisi diretta non invasiva in vivo del processo angiogenico. Inoltre, il modello può essere abbinato angiogenici modulante sostanze, che evidenzia il suo potenziale nello studio dell'angiogenesi con una prospettiva in vivo .
Introduzione
L'iride, insieme con il corpo ciliare e coroide, comprende dell'uvea, che è il tessuto più vascolarizzato dell'occhio. Sistema vascolare Iris è essenziale nel mantenimento dell'omeostasi nell'alloggiamento anteriore dell'occhio. A seguito di abbondanti connessioni anastomotiche tra le arterie e le vene, i vasi sanguigni di iris fornire nutrienti e apporto di ossigeno non solo per l'iride stessa, ma per l'intero segmento anteriore dell' occhio1.
La formazione di nuovi vasi sanguigni, o l'angiogenesi da quelle pre-esistenti, è fondamentale nei processi fisiologici, quali sviluppo e2di guarigione della ferita. L'angiogenesi è finemente regolata da una moltitudine di fattori canoniche, come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno (PAI), così come molteplici fattori infiammatori e uno squilibrio di questi fattori può portare a patologica l'angiogenesi3.
Nell'occhio, la neovascolarizzazione è la causa di malattie avvistare-minaccioso, come retinopatia diabetica proliferative (PDR) e glaucoma neovascolare (NVG). In queste malattie oculari, la neovascolarizzazione focale si trova comunemente in tessuto retinico, ma lo squilibrio in infiammatorie e fattori angiogenici in entrambi i posteriori ed anteriori chambers oculare dell'occhio è stato associato con rubeosis iridis, il termine clinico per iris neoangiogenesi patologica4. Queste patologie indicano la capacità dell'adulto iride a subire l'angiogenesi. Nei topi, sistema vascolare oculare è immaturo dopo la nascita e continua maturazione post-partum. Questa peculiarità di sviluppo viene sfruttata nel modello del topo di retinopatia indotta da ossigeno, un modello che imita molto attentamente le condizioni cliniche della retinopatia della prematurità5. Inoltre, l'angiogenesi e l'infiammazione gioca un ruolo fondamentale nella guarigione meccanismi6e cicatrizzazione stessa è stata associata con l'angiogenesi modelli7.
In questo studio, descriviamo un modello del neovascularization dell'iride indotta da puntura. Uveale forature vengono eseguite nei pressi del limite esterno del limbus, che indurre il neovascularization dell'iride attivando il sistema di guarigione della ferita. Grazie alla trasparenza della cornea, sistema vascolare iride può essere analizzato facilmente in vivo di metodi non invasivi. Forato occhi presentano un aumento del letto vascolare nell'iride, che è stato associato con un aumento dell'attivazione del plasminogeno e indicatori infiammatori8. Il modello presentato ha un grande potenziale come un nuovo strumento per studiare l'angiogenesi e angiogenici composti di screening e permette la visualizzazione diretta in vivo dei processi angiogenici.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Cuccioli di topo BALB/c di entrambi i sessi sono stati utilizzati secondo l'istruzione per l'uso degli animali in oftalmologica e Vision Research, e i protocolli sono stati approvati dal comitato di Stoccolma per la ricerca etica animale. Topi sono stati alloggiati in cucciolate, insieme a madre durante l'allattamento, con un ciclo giorno/notte di 12 h, libero accesso a cibo e acqua e monitorati giornalmente.
Nota: Per la procedura chirurgica, topi sono stati tenuti sotto anestesia con isoflurano volatile. Pomate oculari sono sconsigliati durante procedure oculari, come potrebbero interferire con i trattamenti e sostanze utilizzate. Se necessario, per evitare che dell'occhio secco, può essere applicata una goccia di soluzione salina normale sterile. Anche se uveal punture sono auto-guarigione, cura è stata presa durante uveale forature per garantire la sterilità con strumenti chirurgici. Trattamento post-chirurgico incluso idratazione con soluzione salina normale per via sottocutanea e analgesia con somministrazione topica oculare del cloridrato del tetracaine. I cuccioli hanno permesso di recuperare in decubito sternale su un rilievo di riscaldamento prima di essere restituito alla madre durante allattamento, in una gabbia pulita. Cucciolate erano tenute con la stessa madre di professione d'infermiera per evitare lo stress.
1. anestesia
- Preparare la camera di induzione di anestesia, per somministrare anestetico isoflurano e garantire che una maschera di piccolo topo è anche accoppiata.
Nota: Eseguire esperimenti su animali tutti d'accordo con tutti i permessi etici applicabili. - Riempire la camera di induzione con 3-4% isoflurane volatili nell'aria atmosferica.
Nota: Diverse sostanze anestetiche diversa isoflurane possono essere utilizzate, secondo etici permessi. Procedure di anestetiche volatile devono essere eseguite su un cappuccio ventilato panca o fumi. - Posizionare un cucciolo di topo BALB/c di postnatale (P) 12.5-giorno-vecchio nella camera di induzione. Confermare che l'apparato di anestesia è pronto a consegnare isoflurano alla camera di induzione.
Nota: Mouse cuccioli sono fragili e meglio gestito per la collottola. Tenere i cuccioli insieme come una cucciolata o con madre durante l'allattamento per evitare lo stress. - Consentire il cucciolo essere completamente anestetizzato.
- Delicatamente, ritirare il cucciolo di topo per la collottola.
Nota: Tenere la camera di induzione chiusa a tutte le volte per induzione sicuro e stabile. - Trasferire il mouse alla maschera del roditore. Assicurarsi di passare il flusso di anestetico dal vano di induzione alla maschera quando si sposta il mouse.
- Eseguire un pizzico di punta per confermare l'anestesia.
2. procedura sotto stereoscopio chirurgico di puntura
- Posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale. Confermare che la maschera è ben posizionata, quindi l'occhio del mouse è nel campo di vista dello stereoscopio.
- Ruotare delicatamente la testa del mouse così l'occhio è rivolto verso lo stereoscopio.
Nota: Chiara messa a fuoco dell'occhio dovrebbe essere realizzato sotto lo stereoscopio. Per il posizionamento, è raccomandato un ingrandimento di 16x, mentre 40 X deve essere utilizzato per eseguire la procedura chirurgica. Se permessi etici lo consentono, tagliare la punta dei baffi può facilitare la visualizzazione dell'occhio. - Utilizzando piccolo legatura forcipe, sporgono attentamente occhio di pup applicando una pressione al ribasso per le palpebre dorsale e ventrale per l'occhio.
- Mantenere una stretta gentile ma ferma della palpebra di pup, con piccole pinze.
Nota: È consigliabile eseguire la protrusione dell'occhio ed il coperchio con la mano non dominante, come la mano dominante deve eseguire la procedura di puntura. - Utilizzare lo stereoscopio per individuare il limbus cornea. Limbus BALB/c Albino possono essere facilmente identificati dal plesso vascolare circolare posteriore alla cornea.
- Con un ago smussato 0,25 mm diametro (30 G), è necessario eseguire una piccola puntura uveal, vicino al limite di limbal posteriore del uvea. Usare solo la punta dell'ago, e non più di metà lo smusso (equivalente a 0,5 mm), puntura dell'uvea. Se eseguito correttamente, le punture uveale sono auto-sigillanti, eppure l'iniezione intraoculare di sostanze di studio possa essere somministrato attraverso la stessa ferita di puntura.
Nota: Se vissuto con anatomia oculare del mouse, la puntura uveal viene eseguita tra il corpo ciliare e ora serrata. Deve prestare attenzione durante l'esecuzione della puntura uveal per evitare la rottura della lente. - Eseguire la seconda puntura uveal nel lato opposto dell'occhio dal primo sito di puntura. Ottimizzare la distanza e la posizione delle punture; Considera 12 e 6 punture, con 12 essendo come dorsale come possibile.
- Ripetere la procedura di forature uveal ogni quattro giorni fino al P24.5. Prima di ogni successiva puntura uveal, monitorare lo stato degli animali prestando particolare attenzione alla presenza di cataratta traumatica a causa di danni lente durante la puntura uveal, o evidente diminuita pressione oculare. Obiettivo per l'esecuzione di forature ripetere alle stesse posizioni come precedente forature per gli effetti ottimali.
3. non invasiva in Vivo monitoraggio
- Prima della puntura o iniezioni ogni giorno sperimentale, anestetizzare il mouse come eseguita sopra.
- Con il mouse nella posizione di decubito laterale, sporgono delicatamente l'occhio.
- Concentrarsi sul sistema vascolare iris con lo stereoscopio chirurgico.
- Scattare una foto del vasculature iride con una telecamera montata lo stereoscopio chirurgico.
Nota: Anche se non necessario, inducendo meiosi può essere utile per normalizzare la zona di iris per animale. Prendere in considerazione etici permessi quando si seleziona un agente d'induzione meiosi. Messa a fuoco accurata del vasculature iris faciliterà ulteriormente analisi quantitativa. È consigliabile una magnitudo di 40x.
4. post-operatorio
- Rimuovere il pup BALB/c dalla maschera del roditore e trasferirlo delicatamente un Termoforo a strati con una stuoia chirurgica.
- Deporre una goccia di soluzione di 1% tetracaina occhi forati.
Nota: Altre soluzioni analgesici possono essere utilizzati, secondo etici permessi. - Idratare l'animale con un'iniezione sottocutanea di 200 µ l di soluzione salina normale sterile.
- Tornare il cucciolo alla madre durante allattamento in una gabbia pulita del mouse.
- Monitorare il processo di recupero. Il cucciolo dovrebbe essere in grado di deambulate e tornare alla lettiera.
5. occhio Enucleation
- Eutanasia animale di dislocazione cervicale. Per una migliore visualizzazione della procedura, eseguire enucleazione e dissezione sotto uno stereoscopio.
Nota: Eutanasia diverse procedure possono essere utilizzate. Si raccomanda di attenersi rigorosamente alle etici permessi. - Separare le palpebre per migliorare l'esposizione all'occhio.
- Fare un piccolo taglio (circa 0,5 cm) vicino canthus dei coperchi dell'occhio con le forbici curve occhio di Bonn.
- Utilizzare lo spazio periocular esposta per inserire micro forcipe legatura dietro (sotto) il mondo nell'orbita.
- Afferrare il tessuto che circonda l'occhio e tirare delicatamente verso l'alto. Evitare reggendo il bulbo oculare, usare i tessuti circostanti più vicino per lo zoccolo dell'occhio.
- Inserire le forbici curve di Bonn occhio dietro il globo oculare nell'orbita.
- Tagliare i tessuti circostanti fino a quando l'occhio è rilasciato dalla presa di corrente.
Nota: Questa tecnica di dissezione mantiene anatomia dell'occhio e successiva analisi di benefici. - Procedere alla rimozione del tessuto estraneo dall'occhio. La rimozione del tessuto estraneo può essere eseguita dopo la correzione, se si preferisce.
Nota: Topi BALB/c sono melanina carente, di conseguenza, per aumentare il contrasto, uno sfondo scuro è consigliato per facilitare la procedura di dissezione. - Brevemente sciacquare l'intero-occhio in una capsula Petri riempito con soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).
- Trasferire l'occhio in una provetta 2 mL contenente 1,5 mL di soluzione di formalina tamponata 4%.
- Difficoltà l'occhio per 6 ore a temperatura ambiente.
Nota: Fissaggio conferisce la rigidità del tessuto e facilita la dissezione dell'iride. Tempo di fissaggio deve essere testato e regolato per diverse applicazioni.
6. Iris dissezione procedura sotto stereoscopio
- Rimuovere la soluzione fissante dal tubo con una pipetta di Pasteur plastica 1,5 mL (o simili) e sciacquare l'occhio tre volte con PBS fresco.
- Posto l'occhio fisso in una liscia superficie asciutta (stand di dissezione) con camera anteriore rivolto verso l'alto.
- Con un ago 30g smussato, eseguire un punto di ingresso posteriore al limbus.
- Tenendo il segmento anteriore con piccolo legatura forcipe, inserire un suggerimento di Forbici rette Clayman-Allerød nell'apertura creata in precedenza.
Nota: Si consiglia di controllare il forcipe con la mano non dominante e la forbice con il dominante. - Durante la rotazione dell'occhio con il forcipe legatura, tagliare intorno al limbus per rimuovere il segmento posteriore dell'occhio.
Nota: Eseguire i tagli parziale consentirà la punta interna delle forbici per continuare nel tessuto e notevolmente facilita il processo. - Posizionare il segmento anteriore rivolta verso il basso, esponendo la lente.
- Rimuovere attentamente l'obiettivo afferrandolo con piccole pinze e tirando verso l'alto.
Nota: Un ago smussato può essere utilizzato per puntura e tirare la lente. - Posizionare il segmento anteriore con la cornea rivolto verso il basso e il taglio perpendicolare al campo di vista.
- Afferrare delicatamente il tessuto posteriore al corpo ciliare con le piccole pinze di legature.
- Con Forbici rette Clayman-Allerød, procedere a tagliare solo anteriore al corpo ciliare per rimuovere il trabecolato e isolare l'iride. Verificare che sia stato rimosso il trabecolato; l'iride dovrebbe muoversi all'interno della cornea.
- Trasferire con cautela l'oculare anteriore con le piccole pinze legature, che tiene la cornea, di una piastra a 96 pozzetti contenenti 200 µ l di PBS.
- Continuare a tenere la cornea nel pozzo e sezionare l'iride sciacquando con PBS con una pipetta.
Nota: Se l'iride rimane aderente alla cornea, alcuni trabecolato potrebbe essere presente e la smussatura di un ago 30g utilizzabile per aiutare spostando l'iride. - Rimuovere la cornea dal 96-well con le piccole pinze di legature e mantenere l'iride isolato nel pozzo per ulteriore analisi.
- Conservare i campioni digalleggiante iris a 4 ° C.
Nota: Pur essendo fisso, stoccaggio a lungo termine dei campioni digalleggiante iris non è raccomandato.
7. possibili letture sperimentali
- Per visualizzare i vasi sanguigni nelle iridi dissecate, utilizzare digalleggiante intero-monta immunohistochemistry, metodi per gli indicatori quali la molecola di adesione delle cellule endoteliali della piastrina (PECAM) -1 di colorazione o isolectin B4. In alternativa, è possibile utilizzare aspersione del corpo intero con la macchiatura vascolare, quali destrani con etichetta fluorescente ad alto peso molecolare.
- Utilizzare in vivo non invasiva immagini per eseguire in silico piatto-montaggio e quantificare il sistema vascolare completo iris con software di imaging appropriato.
Nota: Sistema vascolare può essere quantificato sia in vivo che in vitro, mediante densitometria o con sistema vascolare analisi software9. - Elaborare l'intero bulbo oculare per acidi nucleici ed estrazione di proteine, seguita da metodi di PCR o immunoblotting, per eseguire l'analisi molecolare degli occhi forati.
Nota: L'analisi molecolare dei tessuti migliore viene eseguita con il tessuto non fissa, ma la dissezione dell'iride non fissa è estremamente impegnativa e l'uso dell'occhio intero ha reso risultati statisticamente significativi in precedenti studi8.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Cuccioli di topo BALB/c Albino alle p 12.5 sono stati sottoposti a forature uveale, ripetute ogni quarto giorno (sperimentale giorno 0, 4, 8, 12), fino al P24.5. A P27.5, topi sono stati eutanasizzati e iridi attentamente sezionato (sperimentale giorno 15). Foto degli occhi del mouse sono state scattate con una videocamera fissata ad uno stereoscopio chirurgico prima di ogni serie di puntura in ogni giorno sperimentale per valutare la valutazione non invasiva della risposta vascolare iris...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Nel presente protocollo, è presentato un nuovo metodo per l'induzione della risposta vascolare iris dalla puntura uveal. La puntura innesca meccanismi di guarigione della ferita e promuove le risposte vascolari nei iris10,11. Questo è in accordo con patologie oculari, quali PDR e NVG, dove risposte angiogeniche esacerbato dalla retina nel segmento posteriore dell'occhio culminano con lo stato clinico di rubeosis iridis, una maggiore vascolarizzazione dell'iride
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Linnea Tankred e Diana Rydholm per la zootecnia.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Forbici per gli occhi di Bonn | Bausch & Lomb | 23060 | |
| Clayman-Vannas forbici curve | Bausch & Lomb | E3383 C | |
| Clayman-Vannas forbici dritte | Bausch & Lomb | E3383 S | |
| Adattatore obiettivo per fotocamera | Realizzato a mano | N/A | O qualsiasi sistema che consenta di adattare una fotocamera al microscopio |
| Termoforo 100-110 watt | Non applicabile | N/A | Disponibile nei negozi di animali domestici/veterinari |
| Ago smussato ipodermico 30g | KDM GmBH germania | 911914 | |
| Iphone 4S | Apple Non applicabile | O altro dispositivo di acquisizione di immagini ad alta risoluzione | |
| Isoflurano | Baxter | KDG 9623 | |
| Pinza da legatura McPherson | Bausch & Lomb | E1815 S | |
| Pinza per micro legatura | Bausch & Lomb | 63140 | |
| Minimo tetracaina cloridrato | Bausch & Lomb | N/A | 1 % (p/v) Collirio |
| Formalina tamponata neutra | Bioreagens | 0018-40 | |
| Soluzione salina normale | Fresenius Kabi | 210352 | 0,9 % (p/v) NaCl in acqua iniettabile |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS bilanciato e tamponato pH 7,4 |
| Piastra di Petri 10 cm | Starstedt | 83.3902 | |
| Piastra Petri 3 cm | Starstedt | 83.3900 | |
| Tubo a tenuta sicura 2,0 mL | Starstedt | 72.685.200 | O qualsiasi provetta stile eppendorf |
| Piastra TC a 96 pozzetti | Starstedt | 83.3924 | |
| Pipetta di trasferimento 3,5 mL | Starstedt | 86.1171 | O qualsiasi altra pipetta Pasteur |
| Unità per anestesia Univentor 400 | Univentor Limited | N/A | O regolatore di flusso equivalente con camera di induzione e maschera per anestesia volatile |
| Microscopio operatorio Wild M650 | Wild Heerbrugg | N/A | O altro stereoscopio chirurgico o di ingrandimento |
Riferimenti
- Morrison, J. C., Van Buskirk, E. M. Anterior collateral circulation in the primate eye. Ophthalmology. 90 (6), 707-715 (1983).
- Dreyfuss, J. L., Giordano, R. J., Regatieri, C. V. Ocular Angiogenesis. J Ophthalmol. 2015, 892043(2015).
- Breuss, J. M., Uhrin, P. VEGF-initiated angiogenesis and the uPA/uPAR system. Cell Adh Migr. 6 (6), 535-615 (2012).
- Rodrigues, G. B., et al. Neovascular glaucoma: a review. Int J Retina Vitreous. 2, 26(2016).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- DiPietro, L. A. Angiogenesis and wound repair: when enough is enough. J Leukocy Biol. 100 (5), 979-984 (2016).
- Eming, S., Brachvogel, B., Odorisio, T., Koch, M. Regulation of angiogenesis: Wound healing as a model. Prog Histochem Cytoc. 42 (3), 115-170 (2007).
- Beaujean, O., Locri, F., Aronsson, M., Kvanta, A., André, H. A novel in vivo model of puncture-induced iris neovascularization. PloS One. 12 (6), e0180235(2017).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A Computational Tool for Quantitative Analysis of Vascular Networks. PloS One. 6 (11), (2011).
- Dorrell, M., Uusitalo-Jarvinen, H., Aguilar, E., Friedlander, M. Ocular neovascularization: basic mechanisms and therapeutic advances. Surv Ophthalmol. 52 Suppl 1, S3-S19 (2007).
- Kvanta, A. Ocular angiogenesis: the role of growth factors. Acta Ophthalmol. 84 (3), 282-288 (2006).
- Salman, A. G. Intrasilicone Bevacizumab Injection for Iris Neovascularization after Vitrectomy for Proliferative Diabetic Retinopathy. Ophthalmic Res. 49 (1), 20-24 (2013).
- Jeong, Y. C., Hwang, Y. H. Etiology and Features of Eyes with Rubeosis Iridis among Korean Patients: A Population-Based Single Center Study. PloS One. 11 (8), e0160662(2016).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Stefansson, E., Landers, M. B., Wolbarsht, M. L., Klintworth, G. K. Neovascularization of the Iris - an Experimental-Model in Cats. Invest Ophth Vis Sci. 25 (3), 361-364 (1984).
- Nork, T. M., Tso, M., Duvall, J., Hayreh, S. S. Cellular Mechanisms of Iris Neovascularization Secondary to Retinal Vein Occlusion. Arch Ophthalmol-Chic. 107 (4), 581-586 (1989).
- Hjelmeland, L. M., Stewart, M. W., Li, J. W., Toth, C. A., Burns, M. S., Landers, M. B. An Experimental-Model of Ectropion Uveae and Iris Neovascularization in the Cat. Invest Ophth Vis Sci. 33 (5), 1796-1803 (1992).
- Tolentino, M. J., Miller, J. W., Gragoudas, E. S., Chatzistefanou, K., Ferrara, N., Adamis, A. P. Vascular endothelial growth factor is sufficient to produce iris neovascularization and neovascular glaucoma in a nonhuman primate. Arch Ophthalmol-Chic. 114 (8), 964-970 (1996).
- Paula, J. S., et al. Rabbit Rubeosis Iridis Induced by Intravitreal Latex-derived Angiogenic Fraction. Curr Eye Res. 36 (9), 857-859 (2011).
- Takei, A., Ekström, M., et al. Gene Transfer of Prolyl Hydroxylase Domain 2 Inhibits Hypoxia-inducible Angiogenesis in a Model of Choroidal Neovascularization. Sci Rep. 7, 42546(2017).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
