Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell'intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 - carboxy - 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)
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Articolo metodologico
Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) è un sistema di modello che è ampiamente usato per studiare la longevità e le vie dello sviluppo. Tali studi sono facilitati dalla trasparenza dell'animale, la capacità di avanti e indietro le analisi genetiche, la relativa facilità di generare proteine fluorescente contrassegnati e l'uso di coloranti fluorescenti che possono sia essere microiniettati in anticipo embrione o incorporati in suo cibo (e. coli ceppo OP50) per etichettare gli organelli cellulari (ad es. 9-diethylamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-one e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Qui, presentiamo l'uso di un colorante fluorescente pH sensibili che macchie intestinali lisosomi, fornendo una lettura visiva dei cambiamenti dinamici, fisiologici acidità lisosomiale in vermi vivi. Questo protocollo non misurare pH lisosomiale, ma piuttosto mira a stabilire un metodo affidabile di valutazione fisiologiche varianti pertinenti lysosomal acidità. cDCFDA è un cellulare-permeante composto che viene convertito il fluoroforo fluorescente 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) su idrolisi dalle esterasi intracellulari. Protonazione all'interno dei lisosomi trappole cDCF in questi organelli, dove si accumula. A causa del suo basso pKa di 4.8, questo colorante è stato utilizzato come un sensore di pH in lievito. Qui descriviamo l'uso di cDCFDA come integratore alimentare per valutare l'acidità dei lisosomi intestinali in elegans del c. Questa tecnica consente il rilevamento dei lisosomi alcalinizzante in animali vivi, e ha una vasta gamma di applicazioni sperimentali tra cui studi sull'invecchiamento, autophagy e biogenesi lisosomiale.
Introduzione
L'aspetto di aggregati proteici ampiamente è accettato per essere un marchio di garanzia di invecchiamento in cellule eucariotiche1,2,3e la formazione di cui è pensato per essere tra i piloti di principio di senescenza cellulare4 , 5 , 6 , 7. sta coltivando la prova che come cellule età, catabolismo proteico è alterato, portando ad un aumento di aggregazione proteica. Il crollo di proteolisi in cellule di invecchiamento comporta un danno dell'autofa....
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Protocollo
1. coloranti e lisosomi intestinali di immagine
- Piastre di coltura seme del nematode (NGM) con OP50
- Preparare piatti NGM secondo il protocollo raccomandato19 e lasciate asciugare per 2 giorni a temperatura ambiente le piastre chiuse.
- Inoculare i batteri OP50 in brodo di Luria brodo (LB) sterile e crescere in un'agitazione incubatore o bagnomaria a 37 ° C per 36 h o fino a quando il diametro esterno è compresa tra 0,2 e 0,4. Evitare l'uso di una coltura batterica con OD > 1 o OD < 0.2.
- Una volta piastre NGM sono asciutti, depositare una goccia (~ 30 µ l) di inoculo OP50 sul centro del pi....
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Risultati
cDCFDA macchie lysosomes in maniera dipendente dal pH, e il suo basso pKa e pronto assorbimento lisosomi rende un sensore di pH ideale21. cDCFDA intensità di colorazione è inversamente proporzionale al pH lisosomiale (cioè colorazione intensità aumenta con il diminuire del pH)18,22. cDCFDA segnali sono costantemente deboli nei lisosomi di animali trattati con clorochina, un inibitore dell'acidifica.......
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Discussione
Una varietà di eventi cellulari e molecolari contribuiscono all'invecchiamento, influenzato da tratti di storia di vita e fattori genetici. Nostro recente studio22 suggerisce che il ciclo riproduttivo svolge un ruolo importante nel controllare l'idoneità del soma attraverso la regolazione della dinamica di pH lisosomiale. Abbiamo mostrato che proteolisi lisosomiale-mediata sono promosso mentre gli animali si riproducono attivamente dal upregulation della trascrizione del v-atpasi, che a sua volta .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il centro di genetica di Caenorhabditis per i ceppi, le scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI) per il finanziamento. Vorremmo ringraziare Dr. Lizhen Chen (dipartimento di sistemi cellulari e anatomia, UT Salute San Antonio) per consentire l'utilizzo illimitato del suoi attrezzature di laboratorio per tutti gli esperimenti di c. elegans , nonché Exing Dr. Wang (direttore associato, Optical Imaging Facility UT Salute San Antonio) per assistenza con la microscopia confocale. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Myron Ignatius per fornire supporto e incoraggiamento per fa....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Ordina online all'https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carbossi-2',7'-diclorofluoresceina diacetato | ThermoFisher | C369 | Comunemente noto come cDCFDA |
| 9-dietilammino-5H-benzo(a)fenossazina-5-one e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipirrol-5-il-kappaN(1))metilidene]-2H-pirrolo-5-il-kappaN}-N-[2-(dimetilammino)etil]propanamidato)(difluoro)boro | ThermoFisher | L7528 | Comunemente noto come Lysotracker Microscopio |
| confocale rosso (ad es. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Scarica gratuitamente da https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Brodo in polvere | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Colesterolo in polvere | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodio azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Vetrini per microscopio | VWR | 48311-703 | |
| Vetrini | coprioggetti ThermoFisher | 3406 | |
| Agarosio | Sigma | A6013 | |
| Incubatore | |||
| Specchio o altra superficie |
Riferimenti
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C.
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Ristampe e permessi
