Articolo metodologico

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

DOI:

10.3791/57402

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18 aprile 2018

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1Public Health Research Institute, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

Abstract

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La tubercolosi è ancora delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Miglioramenti a terapie farmacologiche esistenti e lo sviluppo di approcci terapeutici sono urgentemente necessari. La capacità di dosata TB farmaci per raggiungere e sterilizzare i batteri all'interno di aree necrotiche scarsamente vascolarizzato (caseum) di granulomi polmonari è cruciale per un riuscito intervento terapeutico. I regimi terapeutici efficaci devono pertanto contenere farmaci con proprietà di penetrazione caseum favorevole. Attuali metodi di LC/MS per quantificare i livelli di farmaco nei tessuti biologici hanno limitato la capacità di risoluzione spaziale, rende difficile determinare con precisione le concentrazioni nella droga assoluta all'interno di piccoli compartimenti come quelle che si trovano all'interno granulomi necrotici. Qui presentiamo un protocollo che unisce la microdissezione laser (LCM) delle regioni di tessuto patologico distinti con quantificazione di LC/MS. Questa tecnica fornisce quantificazione assoluta di farmaci all'interno del granuloma caseum, che circonda la lesione cellulare e tessuto polmonare uninvolved e, pertanto, con precisione determina se le concentrazioni battericide sono stati raggiunti. Oltre alla ricerca di tubercolosi, la tecnica ha molte applicazioni potenziali per risolta spazialmente quantificazione delle droghe in tessuti malati.

Introduzione

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La capacità di risolvere spazialmente e di quantificare i livelli della droga è un requisito essenziale per determinare se i farmaci antitubercolari raggiungono sottopopolazioni batteriche all'interno delle lesioni polmonari a sterilizzare le concentrazioni1. Di particolare importanza è determinante la penetrazione del farmaco nel nucleo necrotico della lesione (chiamato caseum), che in genere contiene il più alto numero di bacilli e può essere scarsamente accessibile ai farmaci a causa dell'assenza di vascolarizzazione.

Metodi tradizionali per valutare la penetrazione della lesione, che coinvolgono omogeneizzazione ....

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Protocollo

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Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, con l'approvazione del istituzionale Animal Care e uso Comitato dei NIAID (NIH), Bethesda, MD.

1. animali esperimenti e tessuto collezione

Questa sezione del protocollo descrive procedure animale e raccolta di campioni in condizioni di biosicurezza di livello 3 (BSL3). Protocolli dettagliati della tubercolosi del micobatterio aerosol infezione procedura gestione della droga e protocolli nei conigli sono stati descritti precedentemente

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Risultati

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Una panoramica dell'approccio LCM-LC/MS è illustrata nella Figura 1. Dopo la sterilizzazione il tessuto di irradiazione gamma, tutti i passaggi successivi (dal tessuto sezionamento in poi) si svolgono di fuori di condizioni BSL3. La figura 2 Mostra la lesione dalle sezioni di biopsia prima e dopo l'isolamento del tessuto di LCM. Aree necrotiche e cellulari delle lesioni TB possono essere facilmente identificate ed isolate mediant.......

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Discussione

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Risolto nello spazio di quantificazione delle droghe all'interno delle lesioni di TB polmonare è necessaria per determinare se esposizione al farmaco raggiunge concentrazioni sterilizzante a popolazioni batteriche risiedono gli scompartimenti differenti della lesione. Il metodo di LCM-LC/MS qui descritto consente la quantificazione assoluta delle droghe anti-TB all'interno tutti i compartimenti di lesione, tra cui il caseum ricchi di batteri, utilizzando sezioni di tessuto di solo 1-3 in totale. Omogeneizzazione dei tess.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Paul O'Brien, Marizel Mina e Isabella Freedman per gli esperimenti sugli animali, Jacquie Gonzalez e Danielle Weiner dal NIH/NIAID per aiuto con irradiazione gamma dei tessuti di coniglio prima del laser capture microdissection e Jansy Sarathy per manoscritto pensieri e consigli. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1174780) e strumentazione di NIH ha condiviso concedere 1S10OD018072. Ringraziamo Eliseo A. Eugenin per fornire accesso al microscopio Leica LMD 6500 e condivisione di competenze e consulenza. L'acquisto e il supporto continuo di, il 6500 LMD è stato finanziato dal grant The National Institute of....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Conigli bianchi della Nuova ZelandaCovanceN/A
HN878 Mycobacterium tuberculosisBEI ResourcesNR-13647
Ketathesia (Ketamina) 100 mg/mL C3NHenry Schein Animal Health56344
Anased (xilazina) 100 mg/mLHenry Schein Animal Health33198
Euthasol (pentobarbital sodico e fenitoina sodica) SoluzioneVirbac710101
acetonitrile (grado LC-MS)FisherA955-212
Metanolo (grado LC-MS)FisherA456-212
Acido formico (grado LC-MS)FisherA117-50
Acqua (grado LC-MS)FisherW6212
Provette PCR a tappo piatto da 0,2 mLCorning07-200-392
Telai in acciaio, membrana in PETLeica11505151
Premium Vetrini per microscopio smerigliatoFisher12-544-2
96 Piastra a pozzetti profondi 2,0 ml PP RBFisherNC0363259
Colonna Zorbax SB-C8 (4,6 x 50 mm; granulometria, 3,5 &; m)Agilent820631-001D
"Cerniera" Sacchetti per campioni con guarnizioneFisher01-816-1B
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Equipment
CM1850 criostatoLeicaFuori produzioneLeica CM1860 è il modello attuale
Sistema di microdissezione laser 6500Leicafuori produzioneLeica LMD 6 è il modello attuale
Agilent 1260 Infinity II HPLCAgilent
API 4000 QTRAP Spettrometro di massaSciex

Riferimenti

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  1. Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
  2. Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tu....

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Analisi LC MS MSquantificazione di farmacimisurazione dell etambutolosezionamento dei tessuticaseificazione del granulomarisoluzione spazialetessuto polmonare

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