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Articolo metodologico

Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

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DOI:

10.3791/57406

⸱

29 marzo 2018

 ,  , 
1Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Genetics and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Earle A. Chiles Research Institute, Robert W. Franz Cancer Center, Providence Portland Medical Center

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Abstract

Qui, presentiamo un protocollo di una pelle dell'orecchio dell'adulto intero-monta imaging tecnica per studiare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare tridimensionale completa e patterning, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare. L'analisi della periferiche strutture anatomiche del nervo e dei vasi sanguigni nei tessuti adulti fornisce alcuni spunti per la comprensione della funzionale neuro-vascolare cablaggio e degenerazione neuro-vascolare in condizioni patologiche come la guarigione della ferita. Come sistema modello altamente informativo, abbiamo concentrato i nostri studi sulla pelle dell'orecchio dell'adulto, che è facilmente accessibile per la dissezione. Il nostro protocollo semplice e riproducibile fornisce una rappresentazione accurata dei componenti cellulari della pelle intera, come i nervi periferici (assoni sensoriali, simpatici assoni e le cellule di Schwann), vasi sanguigni (cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari ) e cellule infiammatorie. Crediamo che questo protocollo spianerà la strada per studiare le anomalie morfologiche in nervi periferici e dei vasi sanguigni così come l'infiammazione della pelle dell'orecchio dell'adulto sotto diverse condizioni patologiche.

Introduzione

Pelle è composto da tre strati: l'epidermide, derma e ipoderma. È stato utilizzato come sistema modello per studiare il mantenimento delle cellule staminali, la differenziazione e la morfogenesi in sviluppo come pure la rigenerazione, tumorigenesi e infiammazione in adulto. Pelle è riccamente vascolarizzata ed innervata tale che lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sistema vascolare è ben coordinato.

Precedentemente abbiamo dimostrato una tecnica di imaging intero-monta embrionale della pelle con l'etichettatura più per studiare i nervi periferici intatti e vasi sanguigni, compresi i loro componenti cellulari1,2,3, 4: assoni sensoriali, simpatici assoni, cellule in nervi Schwann, cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) nei vasi sanguigni. Durante il processo di angiogenesi, una rete capillare primaria subisce intensivo rimodellamento vascolare e si sviluppa in una rete gerarchica di ramificazione vascolare. In sviluppo derma/ipoderma, arterie ramificano al fianco di vene e nervi sensoriali periferici quindi formano adiacenti alle arterie. Dopo la rete vascolare gerarchica è completamente ricoperta di VSMCs, nervi simpatici si estendono lungo e innervano i vasi sanguigni di grande diametro1,5,6. Nonostante il significato in stretta associazione tra i sistemi nervosi e vascolari in via di sviluppo, è stata una questione importante per affrontare ciò che accade alle reti neuro-vascolare in varie situazioni patologiche negli adulti. La formazione immagine tridimensionale ad alta risoluzione è necessaria apprezzare la patogenesi, insieme a morfogenesi di ramificazione anatomicamente riconoscibile e patterning.

Morfogenesi neuronale e vascolare nella pelle del topo adulto è comunemente analizzata macchiando tessuto sezione. Altri studi hanno utilizzato intero-monta la formazione immagine della pelle per visualizzare i nervi periferici e vasi sanguigni, oltre ai follicoli piliferi, ghiandole sebacee e arrector pili muscoli7,8,9. Tuttavia, lo spessore della pelle adulta ha reso difficile analizzare la pelle nel corso di tutta la sua profondità.

Nello studio presente, abbiamo sviluppato un romanzo imaging ad alta risoluzione di intero-monta della pelle dell'orecchio dell'adulto per vincere queste sfide. Pelle dell'orecchio è facilmente accessibile per la dissezione e la formazione immagine intero-monta successiva della pelle nel corso di tutta la sua profondità. Così, è un metodo semplice e altamente riproducibile che possa essere applicato per confrontare l'architettura tridimensionale dei sistemi nervosi e vascolari periferici nella pelle, con misurazioni di quantificazione completa. Abbiamo dimostrato che l'allineamento dei nervi periferici sensoriali e simpatici con i vasi sanguigni di grande diametro è conservato nella pelle adulta. L'obiettivo del presente protocollo è quello di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare in modelli di topo adulto in varie condizioni quali l'infiammazione e rigenerazione.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti in questa sezione sono stati eseguiti sotto approvazione dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI) Animal Care e Comitato di uso.

1. adulto Mouse orecchio pelle collezione

  1. Eutanasia di topi adulti tramite l'esposizione di anidride carbonica (CO2) in una camera chiusa e quindi confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale.
    Nota: L'esperimento segue la Guida di riferimento di National Institutes of Health (NIH) per il metodo di eutanasia.
  2. Sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in un 35 x 10 mm2 capsula di Petri contenente 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS). Brevemente tagliare i capelli con le forbici.
  3. Sbucciare la pelle posteriore e anteriore pelle distanza attentamente dalla cartilagine intermedio.
    Nota: Cartilagine si attacca alla pelle anteriore.
  4. Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle separatamente a un 24 ben piastra contenente 1 mL di ghiacciata fresca 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) per pozzetto. Appiattire la pelle anteriore e posteriore a 4% PFA.
  5. Fissare la pelle anteriore e posteriore con cartilagine a 4 ° C per 1 h.
  6. Lavare la pelle anteriore e posteriore 3 volte per 5 min in 1 mL di PBS con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
  7. Trasferire la pelle anteriore e posteriore con cartilagine alla parte inferiore di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Tagliare la regione della base, che è piegato e ha adiposo e connettivo. Staccare la cartilagine dalla pelle anteriore utilizzando una pinzetta curva.
  8. Dall'interno della pelle posteriore con Pinzette curve bene, togliere i peli, tessuti adiposi e tessuti connettivi. Mantenere la pelle umida con PBS.

2. la macchiatura di Immunohistochemical intero-monta della pelle dell'orecchio del topo

Nota: Tutti gli esperimenti nelle sezioni che seguono sono stati eseguiti in conformità con le direttive di sicurezza di laboratorio NIH.

  1. Preparare il tampone di bloccaggio. Siero di capra filtro 10% calore inattivato (Villa) diluito in PBS con 0,2% triton tampone bloccante X-100 (TX-100), o 10% di siero di asino (DS) diluito in PBS con 0,2% tampone bloccante TX-100, utilizzando un filtro da 0,45 µm.
  2. Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle a un 24 ben piastra contenente 1 mL di tampone di bloccaggio Villa 10% o 10% tampone bloccante di DS per pozzetto. Incubare la pelle per 30 min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
  3. Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo gli anticorpi primari (Tabella materiali) in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS).
    Nota: Intero-mout l'analisi di immunohistochemical della pelle dell'orecchio dell'adulto con gli anticorpi di classe di neurone-specific marcatore pan-neuronale III β-tubulina (Tuj1, monocloncal mouse o IgG policlonale IgG2a coniglio, diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2 µ g/mL), molecola di adesione Pan-endothelial delle cellule marcatore della piastrina delle cellule endoteliali 1 (PECAM-1, criceto monoclonale IgG, diluizione di 1: 300 alla concentrazione finale di 3,3 µ g/mL), proteina di base del fodero di myelin marcatore della mielina (MBP, coniglio IgG policlonale, diluizione 1: 200 al concentrazione finale di 5 µ g/mL) e indicatore infiammatorio delle cellule mieloidi CD11b (Rat monoclonali IgG2b, 01:50 diluizione alla concentrazione finale di 20 µ g/mL) è stata indicata nella Figura 1 e Figura 2. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 per actina di muscolo liscio α marcatore di muscolo liscio vascolare delle cellule (αSMA) insieme con gli anticorpi secondari (2,6). Gli anticorpi primari testati da noi stessi sono stati elencati nella Tabella materiali. Gli anticorpi primari multipli derivati da specie diverse possono essere mescolati contemporaneamente.
  4. Trasferire la pelle anteriore e posteriore al nuovo pozzo contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi primari. Incubare la pelle con miscelazione delicata su un mixer a 4 ° C durante la notte.
  5. Il giorno seguente, trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 o aspirare il tampone bloccante contenente anticorpi primari. Aggiungere 1 mL di o 2% Villa diluito in PBS con tampone di lavaggio di TX-100 0,2% o 2% DS diluito in PBS con tampone di lavaggio di 0,2% TX-100. Lavare la pelle con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
  6. Preparare la soluzione di anticorpo secondario (Tabella materiali). Diluire anticorpi secondari in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS) e filtro sul blocco buffer contenente anticorpi secondari attraverso una siringa filtro 0,22 µm polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana collegato ad una siringa da 1 mL.
    Nota: Alexa 488 o anti-coniglio di capra 633-coniugato IgG (H + L) o mouse IgG2a per Tuj1, del anti-criceto capra Alexa 647-coniugato IgG (H + L) per il anti-coniglio di capra PECAM-1, Alexa 488-coniugato IgG (H + L) per MBP, e ratto Alexa 594-coniugato IgG (H + L) per CD11b sono stati utilizzati con diluizione di 1: 250 alla concentrazione finale di 8 µ g/mL. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 αSMA (diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2-3 µ g/mL) in combinazione con questi anticorpi secondari.
  7. Centrifugare la soluzione a 13.000 x g per 10 min rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari da tampone bloccante.
    Nota: Possono essere miscelati simultaneamente diversi anticorpi secondari coniugati fluorescenti derivati da specie diverse.
  8. Trasferire la pelle anteriore e posteriore ben contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi secondari. Avvolgere la piastra ben 24 in foglio di alluminio per evitare la luce e incubare la pelle per 1 h con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
  9. Trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 oppure aspirare la soluzione di anticorpo secondario di dispensare completamente. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di Villa 2% o 2% tampone di lavaggio DS.
  10. Avvolgere la piastra ben 24 in un foglio di alluminio e lavare con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.

3. montaggio la pelle dell'orecchio sulla diapositiva

  1. Posizionare la pelle sul fondo di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Rimuovere con cura i peli, tessuti adiposi, tessuti connettivi, polveri e fibre dall'interno della pelle utilizzando una pinzetta curva sotto stereomicroscopio con scarsa illuminazione per ridurre al minimo fotografica ampia candeggio. Mantenere la pelle umida con PBS.
  2. Trasferire la pelle in un vetrino da microscopio adesivo usando il forcipe. Posizionare la pelle anteriore e posteriore con l'interno rivolto verso l'alto sulla diapositiva. Appiattire la pelle usando il forcipe.
  3. Montare la pelle in un mezzo liquido anti-dissolvenza montaggio per evitare il photobleaching e preservare i segnali fluorescenti. Assicurarsi che nessun bolle di aria sono su o intorno alla pelle.
  4. Coprire con vetrino coprioggetto sui campioni di pelle attentamente e memorizzare le diapositive di esempio pelle montato nel buia durante la notte a temperatura ambiente per consentire che il supporto di montaggio ottiene costante. Sigillare il coprioggetto alla diapositiva con smalto e conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.

4. microscopio confocale

  1. Impostare il laser appropriato per fluorofori. Un microscopio confocale con tre sorgenti laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm e HeNe 633 nm) viene utilizzato in questo esperimento.
  2. Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale, che eccita contemporaneamente campioni triple-macchiato, per evitare e ridurre eventuali sovrapposizioni.
    Nota: Le immagini saranno prese in modo sequenziale utilizzando la modalità di scansione sequenziale.
  3. Immagine sotto un obiettivo 10x. Utilizzare lo strumento di analisi delle mattonelle per acquisire la pelle tutto l'orecchio. Impostare Z-stack e assicurarsi che la posizione z copre l'intero spessore della pelle dell'orecchio.

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Risultati

Pelle di topo adulto posteriore dell'orecchio (Figura 1A) e pelle anteriore dell'orecchio (Figura 1B) immunostained con anticorpi anti-αSMA (rosso), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (blu). Pelle posteriore era immunostained per studiare neuro-immunitario distribuzione utilizzando anticorpi anti-CD11b (rosso) e MBP (verde), insieme a Tuj1 (blu) (Figura 2A). Distribuzione di CD11b+ cellule infiammator...

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Discussione

Questo protocollo descrive l'intero-monta immunonohistochemical imaging della pelle dell'orecchio dell'adulto per l'analisi delle strutture neuro-vascolari e la distribuzione delle cellule immuni. Crediamo che questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per i ricercatori a studiare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di vasi sanguigni e nervi periferici, così come la distribuzione tridimensionale di componenti della pelle tra cui capelli e cellule del sistema immunitario follicoli. I risultati dell'i...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo K. Gill per la gestione del laboratorio e supporto tecnico, J. Hawkins e il personale del National Institutes of Health (NIH) costruzione impianto 50 animali per l'assistenza con cura del mouse e R. Reed e F. Boi per l'assistenza amministrativa. Grazie anche a Motegi S. e M. Udey per loro orecchio pelle dissezione protocollo N. Burns per aiuto editoriale e membri del laboratorio di cellule staminali e biologia Neuro-vascolare per aiuto tecnico e riflessivo discussione di condivisione. T. Yamazaki è stata sostenuta dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) NIH-KAITOKU. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del cuore nazionale, polmone e sangue Institute (HL005702-11 al Y.M.)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 x soluzione salina tamponata con fosfatoKD MedicalRGE-3210PBS, senza Ca2+/Mg2+
Hank' s Soluzione salina bilanciataGibco14025-092HBSS, con Ca2+/Mg2+
16% ParaformaldeideMicroscopia elettronica Sciences15710PFA, fissativo, diluito in PBS
Triton X-100SigmaX100Detergente
Siero di capra normaleGibco16210064Componente del tampone bloccante/lavaggio
Normale siero d'asinoJackson Immuno research017-000-121Componente del tampone bloccante/lavaggio
Pinzetta fine curvaDumontRS-5047
Pinzetta curvaIntegra Miltex VantageV918-782, V918-784
Unità filtro 0,45 mmThermo Scientific157-0045Per filtrazione
Siringa da 1 mLCoviden8881501400Per filtrazione
Siringa filtro Unità 0,22 mmMillex-GVSLGVR04NLPer filtrazione
ProLong GoldThermo ScientificP36934Mezzo di montaggio anti-sbiadimento
Smalto per unghieMicroscopia elettronica Scienze72180Per
sigillatura Microscopio da dissezioneLeicaMZ95
Microscopio confocaleLeicaTCS SP5
Photoshop CC 2017Software di editorAdobe
Illustrator CC 2017Software di editorAdobe
Image JNIHSoftware di elaborazione delle immagini
Anticorpo anti-PECAM-1 (CD31) AnticorpoMilliporeMAB1398ZCriceto IgG, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31)BD Pharmingen553369IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300
Anti-αSMA coniugato con cy-3SigmaC6198IgG2a di topo, marcatore di cellule muscolari lisce vascolari, anticorpo 1:500
Anti-EphB1Santa Cruzsc-9319Policlonale di capra, marcatore di cellule endoteliali venose, 1:100
Anti-neuron-specific Classe III β-tubulina (Tuj1)AbcamAB18207Tuj1, IgG policlonali di coniglio, marcatore panassonale,
anticorpo anti-Tuj1CovanceMMS-435PIgG2a di topo, marcatore panassonale, anticorpo anti-MBP 1:500
AbcamAB40390IgG policlonali di coniglio, marcatore di mielinizzazione, 1:200
Anticorpo anti-tirosina idrossilasiChemiconAB152Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni simpatici, 1:500
Anticorpo anti-periferinaChemiconAB1530Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni periferici, 1:1000
Anticorpo anti-CD11bBio-RadMCA74GRat IgG2b, marcatore cellulare infiammatorio (macrofagi), 1:50
Anticorpo Anti-CD45Thermo Fisher Scientific14-0451-85Rat IgG2b kappa, marcatore di cellule pan-ematopoietiche, 1:500
Anticorpo Anti-CD3Bio-RadMCA1477TIgG1 di ratto, marcatore di cellule immunitarie, anticorpo 1:100
Anti-CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific14-0452IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule infiammatorie, anticorpo anti-GFP 1:200
Thermo Fisher ScientificA11122Policlonale di coniglio, 1:300
Anticorpo anti-GFPAbcamAb13970Policlonale di pollo, 1:500
Anti-946;-gal anticorpoCappel55976Policlonale di coniglio, 1:5000
Anticorpo anti-RFPAbcamAb62341Policlonale di coniglio, 1:300
IgG (H+L) anti-coniglio di capra Alexa 488Thermo Fisher ScientificA11034Anticorpo secondario policlonale di coniglio, 1:250
IgG (H+L) anti-criceto di capra Alexa 647Jackson Immuno research127-605-160Anticorpo secondario policlonale di criceto, 1:250
Capra anti-ratto IgG (H+L) Alexa 594Jackson Immuno research112-585-167Anticorpo secondario policlonale di ratto, 1:250
Capra anti-topo IgG2a Alexa 633Thermo Fisher ScientificA21136IgG2a di topo, 1:250
Graphics Graphics 1:500

Riferimenti

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